CN106947725B - 微生物菌剂及其在盐碱地土壤改良中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物应用技术领域，具体而言，涉及一种微生物菌剂及其在盐碱地土壤改良中的应用。该微生物菌剂由解淀粉芽孢杆菌Bn‑21、枯草芽孢杆菌Bn‑3、短小芽孢杆菌Bn‑19、沼泽红假单胞菌Bn‑2以及植物乳杆菌Bn‑23复配而成，复配的多种微生物具有不同的功能，各自进行不同的微生物代谢活动，菌株两两之间没有拮抗性，各微生物功能相对稳定，可以在土壤调理剂中发挥不同的作用，增加土壤中微生物多样性，增强土壤微生物活动，强化土壤调理剂改善土壤理化性状、提高土壤肥力的效果。

Description

微生物菌剂及其在盐碱地土壤改良中的应用

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，具体而言，涉及一种微生物菌剂及其在盐碱地土壤改良中的应用。

背景技术

盐碱土是盐土和碱土以及各种盐化、碱化土壤的总称。盐土指土壤中可溶性盐分含量达到一定程度，能够对植物的生长和发育产生明显危害的土类；碱土土壤物理性质恶化，土壤高度离散，湿时膨胀，干时板结，通透性很差，严重妨碍作物的生长发育。我国盐碱地比较严重的地方很多，新疆盐碱地最多，多数是以芒硝为主，比较容易治理；吉林西部的白城、松原，黑龙江的大庆、齐齐哈尔，内蒙的赤峰、通辽是以苏打为主的，比较难治理；内蒙古河套地区属于半漠境内陆盐碱土，盐渍土呈连片分布，盐土面积大，盐量高，积盐层厚，盐分组成复杂，有氯化物硫酸盐盐土，也有硫酸盐氯化物盐土，更难治理。

土壤的盐碱化指由于土壤中盐碱离子的大量积累，土壤类型逐渐向盐碱土转变的过程，其影响因素包括自然因素和人为因素。通常情况下盐碱土壤容易出现板结现象，导致土壤的孔隙度变小，土壤透气性和透水性变差，严重影响到土壤中微生物的代谢，降低各种酶的活性和碳、氮元素矿质化程度，土壤中有机质的转化变慢，最终会导致土壤日益贫瘠。土壤含有的大量盐离子也会严重影响到盐碱地植物正常的生理机能，抑制其生长和发育。另外，随着社会经济的发展和人类活动的不断加剧，盐碱地资源越来越受到关注，不合理的灌溉制度也造成土壤次生盐碱化加剧。第二届国际可持续发展大会就指出，未来会严重威胁世界农业可持续发展的是土地的盐碱化、沙漠化和水土流失3大问题。

与大气和水污染相比，土壤修复显得更加困难。目前，土壤治理技术有很多，可以说是各有利弊，从国内外各种有关重金属污染治理方面的文献报道可以发现，其治理途径大都采用物理法、化学法和生物法。物理方法效果好，不受土壤条件的限制，但需要大量的人力、物力和财力，且投资大、见效缓慢，还会破坏土壤结构以及土壤微生物；化学方法见效快，但往往投资昂贵、需用复杂的设备条件、打乱土层结构和易带来二次污染等，对大面积的污染更是无可奈何，因此，这些方法都不能从根本上解决问题。随着人们对环境保护的日益重视，迫切需要找到一条在不破坏土壤物理化学性质的情况下来治理重金属污染土壤的新途径，因而生物修复是首选方法；然而目前针对盐碱地的土壤改良剂多以单微生物菌剂产品为主，产品功能单一，改良效果不够理想。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微生物菌剂，所述菌剂为混合菌剂，菌剂中的各微生物彼此之间不存在拮抗作用，且具有很好的土壤调理功能，适用于盐碱地的改良。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种微生物菌剂，所述菌剂包括以下微生物菌株：

