CN107058123B - 一种出芽短梗霉及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种出芽短梗霉及其应用；该菌种保藏编号为CGMCC No.12249，且该海洋酵母出芽短梗霉HJM‑1在作为微生物肥料农业生产中的应用。本发明筛选出的海洋酵母菌出芽短梗霉及其发酵液中的活性物质作为微生物肥料，当这种肥料施入土壤中，能够有效抑制和防止番茄等蔬菜灰霉菌的病害发生，该菌在土壤中产酸后可分解土壤中的不溶性磷酸盐产生可溶性的磷酸盐，该菌产生的植酸酶可以分解土壤中的植酸产生可溶性的磷酸盐，增加土壤肥力和促进植物生长。

Description

一种出芽短梗霉及其应用
技术领域
本发明涉及微生物以及微生物肥料技术领域，具体涉及一种出芽短梗霉及其应用。
背景技术
在我国的农业生产中，由于多年来化学肥料的长时间使用，使各类营养成分比例失调，农田的生态环境和微生物区系遭到破坏，土壤板结，在一定程度上影响了农产品的安全。而目前，农作物的各种病害的防治主要以农药和化学制剂为主，大量的化肥和农药的使用，会对土壤、水源和农作物造成污染，导致农产品质量下降。
与陆地相比，海洋环境以高盐、高压、低温和稀营养等为特征，海洋微生物长期适应海洋复杂的环境而生存，具有它独特的特征。从海洋环境中分离微生物，并从中筛选具有抗植物疾病、增加土壤肥力的微生物，使用于农业生产中，以避免使用化学药剂和化学肥料对土壤和环境的污染。
现有的微生物肥料，是以微生物菌体代谢产生或分解的物质，代替或减少使用化肥和农药，以减少和降低化肥和农药的危害，现在常用的微生物肥料有固氮菌、解磷菌类、解钾菌类、菌根菌类、抗生菌类等，固氮菌可以固定空气中的氮气增加土壤的肥力，解磷菌类可以分解土壤中的不溶性的磷酸盐增加土壤的肥力，解钾细菌可以分解土壤中的钾长石等不溶性的钾盐提高土壤钾的含量，抗生菌类能够产生抗生素抑制植物病原微生物的生长从而减少植物病害的发生。而海洋环境的特殊性决定了在其中存在有特殊能力的微生物，从中选取合适的微生物作为微生物肥料具有可行性。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种出芽短梗霉HJM-1（Aureobasidium pullulansHJM-1）及其发酵产物，该出芽短梗霉能够抑制蔬菜灰霉等病原霉菌、产生植酸酶、具有解磷能力并能提高土壤肥力。
本发明的另一目的是提供所述出芽短梗霉HJM-1的应用，具体作为微生物肥料农业生产中的应用；另外，本发明还具体提供了该出芽短梗霉作为微生物肥料的具体制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）HJM-1，菌种保藏编号为CGMCCNo.12249，保藏单位是中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年5月13日。
上述出芽短梗霉HJM-1菌种分离方法具体为：将取自青岛近海的海水、海泥、海藻和海洋动物样品，接种于氯霉素YPD液体培养基中，振荡培养，将培养液用灭菌的NaCl溶液进行10倍系列稀释，稀释到10-1到10-6，每个稀释度涂布氯霉素YPD平板培养基，，置于25-28℃恒温箱培养2-3d，挑取生长的单菌落纯化，接种氯霉素YPD培养基斜面，再放置于25-28℃温箱培养。
出芽短梗霉HJM-1 CGMCC No.12249的形态特征，该菌在YPD平板培养基上培养两天后，菌落呈白色或乳白色，边缘不整齐，呈根状。菌体在显微镜下呈圆形到椭圆形，多边出芽生殖，长时间培养，菌体呈现丝状。
上述出芽短梗霉HJM-1在作为微生物肥料农业生产中的应用。
所述出芽短梗霉HJM-1发酵制备微生物肥料的方法包括以下步骤：
（1）斜面培养：将保藏号为CGMCC No.12249的菌株接种于YPD斜面培养基中，在25-28℃温箱培养2-3d；
