CN110093288A

CN110093288A - 一种改良水产养殖场水质的快速发酵复合益生菌调节剂

Info

Publication number: CN110093288A
Application number: CN201910357311.6A
Authority: CN
Inventors: 黄卫强; 包维臣; 郭建林
Original assignee: Inner Mongolia Sci Plus Biotech Co ltd
Current assignee: Inner Mongolia Sci Plus Biotech Co ltd
Priority date: 2019-04-29
Filing date: 2019-04-29
Publication date: 2019-08-06
Anticipated expiration: 2039-04-29
Also published as: CN110093288B

Abstract

本申请提供一种改良水产养殖场水质的快速发酵复合益生菌调节剂，所述快速发酵复合益生菌调节剂包括植物乳杆菌KT‑Lp9菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP4菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂和地衣芽孢杆菌BL‑08菌剂，所述快速发酵复合益生菌调节剂在水产养殖场快速发酵，调节水产养殖场水质，对养殖水体不产生二次污染，并且，对所述养殖的水产产品具有促进生长、降低死淘率的益生菌调节剂。

Description

一种改良水产养殖场水质的快速发酵复合益生菌调节剂

技术领域

本申请属于微生物制剂领域，特别涉及一种用于改良水产养殖场水质的快速发酵复合益生菌调节剂。

背景技术

随着我国水产养殖业的日益发展，相关的问题也逐渐浮现，包括水产养殖场水体污染致使亚硝酸盐、氨氮超标，养殖环境卫生状况差，水体有害菌和寄生虫超标，滥用提高水产生长速度的抗生素等药物造成药物残留危害人类健康等多种问题。近几年，一些规模化养殖场开始引入微生态制剂进行水质改良，但因所使用的微生态制剂中菌株单一、且菌株没有进行严格的基础科学实验评估，导致产品功能不稳定，且使用复杂，因此未得到很好的推广。目前申请公开的水产养殖场水质改良剂专利中，核心成分以化学物质和微生物为主。

例如，中国专利申请CN108033497A公开了“水质改良剂及其制备方法”，所述方法使用的水质改良剂包括腐植酸钠5-15份、表面活性剂3-8份、胺鲜酯3-8份、钾盐2-5份、增稠剂0.2-1份、水63-86.8份。该水质改良有一定的肥水作用，使用范围窄。

再如，中国专利申请CN103588274A公开了“一种水质改良剂”，所述水质改良剂由乙二胺四乙酸二钠、枸橼酸、过硫酸氢钾、聚合硫酸铁、植酸组成，该水质改良剂可能会对水体中的正常菌群造成影响。

再如，中国专利申请CN107739102A公开了“一种水产养殖的水质改良剂”，所述水质改良剂包括微生物菌种30-40％、植物混合物20-30％、生物生长促进剂5-10％和氨基酸2-5％、壳聚糖0.1-0.5％、余量为水，其中，所述微生物菌种包括沼泽红假单胞菌、枯草芽孢杆菌、反硝化细菌、地衣芽孢杆菌、产朊假丝酵母菌、产乳酸粪肠球菌、产乳酸屎肠球菌、侧孢芽孢杆菌、反硝化细菌、光合细菌和乳酸菌，该水质改良剂使用了大量的肠球菌，存在条件致病的风险。

再如，中国专利申请CN107555615A公开了“水产养殖场水质改良剂”，所述水产养殖场水质改良剂由下述物质混合而成：乳酸片球菌粉25-35％、解淀粉芽孢杆菌粉20-25％、短短芽孢杆菌粉25-30％、藻类生长促进剂10-15％及重金属吸附剂10-20％，该水产养殖场水质改良剂存在有一定的肥水作用，使用范围窄。

再如，中国专利申请CN108328750A公开了“一种水产养殖用水质改良剂及其制备方法”，所述水产养殖用水质改良剂包括乳酸杆菌5-10％、光合细菌5-10％、芽孢杆菌5-10％、红糖5-10％、活性炭10-20％、沸石粉25-35％、柠檬酸3-5％、碳酸氢钠2-5％和过氧化钙10-15％，该水产养殖场水质改良剂存加入了活性炭、沸石粉等物质，此类物质中含有大量杂菌，存在潜在的危害。

目前，市场上用于改善养殖场水质的微生态制剂基本均需要在专业系统的设备中进行发酵后使用，或者，不经发酵，将微生态制剂干粉溶解后直接泼洒，这就导致为改善养殖水质水产养殖场要么花费较大成本设置和操作专业发酵设备，要么损失微生态制剂的功效，尚不存在能够在水产养殖现场快速发酵的调节剂。同时在核心成分方面，目前市售产品多以1-2株菌株复合使用，鲜有多株乳酸菌复合的专利，由于所以单一菌株功能有限，因此，仅1-2株菌株复合使用其功能效果也比较有限。