解淀粉芽孢杆菌Bn-21，保藏编号CGMCC NO.13060，保藏时间2016年09月29日；

枯草芽孢杆菌Bn-3，保藏编号CGMCC NO.13729，保藏时间2017年03月07日；

短小芽孢杆菌Bn-19，保藏编号CGMCC NO.13447，保藏时间2016年12月14日；

沼泽红假单胞菌Bn-2，保藏编号CGMCC NO.13526，保藏时间2017年01月05日；

植物乳杆菌Bn-23，保藏编号CGMCC NO.13527，保藏时间2017年01月05日；

上述微生物菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

上述菌株均从内蒙古盐碱地污染地区筛选得到；

枯草芽孢杆菌菌落特征：菌落圆形，无光泽，边缘有细密锯齿形，菌落白色，表面有褶皱。

解淀粉芽孢杆菌菌落特征：菌落扁平圆形，边缘齐整，菌落白色，半透明，光滑湿润，略有粘性。

短小芽孢杆菌菌落特征：菌落灰白色，不透明，较薄，表面粘湿，边缘不整齐。

植物乳杆菌菌落特征：菌落较小，呈圆形，凸起，表面光滑，细密，菌落白色，有光泽。

沼泽红假单胞菌菌落特征：菌落圆形，稍隆起，边缘整齐，菌落呈棕红色，表面光滑。

优选的，如上所述的微生物菌剂，以活菌数量计，解淀粉芽孢杆菌Bn-21、枯草芽孢杆菌Bn-3、短小芽孢杆菌Bn-19、沼泽红假单胞菌Bn-2、植物乳杆菌Bn-23的混合比为(0.4～0.9)：(0.4～0.9)：(0.4～0.9)：(0.8～1.3)：(0.8～1.3)；

更优选的，其混合比为(0.6～0.7)：(0.6～0.7)：(0.6～0.7)：(0.9～1.1)：(0.9～1.1)；

更优选的，其混合比为0.67：0.67：0.67：1：1；

活菌的含义是存活的细菌或者芽孢。

在实际应用的过程中，考虑到其可能需要运输等原因，有必要将其扩大培养制成微生物菌剂的形式以扩大其应用范围。

优选的，如上所述的微生物菌剂，所述微生物菌剂为液体菌剂，且在该液体菌剂中，每种菌株的含量≥1×10⁷CFU/mL；优选的，每种菌株的含量为1×10^7～9CFU/mL；还可以选择1×10⁸CFU/mL，或者(1～5)×10⁷CFU/mL，3×10⁷CFU/mL、8×10⁷CFU/mL等。

优选的，如上所述的微生物菌剂，所述微生物菌剂为固体菌剂，所述固体菌剂由所述的菌株附加固态载体和/或助剂制备而成；且在该固体菌剂中，每种菌株的含量≥1×10⁷CFU/g；优选的，每种菌株的含量为1×10^7～9CFU/g；还可以选择1×10⁸CFU/g，或者(1～5)×10⁷CFU/g，3×10⁷CFU/g、8×10⁷CFU/g等。

优选的，如上所述的微生物菌剂，所述固态载体包括高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、麦饭石、方解石、沸石、白炭黑、滑石粉、细沙以及粘土中的一种或多种。

优选的，如上所述的微生物菌剂，所述助剂包括十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物、烟酸、葡萄糖、氨基酸、维生素中的一种或多种。

如上所述的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

将各菌株接种于液体培养基中进行培养，得到液体菌剂；

可选的，将所述液体菌剂过滤和/或浓缩。

如上所述的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

将经过纯化后得到的所述菌株混于固态载体和/或助剂中既得。

如上所述的微生物菌剂在盐碱地土壤改良中的应用。

本发明所提供的微生物菌剂尤其适合内蒙古地区盐碱地的改良。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)解决了土地盐碱化问题，把土壤修复优良土壤。盐碱地中微生物菌群相对较少，生长力减弱，本发明通过增菌配方，筛选出可在盐碱土壤中生长繁殖的优势菌，用在原位改善土壤结构，调节土壤酸碱平衡，有效改良土壤性质，促进植物生长。对农作物生长的促进作用明显好于现在的堆肥，有利于改善农产品品质，提高经济效益。

