CN106635903B - 一种提高中重度盐碱地作物耐盐性的促生菌组合 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高中重度盐碱地作物耐盐性的促生菌组合，该组合由一株解淀粉芽孢杆菌ZCM18和一种特基拉芽孢杆菌ZCM5组成。两菌株保藏编号分别为CGMCC No.12959和CGMCC No.12960。两个菌株均可耐受5％的盐度，具有较高的溶磷，固氮，产IAA、ACCD、嗜铁素以及细胞分裂素的能力，可以拮抗镰刀菌、丝核菌和腐霉菌等根部病害病原菌。将两株菌组合后，适用于中重度盐碱地(含盐量0.4％‑1.0％)，在作物耐盐促生的生物肥生产领域，具有提高作物耐盐性，促进根系生长，提高保苗率，降低化肥用量，提高作物产量的良好前景。

Description

一种提高中重度盐碱地作物耐盐性的促生菌组合
技术领域
本发明涉及微生物促生及植物保护领域，具体地，涉及一种提高中重度盐碱地作物耐盐性的促生菌组合。
背景技术
盐碱地的改良与利用是国际研究热点和难点，目前已研发出以水压盐、物理吸附改良、盐水排管、矿渣吸附等技术，但并不适宜淡水资源匮乏的干旱半干旱地区。在耐盐碱植物根际，蕴藏着大量有益微生物资源，有些菌株本身具有较高的耐盐能力，同时可显著提高植物的耐盐能力，并具有促生、防病、抗衰老等作用，应用于植物根际可大幅度提高作物的耐盐、抗旱性和生物产量，从而达到改善和利用盐碱地的目的。目前的研究多集中于单一菌株，往往出现效果不理想或不稳定现象，应用范围也有一定限制，因此，研究具有功能多样，应用范围广谱的多菌组合是研究方向。
在嗜盐微生物中，中度嗜盐菌是一个对盐浓度耐受范围最广的类群，在自然界分布广泛，具有独特的基因类型、特殊的生理机制、多样化的代谢产物和潜在的应用价值。芽孢菌具有存活期长和抗逆性强等特点，广泛分布在不同的土壤和植物根际中，有的也可以侵入植物组织内部。该属中的许多菌株以其固氮能力、对致病菌的抗性和对植物的促生作用而受到研究者们的广泛关注。我国幅员辽阔，环境多样，土质情况差异很大，使得我国的芽孢杆菌资源十分丰富，开发应用潜力巨大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高中重度盐碱地作物耐盐性的促生菌组合。
本发明从海兴县盐碱土壤中分离到一株具有广谱促生抗逆作用的芽孢杆菌ZCM18。通过菌株形态学特征，生理生化特征和16S rRNA序列分析将该菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，该菌株于2016年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.12959，分类名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
在自然条件下，该细菌ZCM18可定殖于多种植物根际，能分泌吲哚乙酸、玉米素、多肽抗菌素、脯氨酸等提高植物抗逆抗病性的物质。
菌株ZCM18的扩繁方法：
菌种的制备，采用LB培养基，配方为：Tryptone 10g L-1，Yeast Extract 5g L-1，NaCl 10g L-1，pH7.0。
发酵培养基为：玉米淀粉10g L-1，酵母粉20g L-1，蛋白胨13g L-1，KH2PO4 2.0g L-1，K2HPO4 2.7g L-1。
解淀粉芽孢杆菌的培养条件为：培养基的最适pH值为7.0，最适培养温度为35℃，培养15h即可到对数后期。
本发明从海兴县盐碱土壤中分离到一株芽孢杆菌ZCM5。通过菌株形态学特征，生理生化特征和16S rRNA序列分析将该菌株鉴定为特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)，该菌株于2016年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.12960，分类名为特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)。
该ZCM5菌株的培养特性为：可耐受5％盐度。