发明内容

本申请的目的是提供一种能够在水产养殖场快速发酵，调节水产养殖场水质，对养殖水体不产生二次污染，并且，对所述养殖的水产产品具有促进生长、降低死淘率的益生菌调节剂。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种改良水产养殖场水质的快速发酵复合益生菌调节剂，所述快速发酵复合益生菌调节剂包括植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP4菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂和地衣芽孢杆菌BL-08菌剂，其中，基于所述快速发酵复合益生菌调节剂的总重量，植物乳杆菌KT-Lp9活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，植物乳杆菌C2活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，植物乳杆菌LP4活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，干酪乳杆菌zhang活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，地衣芽孢杆菌BL-08活菌数量≥1×10¹¹CFU/g。

本申请人发现，并不是所有的有益菌株都可以随意复合，如果复合不当，菌株间存在拮抗作用，反而会降低复合益生菌调节剂的作用效果。进一步地，本申请人发现，本申请提供的快速发酵复合益生菌调节剂各菌株之间具有协同作用，能够有效改善水产养殖场的水质，从而促进水产生长、降低水产死淘率。

本申请提供的快速发酵复合益生菌调节剂能够用于改善水产养殖场水质，从而改良养殖环境，使水产通过呼吸作用以及采食等过程将部分所述复合益生菌摄入水产体内，从而改善养殖水产的肠道菌群，促进水产生长，降低死淘率。同时，所述快速发酵复合益生菌调节剂还能够与水产养殖场水体中的污染物反应，分解和/或中和水体中的污染物，并将污染物分解为对水产生长有利的小分子物质，从而进一步改善水产养殖场水质，促进水产生长。

在一种可实现的方式中，所述快速发酵复合益生菌调节剂中活菌总数≥1×10⁸CFU/g；

本申请所用益生菌多为现有技术中公开的菌种，例如，所述植物乳杆菌KT-Lp9在中国专利CN107058158A中被公开，所述植物乳杆菌C2在中国专利CN108125902A中被公开，所述植物乳杆菌LP4在中国专利CN107937320A中被公开，所述干酪乳杆菌zhang在中国专利CN108522884A中被公开。

所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL-08，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.5687，保藏日期为：2011年12月31日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

所述植物乳杆菌KT-Lp9，已于2016年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.12950，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，该菌株分离自传统自然发酵酸牛奶乳中。具备优良的益生特性，研究表明该菌株具有良好的耐酸性、人工胃液、人工消化液耐受性、胆盐耐受性、在肠道有凝集作用(自凝集和它凝集)及抑制常见肠道致病菌生长特性，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，可改善机体内的微生态环境、预防和治疗高脂血症。

所述植物乳杆菌C2是2012年从四川省自然发酵的泡菜中分离并筛选出的一株具有优良益生特性的乳酸菌株，能够利用水体中的有机物快速产酸控制物料pH值，其中，可高产4-羟基苯乳酸等有机酸，具有优良的粪大肠菌群抑制能力。

所述植物乳杆菌LP4是从自然发酵的酸马奶样品中分离并筛选出的一株具有优良益生特性的乳酸菌株，在养殖场水体中能够利用水体中的有机物进行发酵，并且产酸迅速，其代谢产物能够抑制霉菌生长与繁殖并吸附降解真菌毒素。

所述干酪乳杆菌zhang是2001年分离自内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗草原上自然发酵酸马奶(Komiss)中的一株具有优良益生特性的干酪乳杆菌，该菌株具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够在人和动物肠道中定植并繁殖，改善肠道菌群，从而预防肠道致病菌感染。水产养殖场水体中存在大量水产粪便等污染物，这些污染物呈酸性，通常，益生菌在上述酸性环境中难以定殖，即使在养殖场圈舍中喷洒普通乳酸菌，普通的益生菌也难以成活，从而无法发挥功效，由于所述污染物大部分来源于养殖水产的肠道，因此，本实施例将所述快速发酵复合乳酸菌调节剂在模拟胃液、肠液等环境比实际水质环境酸性更强，普通益生菌更难以成活的环境中考察其定植能力，发现所述快速发酵复合益生菌调节剂中的益生菌及其代谢产物仍然能够良好生存，因此，本申请提供的快速发酵复合益生菌调节剂在实际水质中能够定植，从而发挥其作用。

本申请人发现，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL-08的代谢产物包括淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶，其中，淀粉酶可以分解水体中的淀粉和糖原等污染物，所述蛋白酶可以分解水体中的蛋白质肽链等污染物，所述纤维素酶可以分解水体中木质素等污染物，而以上污染物是养殖场水体中常见的污染物，所述污染物被上述酶分解后，生成的分解产物不会对水体造成二次污染，而且有利于水产生长。

本申请人发现，本申请提供的快速发酵复合益生菌调节剂能够改善水产养殖产品机体内的微生态环境，改良水产养殖环境，控制水体pH值，降低水体中氨氮、亚硝酸盐和硫化氢含量，控制水体中大肠菌群数和弧菌数，综合改善水质从而提高养殖水产的健康水平、提高水产生长性能、降低水产死淘率。