(2)本发明提供的微生物菌剂是复配微生物菌剂，复配的多种微生物具有不同的功能，各自进行不同的微生物代谢活动，菌株两两之间没有拮抗性，各微生物功能相对稳定，可以在土壤调理剂中发挥不同的作用，增加土壤中微生物多样性，增强土壤微生物活动，强化土壤调理剂改善土壤性质，提高土壤肥力的效果。

本申请提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，菌株名为Bn-21，保藏时间为：2016年09月29日，保藏编号CGMCC NO.13060。经保藏中心于2016年09月29日检测为存活菌株；

本申请提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，菌株名为Bn-3，保藏时间为：2017年03月07日，保藏编号CGMCC NO.13729。经保藏中心于2017年03月07日检测为存活菌株；

本申请提供的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，菌株名为Bn-19，保藏时间为：2016年12月14日，保藏编号CGMCC NO.13447。经保藏中心于2016年12月14日检测为存活菌株；

本申请提供的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，菌株名为Bn-2，保藏时间为：2017年01月05日，保藏编号CGMCC NO.13526。经保藏中心于2017年01月05日检测为存活菌株；

本申请提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，菌株名为Bn-23，保藏时间为：2017年01月05日，保藏编号CGMCC NO.13527。经保藏中心于2017年01月05日检测为存活菌株；

上述微生物均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供了本发明微生物菌剂中的微生物的筛选过程。

a.以营养肉汤培养基对盐碱地微生物进行增菌，30℃，180r/min，摇培2d。然后进行梯度稀释：在含10％高浓度氯化钠的选择性培养基平板上涂板，涂布10^-5，10^-6稀释液，30℃培养2d，挑选在平板上生长的耐盐菌落，继续在选择性平板上进行划线分离，纯化获得耐高浓度氯化钠的菌种。获得3株芽孢杆菌，分别为短小芽孢杆菌Bn-19，解淀粉芽孢杆菌Bn-21和枯草芽孢杆菌Bn-3。

b.以富集培养基(MgSO₄·6H₂O 0.2g/L，NH₄Cl 1.0g/L，NaHCO₃ 5.0g/L，K₂HPO₄0.5g/L，NaCl 2.0g/L，蛋白胨1.5g/L)进行光照富集和厌氧培养增菌，梯度稀释到10^-4，10^-5后以分离培养基(酵母膏3g/L，蛋白胨3g/L，CaCl₂ 0.3g/L，MgSO₄·6H₂O 0.5g/L)分离筛选出光合细菌。获得沼泽红假单胞菌Bn-2。

c.将发酵食品接种至MRS液体培养基，37℃过夜培养，取1mL样品液梯度稀释到10^-7，10^-8，梯度稀释后在MRS培养基平板上划线分离，筛选出植物乳杆菌Bn-23。

实施例2

本实施例分析了实施例1中筛选得到的菌种间是否存在拮抗作用。

微生物间的拮抗，一般是指一种微生物的生命活动或其代谢产物，抑制或干扰另一种微生物的生命活动的现象。

采用琼脂平板的抑菌圈实验对筛选出的菌种两两进行拮抗实验。筛选出5株两两之间无拮抗作用的菌株，这5株菌种可以作为土壤调理剂的微生物菌种进行复配。

表1 5株菌种两两拮抗实验结果

菌株	Bn-2	Bn-19	Bn-21	Bn-3	Bn-23
						Bn-2	-	-	-	-	-
Bn-19	-	-	-	-	-
						Bn-21	-	-	-	-	-
Bn-3	-	-	-	-	-
						Bn-23	-	-	-	-	-

注：“-”表示菌株之间没有拮抗性。

实施例3

本实施例提供了一种液体菌剂的制备方法。

S31、菌种的发酵培养：将5株菌种分别按照各自的特异性选择性培养基进行工业发酵，获得各发酵液，其中短小芽孢杆菌Bn-19发酵液菌含量为2×10⁹CFU/mL，解淀粉芽孢杆菌Bn-21和枯草芽孢杆菌Bn-3发酵液菌含量均为1×10⁸CFU/mL，沼泽红假单胞菌Bn-2菌含量为5×10⁸CFU/mL，植物乳杆菌Bn-23发酵液菌含量为5×10⁸CFU/mL。