该ZCM5菌株能分泌吲哚乙酸、玉米素、多肽抗菌素、ACCD和嗜铁素等，具有降解有机磷功能。
特基拉芽孢杆菌ZCM5发酵培养基为：甘油14mL L-1，酵母粉20g L-1，胰蛋白胨13gL-1，KH2PO4 2.2g L-1，K2HPO4 2.7g L-1。
特基拉芽孢杆菌培养条件为：培养基的最适pH值为7.2，最适培养温度为30℃，培养15h即可到对数后期。
本发明提供了一种提高中重度盐碱地作物耐盐性的促生菌组合，其包含两种菌株，分别为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZCM18和特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)ZCM5，其保藏编号分别为CGMCC No.12959和CGMCC No.12960。
ZCM18和ZCM5二者有效活性菌的数量比例为1-2:1-5。
本发明提供了含有上述促生菌组合的菌剂。
本发明提供了含有上述促生菌组合的生物肥料。
进一步地，生物肥料中ZCM18和ZCM5的有效活菌数分别为2×107-2×108CFU/g。
本发明的实施例中，采用将上述解淀粉芽孢杆菌ZCM18和特基拉芽孢杆菌ZCM5的菌悬液或发酵液按1:3混合后喷洒在发酵有机肥颗粒或粉末上制备成最终活菌数≥2×107cfu/g生物肥料，用于农作物的生长。
本发明提供了上述促生菌组合或其发酵产物或含有其的菌剂或含有其的生物肥料在作物促生中的应用。
本发明提供了上述促生菌组合或其发酵产物或含有其的菌剂或含有其的生物肥料在抵抗植物病原菌中的应用。
所述的植物病原菌为镰刀菌、丝核菌和腐霉菌。具体地，ZCM18能够拮抗镰刀菌、丝核菌，ZCM5能够拮抗腐霉菌。
本发明提供了上述促生菌组合或其发酵产物或含有其菌剂或含有其活菌的生物肥料在提高作物抗逆性中的应用。
所述的抗逆性为提高植物耐受0.4％-1.0％中重度盐碱度的能力。
优选地，所述植物为小麦、玉米、苏丹草或苹果、梨、枣树等。
本发明采用多级筛选方法获得了一株解淀粉芽孢杆菌ZCM18和特基拉芽孢杆菌ZCM5。ZCM18菌株耐盐度为5％，具有较高的溶磷，固氮，产IAA，ACCD，嗜铁素以及细胞分裂素的能力，还可以拮抗镰刀菌、丝核菌病原菌。特基拉芽孢杆菌ZCM5具有拮抗腐霉菌的作用。试验表明，本发明提供的含有解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZCM18和特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)ZCM5的菌株组合在多种植物(如粮食作物、蔬菜、果树和中药材)，多种土壤条件(如盐碱地、设施蔬菜退化土壤)上应用，均表现出显著提高植物耐盐性，促进根系发育、防控多种根部病害，提高植物耐旱和耐寒性，能显著改善作物生长状态，提高保苗率，增加产量，改善品质，降低化学复混肥的使用量，在盐碱地改良和利用领域具有广阔应用前景。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 解淀粉芽孢杆菌ZCM18的分离和鉴定
1、菌株的分离
取海兴县盐碱地小麦根际土壤1g到10mL无菌生理盐水中，涡旋仪震荡1min后制得根际土壤菌悬液。将菌悬液梯度稀释，涂布于含5％NaCl的LB平板，30℃培养箱中培养48h以分离菌株。
2、菌株的形态学特征
在LB平板上形成圆形、扁平、湿润有粘性的菌落，LB液体培养基中混浊生长，培养后期会形成菌膜。经革兰氏染色，镜下可见两端钝圆、长短不一、革兰阳性杆菌，有大于菌体的次末端芽胞。
3、菌株生理生化特性该菌株可以在含盐量为5％的LB平板上生长。经过溶磷，固氮，IAA，ACCD，嗜铁素以及细胞分裂素的定性检测，发现该菌株具备产相应物质的能力。随后进行了ACCD和IAA酶活测定，并与之前获得的优良解淀粉芽孢杆菌XMW10，假单胞菌YMJ3比较见下表1。
表1不同优势菌株产各种促进植物生长物质能力比较
菌株 IAA(μg/mL) ACCD(mM·mg<sup>-1</sup>h<sup>-1</sup>)
ZCM18 69.04 7.23
ZCM5 54.12 6.32
XMW10 20.49 5.46
YMJ3 49.23 2.11