在一种可实现的方式中，所述快速发酵复合益生菌调节剂中，所述植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP4菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂与地衣芽孢杆菌BL-08菌剂的重量比为植物乳杆菌KT-Lp9菌剂的重量:植物乳杆菌C2菌剂的重量:植物乳杆菌LP4菌剂的重量:干酪乳杆菌zhang菌剂的重量:地衣芽孢杆菌BL-08菌剂的重量＝(2-4):(1-3):(1-3):(2-4):(2-4)。

进一步地，在所述快速发酵复合益生菌调节剂中，所述植物乳杆菌KT-Lp9、植物乳杆菌C2、植物乳杆菌LP4、干酪乳杆菌zhang、地衣芽孢杆菌BL-08菌剂的重量比为植物乳杆菌KT-Lp9菌剂的重量:植物乳杆菌C2菌剂的重量:植物乳杆菌LP4菌剂的重量:干酪乳杆菌zhang菌剂的重量:地衣芽孢杆菌BL-08菌剂的重量＝2:1:1:3:3。

可选地，所述快速发酵复合益生菌调节剂还可以包括营养型稀释载体，所述营养形稀释载体可以包括复合益生菌生长和繁殖所需的多种营养物质，例如，所述营养型稀释载体包括蔗糖、葡萄糖、酵母粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾和碳酸钙，其中，各组分的重量比可以为蔗糖:葡萄糖:酵母粉:柠檬酸钠:磷酸氢二钾:碳酸钙＝(3-8):(1-3):(3-9):(1-3):(1-3):(1-3)。

本申请的另一个目的是提供前述快速发酵复合益生菌调节剂的制备方法，所述方法包括：

步骤1，分别制备植物乳杆菌KT-Lp9、植物乳杆菌C2、植物乳杆菌LP4、干酪乳杆菌zhang和地衣芽孢杆菌BL-08的一级种子液；

步骤2，利用步骤1制得的一级种子液分别制备植物乳杆菌KT-Lp9、植物乳杆菌C2、植物乳杆菌LP4、干酪乳杆菌zhang和地衣芽孢杆菌BL-08的二级种子液；

步骤3，利用步骤2制得的二级种子液分别制备植物乳杆菌KT-Lp9、植物乳杆菌C2、植物乳杆菌LP4、干酪乳杆菌zhang和地衣芽孢杆菌BL-08的最终发酵液；

步骤4，利用步骤3制得的最终发酵液分别制备植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP4菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂和地衣芽孢杆菌BL-08菌剂；

步骤5，将步骤4制得的植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP4菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂和地衣芽孢杆菌BL-08菌剂复配，制得的所述快速发酵复合益生菌调节剂。

具体地，所述制备方法可以包括：

步骤1，分别取一环活化后的植物乳杆菌KT-Lp9、植物乳杆菌C2、植物乳杆菌LP4、干酪乳杆菌zhang和地衣芽孢杆菌BL-08的斜面菌体，分别接种至MRS培养基中培养得到五种一级种子液，其中，所述培养条件为温度33-37℃，转速50-100rpm，培养18-24h；

步骤2，将步骤1培养得到的一级种子液按接种量3％-10％(v/v)分别再次转接入MRS培养基进行二次活化得二级种子液，活化时间18-24h；

步骤3，将步骤2制得的二级种子液按照接种量3％-10％(v/v)分别接入到各自的发酵罐培养基中，得到植物乳杆菌KT-Lp9最终发酵液、植物乳杆菌C2最终发酵液、植物乳杆菌LP4最终发酵液、干酪乳杆菌zhang最终发酵液和地衣芽孢杆菌BL-08最终发酵液，其中，五株菌株最终发酵液中活菌数分别达到10¹⁰CFU/ml以上，所述发酵条件为：温度33-37℃，转速50-100rpm，通风量0.3-1L/min，发酵全程调节发酵液pH值保持5.6-6.2，发酵时间8-12小时，所用发酵罐培养基包括以下组分：蔗糖50-80g/L，酵母粉20-40g/L，大豆蛋白胨8-20g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5-2.0g/L，MnSO₄·5H₂O 0.08-0.12g/L，吐温-80 0.8-1.0g/L，余量为水，所述发酵罐培养基的pH＝7.0

步骤4，将步骤3制得的五种最终发酵液分别经5000-12000rpm，5-15min离心收集菌体，向经离心后的五种菌体中分别按照菌体与保护剂溶液重量比为菌体重量:保护剂重量＝1:(5-10)的比例向菌体中添加保护剂溶液，混匀获得菌悬液，将所述菌悬液冷冻干燥，分别得到植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP4菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂和地衣芽孢杆菌BL-08菌剂，其中，所述保护剂溶液包括以下组分：脱脂乳粉25-35g/L，脱盐乳清粉15-30g/L，工业海藻糖10-20g/L，维生素C 3-4g/L，卵磷脂0.04-0.08g/L，余量为蒸馏水；

步骤5，将所述植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP4、干酪乳杆菌zhang菌剂和地衣芽孢杆菌BL-08菌剂按比例进行混合。