S32、菌剂的制备：将各发酵液以无菌水进行稀释，将3种芽孢杆菌稀释至菌含量为1×10⁷CFU/mL，等体积混合，制备成芽孢杆菌菌剂；将光合细菌和植物乳杆菌分别稀释为1×10⁷CFU/mL，制备成光合细菌菌剂、植物乳杆菌菌剂。芽孢杆菌菌剂、光合细菌菌剂、植物乳杆菌菌剂按照体积比为2：1：1的比例进行复配。

实施例4

本实施例提供了一种液体菌剂的制备方法，制备操作同实施例3，与实施例3不同的是，在本实施例中，步骤S32中各种菌株的含量为1×10⁸CFU/mL；解淀粉芽孢杆菌Bn-21、枯草芽孢杆菌Bn-3、短小芽孢杆菌Bn-19、沼泽红假单胞菌Bn-2、植物乳杆菌Bn-23的混合比为0.5：0.8：0.5：0.8：1.2。

实施例5

本实施例提供了一种固体菌剂及其制备方法，具体包括以下步骤：

将上述实施例3制成的液体菌剂按照每1升液体菌剂配20克滑石粉(作为固体载体)的比例加入至滑石粉中充分搅拌混匀，过滤、干燥、粉碎，即得固体菌剂。

实施例6

本实施例中，制备操作同实施例5，与实施例5不同的是，在本实施例中，所用的固体载体为奶粉、滑石粉、细沙以及粘土等比例的混合物。

实验例

1、试验来源和目的

根据农业部《肥料效应鉴定田间试验技术规程》的要求，试验产品依据国家标准GB20287-2006生产制得，于2016年5月至2016年8月在五原县胜丰镇夹道子一社(东经108°43′，北纬41°01′)大棚内开展黄瓜施用微生物菌剂的小区试验，验证其增产效果，为其在农业生产中应用提供科学依据。

2.试验材料和方法

2.1供试作物和肥料

黄瓜品种为中农12号，肥料按实施例3制备，产品形态为水剂，施用量10L/亩，试验采用育苗移栽方式，5月4日定植。

2.2供试土壤

试验地属中温带大陆性气候，干燥多风，土壤类型为灌淤土。该区域土壤水分蒸发量大，土壤肥力中等、均匀。试验地无前茬作物，地势平坦未进行农作物种植，所选试验地点土壤基本理化情况见表2。

表2试验地土壤基本情况

2.3试验设计

试验共设4个处理，每个处理重复3次，共计12个试验小区，小区面积为50m²(10m×5m)，各小区随机排列，小区间和试验区四周均设保护行。

处理1：常规施肥+实施例3制备的本农微生物菌剂(BN1)(10L/亩)

处理2：常规施肥+等量实施例3所用的不含微生物的培养液基质(BN2)(10L/亩)

处理3：常规施肥(NPK)+等量清水(10L/亩)

处理4：常规施肥(NPK)

2.4施肥方法

常规施肥：底肥为撒施有机肥50kg/亩，45％(15-15-15)复混肥50kg/亩；追肥一次，冲施45％(15-10-20)复混肥40kg/亩；

本农微生物菌剂：用量为10L/亩，于黄瓜定植时灌根。

等量本农微生物菌剂基质和等量清水；施用时间、施用方法、施用量与本农微生物菌剂处理相同。

试验地田间浇水、施肥、病虫害防治等管理措施保持一致，试验大棚内病虫害较轻，试验记录期间天气良好，无明显气候影响因素。

3.试验结果与分析

3.1不同处理对黄瓜生物学性状的影响

根据田间试验观测记录：底肥施用“本农微生物菌剂”改善了黄瓜的生物学性状。由表3可知，处理1的黄瓜果长比处理4增长3cm，处理1的单果重比处理4增加15g，处理1的单株黄瓜结果数比处理4增加1.2个，处理3与处理4之间在这些性状上无显著差异。