（2）三角瓶摇瓶培养：将培养好的斜面菌种，按照6%-10%的量，接种到三角瓶的YPD液体培养基中，在25-28℃振荡培养箱培养2-3d；
（3）发酵罐放大液体培养：将液体菌种按照6%-10%的量接种到发酵罐中，发酵过程保持温度25-28℃，搅拌转速200-240r/min，发酵时间2-3d，发酵结束即得到液体微生物菌肥。
上述微生物肥料制备方法还包括固体菌肥的制备：将上述步骤（3）发酵好的液体微生物菌肥，按照1/5-1/8的比例加入到腐植酸：草炭土=1:3的固体基质中，晾干后即为固体菌肥。
本发明的优点：本发明利用海洋环境的特性筛选出抗性强的海洋酵母菌株-出芽短梗霉HJM-1，实验证明，该出芽短梗霉HJM-1能够有效抑制番茄灰霉病菌的生长，产酸和植酸酶能力较强。本发明筛选出的海洋酵母菌出芽短梗霉及其发酵液中的活性物质作为微生物肥料，当这种肥料施入土壤中，能够有效抑制和防止番茄等蔬菜灰霉菌的病害发生，该菌在土壤中产酸后可分解土壤中的不溶性磷酸盐产生可溶性的磷酸盐，该菌产生的植酸酶可以分解土壤中的植酸与植酸盐产生可溶性的磷酸盐，增加土壤肥力和促进植物生长。
附图说明
图1为出芽短梗霉HJM-1菌体形态图片。
图2为出芽短梗霉HJM-1菌落形态图片。
图3为出芽短梗霉HJM-1在平板上抑制灰霉生长的图片。
图4为出芽短梗霉HJM-1在平板上产酸的图片。
图5为出芽短梗霉HJM-1在平板上产植酸酶的图片。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步详细说明本发明。
实施例1：出芽短梗霉HJM-1菌种分离
出芽短梗霉HJM-1菌种分离方法具体为：将取自青岛近海的海水、海泥、海藻和海洋动物样品2.0g，接种于20.0ml氯霉素YPD液体培养基[含2.0% (w/v) 蛋白胨，2.0 % (w/v)葡萄糖，1.0 % (w/v) 酵母粉，0.05% (w/v) 氯霉素，pH 5.5，蒸馏水配制，115℃灭菌30min]中，在25-28℃振荡培养2-3d。将培养液用灭菌的0.85%NaCl溶液进行10倍系列稀释，稀释到10-1到10-6，取合适的稀释度1-3个每个稀释度涂布3个的氯霉素YPD平板培养基 [含2.0% (w/v) 蛋白胨，2.0% (w/v) 葡萄糖，1.0% (w/v)酵母粉，0.05% (w/v) 氯霉素，2.0%(w/v) 琼脂粉，pH 5.5，蒸馏水配制，115℃灭菌30 min]，每个平板涂布100μl，置于25-28℃温箱培养2-3d。挑取生长的单菌落纯化，接种氯霉素YPD培养基斜面，放置于25-28℃温箱培养2-3d。
出芽短梗霉HJM-1的形态特征，如图2所示，该菌在YPD平板培养基上培养两天后，菌落呈白色或乳白色，边缘不整齐，呈根状。如图1所示，菌体在显微镜下呈圆形到椭圆形，多边出芽生殖，长时间培养，菌体呈现丝状。
上述出芽短梗霉CGMCC No.12249性状研究：
1、出芽短梗霉对番茄灰霉病菌的抑制作用：取新鲜培养的出芽短梗霉CGMCCNo.12249在PDA平板上划线，然后取新鲜培养的番茄灰霉菌与之十字交叉划线，将平板置于25-28℃温箱培养2-3d，如图3所示，出现一个抑制带，可见灰霉在平板上的生长被出芽短梗霉抑制。
2、出芽短梗霉产酸能力的检测：取新鲜培养的酵母出芽短梗霉CGMCC No.12249在无机磷培养基[含1.0% (w/v) 葡萄糖，0.05% (w/v)硫酸铵，0.03% (w/v)MgSO4·7H2O，0.03% (w/v)NaCl，0.03% (w/v)KCl，0.0036% (w/v) FeSO4·7H2O，0.003% (w/v) MnSO4·H2O，0.2% (w/v) CaHPO4·2H2O，2.0%(w/v) 琼脂粉，蒸馏水配制，115℃灭菌20min]平板上点种，在25-28℃温箱培养3-5d，在平板上滴上1%溴甲酚紫溶液，观察平板上颜色的变化，如图4所示，确定菌种产酸变色情况。溴甲酚紫指示剂的变色范围是pH6.8-pH5.2，当pH值在6.8及以上时，溴甲酚紫指示剂呈现紫色，当pH值在5.2及以下时，溴甲酚紫指示剂呈现黄色，菌种在平板上经培养后产酸，酸性物质分泌到菌落周围，使菌落周围的培养基pH降低到5.2以下，加到平板上菌落周围的溴甲酚紫指示剂变色，而平板上的其他部分不变色。说明出芽短梗霉产酸能力较强。