可选地，所述方法还可以包括：向所述快速发酵复合益生菌调节剂中加入营养型稀释载体。其中，所述营养型稀释载体由多种复合益生菌快速正在繁殖所需的营养物质组成。

在一种可实现的方式中，所述营养型稀释载体包括复合益生菌生长和繁殖所需的多种营养物质，例如，所述营养型稀释载体包括蔗糖、葡萄糖、酵母粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾和碳酸钙，其中，各组分的重量比可以为蔗糖:葡萄糖:酵母粉:柠檬酸钠:磷酸氢二钾:碳酸钙＝(3-8):(1-3):(3-9):(1-3):(1-3):(1-3)。

在一种可实现的方式中，所述快速发酵复合益生菌调节剂还可以经粉末包装机进行分装，可选地，在每个分装包装中填充有氮气，每个个分装包装的规格可以为1kg/袋。

本申请的另一目的在于提供所述快速发酵复合益生菌调节剂用于改良水产养殖场水质的用途。

在一种可实现的方式中，使用清水将所述复合益生菌调节剂进行溶解后，装入密封容器中，密封常温快速发酵24小时后即可向水产养殖场的水体中泼洒，使用量可以为2升/亩。

可选地，所述快速发酵复合益生菌调节剂与清水的用量比为快速发酵复合益生菌调节剂的重量:清水的体积＝(1～1.5)g:(1.5～2)L，优选为1g:1.5L，其中，清水的温度为40℃以下。

本发明提供的改良水产养殖场水质的快速发酵复合益生菌调节剂仅需使用清水将所述快速发酵复合益生菌调节剂溶解，在密封容器中常温发酵24小时即可向养殖场水体中进行泼洒，使用量2升/亩，即可改善水产养殖场的水体环境，主要表现为：控制水体pH值，降低水体中氨氮、亚硝酸盐和硫化氢含量，控制水体大肠菌群数和弧菌数，综合改善水质进而提高养殖水产的健康水平，提高水产生长性能、降低水产死淘率。

本申请提供的改良水产养殖场水质的快速发酵复合益生菌调节剂中所用复合乳酸菌菌株与地衣芽孢杆菌相互协同作用，所述复合乳酸菌菌株与地衣芽孢杆菌的协同作用并非简单的菌株功能叠加，而是各原料组分的科学复配和提取，产生的效果远远超过各单一组份功能和效果的叠加，具有较好的先进性和实用性。

本申请提供的该快速发酵复合益生菌调节剂在水产养殖过程中使用，以养殖南美白对虾为例，实验组水体中氨氮、亚硝酸盐含量和硫化氢含量以及弧菌数和大肠菌群数显著低于对照组，实验组水产采食速度明显快于对照组，出售前(通常，养殖场在出售前测亩产量)实验组亩产量也明显高于对照组，同期出售前实验组死淘率明显低于对照组。

附图说明

图1示出实施例7中水体pH值检测结果；

图2示出实施例7中水体氨氮含量检测结果；

图3示出实施例7中水体亚硝酸盐含量检测结果；

图4示出实施例7中水体硫化氢含量检测结果；

图5示出实施例7中水体大肠菌群数检测结果；

图6示出实施例7中水体弧菌数检测结果；

图7示出实施例7中多批次同期成虾售出量；

图8示出实施例7中水产死淘率统计结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1高密度发酵菌株

步骤3，将步骤2制得的二级种子液按照接种量3％-10％(v/v)分别接入到各自的发酵罐培养基中，得到植物乳杆菌KT-Lp9最终发酵液、植物乳杆菌C2最终发酵液、植物乳杆菌LP4最终发酵液、干酪乳杆菌zhang最终发酵液和地衣芽孢杆菌BL-08最终发酵液，其中，五株菌株最终发酵液中活菌数分别达到10¹⁰CFU/ml以上，所述发酵条件为：温度33-37℃，转速50-100rpm，通风量0.3-1L/min，发酵全程调节发酵液pH值保持5.6-6.2，发酵时间8-12小时，所用发酵罐培养基包括以下组分：蔗糖50-80g/L，酵母粉20-40g/L，大豆蛋白胨8-20g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5-2.0g/L，MnSO₄·5H₂O 0.08-0.12g/L，吐温-800.8-1.0g/L，余量为水，所述发酵罐培养基的pH＝7.0

步骤4，将步骤3制得的五种最终发酵液分别经5000-12000rpm，5-15min离心收集菌体，向经离心后的五种菌体中分别按照菌体与保护剂溶液重量比为菌体重量:保护剂重量＝1:(5-10)的比例向菌体中添加保护剂溶液，混匀获得菌悬液，将所述菌悬液冷冻干燥，分别得到植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP4菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂和地衣芽孢杆菌BL-08菌剂，其中，所述保护剂溶液包括以下组分：脱脂乳粉25-35g/L，脱盐乳清粉15-30g/L，工业海藻糖10-20g/L，维生素C 3-4g/L，卵磷脂0.04-0.08g/L，余量为蒸馏水；植物乳杆菌KT-Lp9菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，植物乳杆菌C2菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，植物乳杆菌LP4菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，干酪乳杆菌zhang菌剂活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，地衣芽孢杆菌BL-08菌剂活菌数量≥1×10¹¹CFU/g。