表3黄瓜生物学性状调查表

3.2不同处理对黄瓜产量的影响

由表4可知，处理1比处理4增产350.8kg/亩，增产率为7.6％；处理2与处理4之间产量相差3公斤；处理3与处理4之间产量相差4公斤。

表4试验产量统计表

对各处理产量结果进行方差分析，处理间产量差异达极显著水平。采用PLSD法进行多重比较，处理1与处理2、处理3、处理4之间产量差异均达极显著水平，处理2、处理3、处理4之间产量差异不显著。

3.3不同处理对土壤理化性质的影响

在不同处理的试验区及对照区随机选取五个点单独采集土壤，土样均匀混合后按十字法选取待测样品，测定时重复三次并计算平均值，土壤检测结果见表5、表6。由表5、6可知，施用微生物菌剂土壤与空白对照相比，土壤pH值由9.03降低为8.25；全盐由8.74g/kg降低到5.16g/kg，脱盐率达到40.96％，阳离子交换量和交换性钠数值都有明显降低。土壤中各种离子浓度也均有不同程度的降低，可见使用微生物菌剂对土壤起到了降盐降碱的作用。

表5不同处理后土壤理化性质变化

表6土壤离子组成浓度变化

4.试验结论

通过试验可以看出，施用实验例3制备的微生物菌剂对黄瓜的生长发育有良好的促进作用，增产效果显著。施用该微生物菌剂降低了土壤的pH值、全盐含量，对土壤起到了明显降盐降碱的作用。该微生物菌剂经济适用，使用方法简单，增产增收效果明显，改良盐碱土壤性能稳定，建议在示范的同时大面积推广应用。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (11)

1.一种微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂包括以下微生物菌株：

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Bn-21，保藏编号CGMCC NO.13060，保藏时间2016年09月29日；

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bn-3，保藏编号CGMCC NO.13729，保藏时间2017年03月07日；

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)Bn-19，保藏编号CGMCC NO.13447，保藏时间2016年12月14日；

沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)Bn-2，保藏编号CGMCC NO.13526，保藏时间2017年01月05日；

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Bn-23，保藏编号CGMCC NO.13527，保藏时间2017年01月05日；

上述微生物菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

以活菌数量计，所述解淀粉芽孢杆菌Bn-21、枯草芽孢杆菌Bn-3、短小芽孢杆菌Bn-19、沼泽红假单胞菌Bn-2、植物乳杆菌Bn-23的混合比为(0.4～0.9)：(0.4～0.9)：(0.4～0.9)：(0.8～1.3)：(0.8～1.3)。

2.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于，以活菌数量计，解淀粉芽孢杆菌Bn-21、枯草芽孢杆菌Bn-3、短小芽孢杆菌Bn-19、沼泽红假单胞菌Bn-2、植物乳杆菌Bn-23的混合比为(0.6～0.7)：(0.6～0.7)：(0.6～0.7)：(0.9～1.1)：(0.9～1.1)。

3.根据权利要求1～2任一项所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为液体菌剂，且在该液体菌剂中，每种菌株的含量≥1×10⁷CFU/mL。

4.根据权利要求1～2任一项所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为固体菌剂，所述固体菌剂由所述的菌株附加固态载体和/或助剂制备而成；且在该固体菌剂中，每种菌株的含量≥1×10⁷CFU/g。

5.根据权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述固态载体包括高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、麦饭石、方解石、沸石、白炭黑、滑石粉、细沙以及粘土中的一种或多种。

6.如权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述助剂包括十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物、葡萄糖、氨基酸、维生素中的一种或多种。

7.如权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，所述维生素包括烟酸。

8.权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将各菌株接种于液体培养基中进行培养，得到液体菌剂。

9.权利要求8所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，将所述液体菌剂过滤和/或浓缩。

10.权利要求4～7任一项所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将经过纯化后得到的所述菌株混于固态载体和/或助剂中即得。

11.权利要求1～7任一项所述的微生物菌剂在盐碱地土壤改良中的应用。