3、出芽短梗霉植酸酶的检测：取新鲜培养的出芽短梗霉CGMCC No.12249在植酸酶培养基[0.2% (w/v)植酸钙，3.0% (w/v) 葡萄糖，0.5% (w/v)硝酸铵，0.05% (w/v)氯化钾，0.05% (w/v) )MgSO4·7H2O，0.03% (w/v) MnSO4·H2O，0.03% (w/v) FeSO4·7H2O，2.0%(w/v) 琼脂粉，pH 5.7，蒸馏水配制，115℃灭菌20min]平板上点种，在25-28℃温箱培养3-5d，观察菌落周围的透明圈情况，如图5所示，可见菌落周围的透明区，说明菌株产生植酸酶。这是由于以下原因，在配制培养基时加入的质酸钙为不溶性物质，使整个平板上形成不透明，接种菌种培养后，菌种产生植酸酶分泌到菌落周围，使植酸钙分解成可溶性的物质，从而产生透明圈。说明出芽短梗霉产植酸酶能力较强。
实施例2：海洋微生物菌肥制备
出芽短梗霉HJM-1发酵制备微生物肥料的方法包括以下步骤：
（1）斜面培养：将保藏号为CGMCC No.12249的菌株接种于YPD斜面培养基中，在25-28℃温箱培养2-3d；
（2）三角瓶摇瓶培养：将培养好的斜面菌种，按照6%-10%的量，接种到三角瓶的YPD液体培养基中，在25-28℃振荡培养箱培养2-3d；
（3）发酵罐放大液体培养：将液体菌种按照6%-10%的量接种到发酵罐中，发酵过程保持温度25-28℃，搅拌转速200-240r/min，发酵时间2-3d，发酵结束即得到液体微生物菌肥。
（4）将上述步骤（3）发酵好的液体微生物菌肥，按照1/5-1/8的比例加入到腐植酸：草炭土=1:3的固体基质中，晾干后即为固体菌肥。
实施例3：实施例2制备的海洋微生物菌肥在黄瓜种植上的应用
选取生长一致的黄瓜幼苗，种植于直径15cm的塑料花盆中，1盆1株，用上述固体微生物菌肥和≥1亿/ml的上述液体微生物菌肥采用不同处理方式施加微生物肥料，取固体菌肥40g为底肥处理，不同稀释度的液体菌肥每5天施加1次，每次20ml，对照加入稀释5倍的灭菌的液体YPD培养基20ml，种植30天后测量黄瓜的株高和径粗，并与对照比较。检测结果显示用微生物肥料处理的各个实验组的植株高度和植株径粗都比不加微生物肥料的对照组有明显提高，而且施加1/8稀释度的液体肥料和底肥的处理组增加量最高。
表1 微生物肥料对黄瓜生长的影响
处理方式 平均植株高度（cm） 平均植株径粗（cm）
对照 8.5 0.28±0.04
1/5液体肥 12.7 0.43±0.03
1/8液体肥 11.8 0.39±0.05
1/10液体肥 10.2 0.36±0.07
1/8液体肥加底肥 14.5 0.48±0.05
底肥 9.4 0.30±0.04
实施例4：实施例2制备的海洋微生物菌肥在番茄种植上的应用
选取生长一致的番茄幼苗，种植于直径15cm的塑料花盆中，1盆1株，用上述固体微生物菌肥和≥1亿/ml的上述液体微生物菌肥采用不同处理方式施加微生物肥料，取固体菌肥40g为底肥处理，不同稀释度的液体菌肥每5天施加1次，每次20ml，对照加入稀释5倍的灭菌的液体YPD培养基20ml，种植30天后测量番茄的株高和径粗，并与对照比较。检测结果显示用微生物肥料处理的各个实验组的植株高度和植株径粗都比不加微生物肥料的对照组显著性提高，而且施加1/8稀释度的液体肥料和底肥的处理组增加量最高。