实施例2改良水产养殖场水质的快速发酵复合益生菌调节剂的制备

步骤1’，将实施例2制得的植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP4、干酪乳杆菌zhang菌剂以及地衣芽孢杆菌BL-08菌剂按照重量比植物乳杆菌KT-Lp9菌剂的重量:植物乳杆菌C2菌剂的重量:植物乳杆菌LP4菌剂的重量:干酪乳杆菌zhang菌剂的重量:地衣芽孢杆菌BL-08菌剂的重量＝2:1:1:3:3进行混合；

步骤2’，向步骤1’制得的体系中加入营养型稀释载体进行复配，制备活菌总数为1×10⁸CFU/g的快速发酵复合益生菌调节剂，其中，所述营养型稀释载体包括蔗糖、葡萄糖、酵母粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾和碳酸钙，其中，各组分的重量比为蔗糖:葡萄糖:酵母粉:柠檬酸钠:磷酸氢二钾:碳酸钙＝(3-8):(1-3):(3-9):(1-3):(1-3):(1-3)。

步骤3’，经粉末包装机充氮气填充将步骤2’制得的快速发酵复合益生菌调节剂进行分装，包装规格1kg/袋。

实施例3植物乳杆菌KT-Lp9耐酸、耐胆盐特性及其抑菌特性实验

将冷冻保存的植物乳杆菌KT-Lp9接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下静态培养18h，如此传代培养2次得到活化发酵液。

本实施例所用MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。

(一)植物乳杆菌KT-Lp9耐酸、耐胆盐特性

实验方法：

1.模拟胃液处理：在pH＝2.5(用1mol/L HCl调整)灭菌PBS缓冲液中，加入3.5g/L胃蛋白酶，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟胃液；将活化好的菌株离心收集菌体，加入与培养基等量的pH＝2.5模拟胃液，于37℃培养3h，分别于0h、3h用MRS琼脂培养基倾注法测定其活菌数。

2.模拟肠液处理：在pH＝8.0(用0.1mol/L NaOH调整)灭菌PBS中，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟肠液；

将模拟胃液中处理3h后的菌液，离心洗菌两次收集菌体后，加入与之前模拟胃液等量的模拟肠液继续37℃培养，分别于4h、8h用MRS琼脂培养基倾注法测活菌数，试验结果如表1所示：

表1植物乳杆菌KT-Lp9人工模拟胃液和肠液的存活率

在本实施例中，存活率可按照如下公式进行计算：

存活率＝[N1/N0]×100％(N0－0h活菌数；N1－经模拟肠、胃液消化后的活菌数)

(二)抑菌特性

实验方法：琼脂孔扩散法(Well-diffusion Agar Assay)。

将灭菌后冷却至50℃左右的MRS琼脂培养基(20ml)与200μL肠道致病菌液(10⁶cfu/ml)一起倒入平板混匀，待加有肠道致病菌的MRS琼脂培养基冷却凝固结实后，使用打孔器在平板上打出直径8mm左右的孔。每孔加入100μL植物乳杆菌KT-Lp9发酵液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。

测定植物乳杆菌KT-Lp9发酵液中一菌代谢产物的含量，实验结果如表2所示，抑菌圈直径大小使用游标卡尺进行测量(保留两位有效数字)，实验结果如表3所示：

表2植物乳杆菌KT-Lp9发酵液中抑菌代谢产物的含量

表3植物乳杆菌KT-Lp9抑菌特性

注：打孔器直径为8mm

由表1至表3的试验结果可知，KT-Lp9菌株具有较好的耐酸以及耐胆盐特性，其在pH2.5的人工模拟胃液中消化3h后继续在pH8.0的人工肠液中消化8h，其存活率高达81.57％，并且，菌株KT-Lp9具有广谱抑制病原菌的优良特性，抑菌效果十分显著，用于水产养殖环境改良能够抑制水体中的病原菌。

实施例4植物乳杆菌C2耐酸、耐胆盐特性及其抑菌特性实验

将冷冻保存的植物乳杆菌C2接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下静态培养18h，如此传代培养2次得到活化发酵液；所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。

(一)植物乳杆菌C2耐酸、耐胆盐特性

实验方法：

1.模拟胃液处理：在pH2.5(用1mol/L HCl调整)灭菌PBS缓冲液中，加入3.5 g/L胃蛋白酶，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟胃液；将活化好的菌株离心收集菌体，加入与培养基等量的pH2.5模拟胃液，37℃培养3h，于0h、3h用MRS琼脂培养基倾注法测定其活菌数。

2.模拟肠液处理：在pH8.0(用0.1 mol/L NaOH调整)灭菌PBS中，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟肠液；将模拟胃液中处理3h后的菌液，离心洗菌两次收集菌体后，加入与之前模拟胃液等量的模拟肠液继续37℃培养，于4h、8h用MRS琼脂培养基倾注法测活菌数。

试验结果如下表4所示：

表4植物乳杆菌C2人工模拟胃液和肠液的存活率

(二)抑菌特性

用琼脂孔扩散法(Well-diffusion Agar Assay)测定植物乳杆菌C2发酵液的抑菌效果：将灭菌后冷却至50℃左右的MRS琼脂培养基(20ml)与200μL肠道致病菌液(10⁶cfu/ml)一起倒入平板混匀。待加有肠道致病菌的MRS琼脂培养基冷却凝固结实后，使用打孔器在平板上打出直径8mm左右的孔。

每孔加入100μL植物乳杆菌C2发酵液，于4℃冰箱中扩散12 h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。抑菌圈直径大小使用游标卡尺进行测量(保留两位有效数字)，实验结果如下表5所示：

表5植物乳杆菌C2抑菌特性

项目	测定结果
		大肠杆菌0517：H7(mm)	42.50±1.18
金黄色葡萄球菌(mm)	29.27±1.07

注：打孔器直径为8mm

由表4和表5试验结果可知，植物乳杆菌C2具有较好的耐酸以及耐胆盐特性，其在pH2.5的人工模拟胃液中消化3h后继续在pH8.0的人工肠液中消化8h，其存活率高达82.42％，并且，植物乳杆菌C2具有广谱抑制致病菌的优良特性，且抑菌效果十分显著。

实施例5植物乳杆菌LP4对霉菌的抑菌特性实验

实验方法：琼脂孔扩散法(Well-diffusion Agar Assay)

将灭菌后冷却至50℃左右的MRS琼脂培养基(20ml)与200μL肠道致病菌液(10⁶cfu/ml)一起倒入平板混匀，待加有肠道致病菌的MRS琼脂培养基冷却凝固结实后，使用打孔器在平板上打出直径8mm左右的孔。每孔加入100μL植物乳杆菌LP4发酵液，于4℃冰箱中扩散12 h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。抑菌圈直径大小使用游标卡尺进行测量(保留两位有效数字)，实验结果如下表6所示：

表6植物乳杆菌LP4的抑菌特性

项目	测定结果
		寄生曲霉(mm)	12.11±0.18
黄曲霉(mm)	10.06±0.57
		娄地青霉(mm)	12.82±0.76

注：打孔器直径为8mm

由表6试验结果可知，植物乳杆菌LP4具有优良的寄生曲霉、黄曲霉、娄地青霉抑制效果，加入复合乳酸菌调节剂能够抑制水体中的霉菌并吸附降解水体和投入水中水产饲料的霉菌毒素。

实施例6地衣芽孢杆菌BL-08产酶试验

实验方法：将地衣芽孢杆菌BL-08点种到蛋白酶平板(蛋白酶培养基：酪蛋白(Sigma公司)10g，牛肉膏3g，Na₂HPO₄ 2g，氯化钠5g，琼脂18g，0.4％溴麝香草酚蓝溶液，蒸馏水1L，pH7.4，)、淀粉酶平板(淀粉酶培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1L，加1.0％可溶性淀粉，pH7.2)和纤维素酶平板(纤维素酶培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1L，加0.5％羧甲基纤维素，pH7.2)上，同时点种营养琼脂平板(营养琼脂培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1L，pH7.2)为对照。37℃恒温培养24小时后，观察并测定水解圈直径(H)和菌落直径(C)大小，计算H/C值。

实验结果如下表7所示：

表7地衣芽孢杆菌BL-08产酶能力

由表7实验结果可知，添加BL-08菌株能够产生大量酶类，有利于分解水体中的有机物。

其中，淀粉酶可以分解水体中的淀粉和糖原等污染物，所述蛋白酶可以分解水体中的蛋白质肽链等污染物，所述纤维素酶可以分解水体中木质素等污染物，而以上污染物是养殖场水体中常见的污染物，所述污染物被上述酶分解后，生成的分解产物不会对水体造成二次污染，而且有利于水产生长。

实施例7改良水产养殖场水质的快速发酵复合益生菌调节剂的应用方法

实验方法：利用本申请实施例2制备的改良水产养殖场水质的快速发酵复合益生菌调节剂，水产养殖场使用清水按照1g:1.5～2L比例将该快速发酵复合益生菌调节剂进行溶解后，装入塑料桶中，密封常温发酵24小时，发酵后的体系向养殖场水体中泼洒，使用量1-2升/亩，泼洒频率为每5-7天泼洒一次。

其中，所述养殖场为海南某水产养殖场，并随机选取2块水域作为试验水域，每块水域面积为3.5亩，2块试验水域分别作为实验组和对照组，以南美白对虾作为试验水产，试验初期同期投苗饲养等量的水产，持续试验3个月，分批次出售水产，试验过程中，对试验水产进行感官评定并记录采食状况，测定水体pH值、氨氮含量、亚硝酸盐含量、硫化氢含量、大肠菌群数、弧菌数，各批次水产售出前累计统计实验组和对照组水产产量并计算亩产量，并且试验过程中统计水产死淘率。