表2 微生物肥料对番茄生长的影响
处理方式 平均植株高度（cm） 平均植株径粗（cm）
对照 9.26 0.23
1/5液体肥 24.39 0.39
1/8液体肥 23.87 0.29
1/10液体肥 16.58 0.27
1/8液体肥加底肥 26.89 0.48
实施例5：实施例2制备的海洋微生物菌肥在小白菜种植上的应用
选取生长一致的白菜幼苗种植于直径15cm的塑料花盆中，1盆1株，将≥1亿/ml的上述液体微生物菌肥分别以1/5、1/8、1/10的比例施加于种植的小白菜花盆中，对照采用1/8稀释度的YPD液体培养基，幼苗定植后每5天施加一次肥料，共施加4次，每次施用20ml，对照加入稀释5倍的灭菌的液体YPD培养基20ml，30天后采收，测定小白菜的地上部鲜重、地上部干重、最大叶长、最大叶宽。检测结果显示施用不同浓度的微生物肥料都能提高小白菜地上部分的鲜重和干重，增加小白菜的最大叶宽和最大叶长，而且当施用微生物肥料浓度为1/8时，效果最好。
表3 微生物肥料对小白菜生长的影响
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实施例6：实施例2制备的海洋微生物菌肥在玉米种植上的应用
选取生长一致的玉米幼苗种植于直径20cm的塑料花盆中，1盆1株，用≥1亿/ml的上述液体微生物菌肥采用不同处理方式施加微生物肥料，不同稀释度的液体菌肥每5天施加1次，每次25ml，对照加入稀释5倍的灭菌的液体YPD培养基25ml，种植30天后测量玉米的苗高、苗干质量、根长、根干质量；添加微生物肥料组在玉米的苗高、苗干质量、根长、根干质量各个指标均明显优于对照组（未施加微生物肥料），且且当施用微生物肥料浓度为1/5时，效果最好。
表4 微生物肥料对玉米生长的影响
处理 平均苗高（cm） 平均苗干质量（g） 平均根长（cm） 平均根干质量（g）
对照 10.45 0.17 8.98 0.14
1/5液体肥 18.16 0.30 14.61 0.24
1/8液体肥 15.23 0.26 12.87 0.21
1/10液体肥 12.24 0.23 11.12 0.18
由上述实施例3-6可得，利用出芽短梗霉HJM-1发酵制备的微生物肥料，能够有效改善植株的生长状况，提高植株的株高、径粗以及叶片大小，增强植株根系发达程度，植株更为健康生长。

Claims (4)

1.一种出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）HJM-1，该菌种保藏编号为CGMCCNo.12249。
2.如权利要求1所述的出芽短梗霉HJM-1作为微生物肥料的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，该应用具体为制备微生物肥料，所述出芽短梗霉HJM-1发酵制备微生物肥料的方法包括以下步骤：
（1）斜面培养：将出芽短梗霉HJM-1菌株接种于YPD斜面培养基中，在25-28℃温箱培养2-3d；
（2）三角瓶摇瓶培养：将培养好的斜面菌种，按照6%-10%的量，接种到三角瓶的YPD液体培养基中，在25-28℃振荡培养箱培养2-3d；
（3）发酵罐放大液体培养：将液体菌种按照6%-10%的量接种到发酵罐中，发酵过程保持温度25-28℃，搅拌转速200-240r/min，发酵时间2-3d，发酵结束即得到液体微生物菌肥。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述微生物肥料制备方法还包括固体菌肥的制备：将所述步骤（3）发酵好的液体微生物菌肥，按照1/5-1/8的比例加入到腐植酸：草炭土=1:3的固体基质中，晾干后即为固体菌肥。
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