1.试验方法：

(1)水体pH值检测：参照中华人民共和国国家标准GB/T 6920-1986，采用玻璃电极法测定养殖水体pH值。

(2)水体氨氮含量检测：参照中华人民共和国标准HJ 536-2009，采用水杨酸分光光度法测定养殖水体中氨氮的含量。

(3)水体亚硝酸盐含量检测：参照中华人民共和国国家标准GB/T 7493-1987，采用分光光度法测定养殖水体中亚硝酸盐的含量。

(4)水体硫化氢含量检测：参照中华人民共和国国家标准GB/T 16489-1996，采用亚甲基蓝分光光度法测定养殖场水体中硫化氢的含量。

(5)水体大肠菌群数检测：参照中华人民共和国国家标准GB 4789.3-2016，采用微生物培养的方法测定水体中大肠菌群数。

(6)水体弧菌数检测：参照中华人民共和国行业标准SN/T 2564-2010，采用MPCR-DHPLC法测定养殖水体中弧菌数。

(7)水产感官评定及采食状况统计：试验过程中，对实验组和对照组南美白对虾进行感官评定，并记录其采食情况。

(8)水产亩产量统计：记录每个批次南美白对虾出售时的重量，累计实验组和对照组水域成虾的产量，并计算每亩水域中成虾的产量。

(9)水产死淘率统计：每批南美白对虾售出前，统计对照组和实验组饲养过程中水产死淘率，并进行统计。

2.实验结果：

(1)水体pH值检测结果如图1所示：试验前，对照组和实验组水体pH值均为8.7；试验3天后，对照组下降为8.5，实验组下降为8.1mg/L；试验7天后，对照组和实验组分别为8.6和8.0；试验15天后，对照组和实验组仍保持8.6和8.0。由此可见，向养殖场水体中泼洒复合乳酸菌调节剂的快速发酵菌液能够调节水体的pH值，使得养殖场水质保持在适宜水产生长的水平。

本申请人发现，大多数水产适合在7.5-8.3的弱碱性水体中生存，例如，针对南美白对虾的养殖，偏酸性的水体会导致部分南美白对虾处于胁迫状态，个体生长不齐整，但是，如果水体碱性过强，水体氨氮的毒性就会增大，不利于南美白对虾的生长。

(2)水体氨氮含量检测结果如图2所示：试验前，对照组和实验组水体中氨氮含量分别为3.3和3.5mg/L；试验3天后，对照组下降为3.0mg/L，实验组下降为2.2mg/L；试验7天后，对照组下降为2.7mg/L，实验组下降为1.3mg/L，组间差异极显著(P＜0.05)；试验15天后，对照组进一步下降为2.5mg/L，实验组为0.7mg/L，组间差异极显著(P＜0.01)。由此可见，向养殖场水体中泼洒复合乳酸菌调节剂的快速发酵菌液能够显著降低水体中氨氮的含量，改善水质，优化水产机体携氧机能，降低应激反应。

(3)水体亚硝酸盐含量检测结果如图3显示：试验前，对照组和实验组水体中亚硝酸盐含量分别为2.3和2.4mg/L；试验3天后，对照组无明显变化，实验组下降为1.6mg/L；试验7天后，对照组上升为3.1mg/L，实验组进一步下降为0.9mg/L，组间差异极显著(P＜0.01)；试验15天后，对照组下降为2.6mg/L，实验组为0.6mg/L，组间差异极显著(P＜0.01)。由此可见，向养殖场水体中泼洒复合乳酸菌调节剂的快速发酵菌液能够显著降低养殖场水体中亚硝酸盐的含量，改善水质。

研究表明，养殖场水体中亚硝酸盐能够经过对虾的鳃进入其血液，引起对虾应激甚至偷死，其伤害比氨氮更大，因此，降低水体中亚硝酸盐含量能够提高水产的健康水平。

(4)水体硫化氢含量检测结果如图4显示：试验前，对照组和实验组水体中亚硝酸盐含量分别为0.12和0.11mg/L；试验3天后，分别变为0.09和0.04mg/L，组间差异极显著(P＜0.01)；试验7天后，对照组上升为0.10mg/L，实验组为0.04mg/L，组间差异极显著(P＜0.01)；试验15天后，两组分别下降为0.09和0.03mg/L，组间差异极显著(P＜0.01)。由此可见，向养殖场水体中泼洒复合乳酸菌调节剂的快速发酵菌液能够显著降低养殖场水体中硫化氢的含量，由于硫化氢对水产具有强烈毒性，其含量过高会损伤水产机体组织和细胞，因此降低水体硫化氢含量能够降低水体对水产的伤害。

(5)水体大肠菌群数检测结果如图5显示：试验前，对照组和实验组水体中大肠菌群数均为4.3(×1000cfu/mL)；试验3天后，两组分别为4.2和1.9(×1000cfu/mL)，组间差异显著(P＜0.01)；试验7天后，两组进一步下降为3.5和0.7(×1000cfu/mL)，组间差异极显著(P＜0.01)；试验15天后，对照组为3.8(×1000cfu/mL)，实验组仍为0.7(×1000cfu/mL)，组间差异极显著(P＜0.001)。由此可见，向养殖场水体中泼洒复合乳酸菌调节剂的快速发酵菌液能够显著降低水体中大肠菌群数，优化水体菌群结构。

(6)水体弧菌数检测结果如图6显示：试验前，对照组和实验组水体中弧菌数分别为3.1和3.0(×1000cfu/mL)；试验3天后，对照组上升为4.4(×1000cfu/mL)，实验组下降为1.2(×1000cfu/mL)，组间差异显著(P＜0.001)；试验7天后，对照组下降为3.9(×1000cfu/mL)，实验组下降为1.1(×1000cfu/mL)，组间差异极显著(P＜0.001)；试验15天后，对照组小幅度下降为3.2(×1000cfu/mL)，实验组为0.7(×1000cfu/mL)，组间差异极显著(P＜0.001)。由此可见，向养殖场水体中泼洒复合乳酸菌调节剂的快速发酵菌液能够显著降低水体中弧菌数量，弧菌是水产细菌性疾病的主要诱因，包括红尾红腿病、烂眼病、烂尾病、褐斑病、肠炎病等，因此，降低水体中弧菌数能够有效降低养殖水产患病风险，优化水产的生长性能。

(7)试验南美白对虾感官评定及采食状况统计结果如表8显示：外观上看实验组红尾红腿红体现象较少，对照组较多，其中红尾红腿红体表明水体中存在大量的弧菌，水产；实验组和对照组肠道均较粗大，但实验组肠道内容物不间断，表明实验组消化水平优于对照组；实验组和对照组活力均为优，但实验组弹跳力优于对照组，采食速度也比对照组快。

表8试验南美白对虾感官评定及采食状况统计结果

(8)试验过程中分多批次同期成虾售出量如图7所示，其中对照组3.5亩共售出成虾1818kg，平均519.4kg/亩；实验组3.5亩共售出成虾1936kg，平均553.1kg/亩，实验组高于对照组6.49％，增产效果显著。

(9)水产死淘率统计结果如图8显示，对照组和实验组的死淘率分别为2.25％和1.46％，由此可见，向养殖场水体中泼洒复合乳酸菌调节剂的快速发酵菌液能够提高水产产量、快速优化水体，促进水产采食、提高水产产量并减少水产养殖死淘率，并且能够提升水产品质。

综合以上实验数据，本申请人认为，本申请提供的快速发酵复合益生菌调节剂的发酵产物能够通过水产饮用以及饲料进入水产体内，而且，这些发酵产物在水产体内能够作为优势菌群，对其肠道微生态系统具有调节作用，它们通过在动物的肠道中定植而成为肠道生理屏障的重要组成，并通过优化肠道菌群结构，促进营养物质的消化吸收，强化免疫系统，从而抑制病原微生物抵抗病毒，提高健康水平，进一步地，本申请还发现，由所述快速发酵复合益生菌调节剂提供的地衣芽孢杆菌能够在水产养殖水体中广泛存在，产生各类消化酶，提高水产品的饲料消化率，促进生长。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

Claims

1.一种改良水产养殖场水质的快速发酵复合益生菌调节剂，其特征在于，所述快速发酵复合益生菌调节剂包括植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP4菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂和地衣芽孢杆菌BL-08菌剂。

2.根据权利要求1所述的快速发酵复合益生菌调节剂，其特征在于，基于所述快速发酵复合益生菌调节剂的总重量，植物乳杆菌KT-Lp9活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，植物乳杆菌C2活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，植物乳杆菌LP4活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，干酪乳杆菌zhang活菌数量≥2×10¹¹CFU/g，地衣芽孢杆菌BL-08活菌数量≥1×10¹¹CFU/g。

3.根据权利要求1或2所述的快速发酵复合益生菌调节剂，其特征在于，所述快速发酵复合益生菌调节剂中活菌总数≥1×10⁸CFU/g。

4.根据权利要求1至3任一项所述的快速发酵复合益生菌调节剂，其特征在于，所述快速发酵复合益生菌调节剂中所述植物乳杆菌KT-Lp9菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP4菌剂、干酪乳杆菌zhang菌剂与地衣芽孢杆菌BL-08菌剂的重量比为植物乳杆菌KT-Lp9菌剂的重量:植物乳杆菌C2菌剂的重量:植物乳杆菌LP4菌剂的重量:干酪乳杆菌zhang菌剂的重量:地衣芽孢杆菌BL-08菌剂的重量＝(2-4):(1-3):(1-3):(2-4):(2-4)。

5.根据权利要求1至4任一项所述的快速发酵复合益生菌调节剂，其特征在于，所述快速发酵复合益生菌调节剂还包括营养型稀释载体。

6.根据权利要求5所述的快速发酵复合益生菌调节剂，其特征在于，所述营养型稀释载体包括蔗糖、葡萄糖、酵母粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾和碳酸钙。

7.一种制备权利要求1至6任一项所述快速发酵复合益生菌调节剂的方法，其特征在于，所述方法包括：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

9.权利要求1至6任一项所述快速发酵复合益生菌调节剂用于改良水产养殖场水质的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述快速发酵复合益生菌调节剂的用法为用清水将所述快速发酵复合益生菌调节剂稀释并密封发酵20小时以上，将发酵液或者其稀释液泼洒至养殖场水体中。