4、16S rDNA鉴定通过16S rDNA序列分析，菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)相似度达到90％。
综合菌体形态、生理生化特性和16S rDNA基因序列，菌株ZCM18为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，于2016年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.12959，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
5、抑菌特性采用抑菌圈试验方法，进行了ZCM18菌株发酵液的抑菌活性试验，结果见表2。可见ZCM18对三种病原真菌都具有拮抗活性，其中对镰刀菌和丝核菌的拮抗活性显著优于其他菌株。
表2不同菌株对病原真菌抑菌活性
实施例2 特基拉芽孢杆菌ZCM5的分离和鉴定
1、菌株的分离
取海兴县盐碱地小麦根际土壤1g到10mL无菌生理盐水中，涡旋仪震荡1min后制得根际土壤菌悬液。将菌悬液梯度稀释，涂布于含NaCl浓度5％的LB平板，30℃培养箱中培养48h以分离菌株。
2、菌株的形态学特征
在LB平板上形成圆形、表面光滑稍有褶皱，乳白色菌落，LB液体培养基中混浊生长，培养后期会形成菌膜。经革兰氏染色，镜下可见革兰阳性杆菌，有芽胞。
3、菌株生理生化特性
该菌株可以在含盐量为5％的LB平板上生长。经过溶磷，固氮，IAA，ACCD，嗜铁素以及细胞分裂素的定性检测，发现该菌株具备产相应物质的能力。每种能力用5分制进行评分，5分最优，该菌产各种物质的能力见表1。
4、16S rDNA鉴定
通过16S rDNA序列分析可知菌株为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)。
综合菌体形态、生理生化特性和16S rDNA基因序列，该菌株ZCM5于2016年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.12960，分类命名为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)。
5、抑菌特性
进行了ZCM5菌株发酵液的抑菌活性试验，结果见表2。可见，该菌株对三种丝状真菌均有生物抗性，对腐霉菌的拮抗活性显著优于其他菌株。
实施例3 含有解淀粉芽孢杆菌ZCM18和特基拉芽孢杆菌ZCM5的生物肥制备
解淀粉芽孢杆菌ZCM18的种子培养基为LB培养基，将甘油管保存的菌液接种到LB固体培养基上进行活化，35℃培养2d，将单菌落接种到LB液体培养基中，35℃，200r/min，培养15h到对数后期时，按百分之一的接种量再进行转接培养一次后获得的菌液即为种子液。以此种子液进行ZCM18的发酵。通常在35℃，200r/min，培养48h，菌数≥1×1010cfu/mL。
特基拉芽孢杆菌ZCM5的种子培养基为LB培养基，将甘油管保存的菌液接种到LB固体培养基上进行活化，30℃培养2d，将单菌落接种到LB液体培养基中，30℃，200r/min，培养15h到对数后期时，按百分之一的接种量再进行转接培养一次后获得的菌液即为种子液。以此种子液进行ZCM5的发酵。通常在30℃，200r/min，培养48h，菌数为1.0×1010cfu/mL。
上述解淀粉芽孢杆菌ZCM18和特基拉芽孢杆菌ZCM5的种子培养基为LB培养基，将甘油管保存的菌液接种到LB固体培养基上进行活化，30℃培养2d，将单菌落接种到LB液体培养基中，30℃，200r/min，培养15h到对数后期时，按百分之一的接种量再进行转接培养一次后获得的菌液即为种子液。最后分别进行ZCM18和ZCM5的发酵，最终获得的发酵液菌数≥1×1010cfu/mL。将菌液按1：3的比例混合后，喷洒在有机肥颗粒上，制备成菌数≥2×107cfu/g的生物有机肥。
实施例4 解淀粉芽孢杆菌ZCM18和特基拉芽孢杆菌ZCM5防控土传病害镰刀菌、丝核菌和腐霉菌试验
取菜田表层至20cm以上土壤，风干，粉碎，过筛，高压灭菌后作为基础栽培基质。采用实施例3制得ZCM18和ZCM5粉剂生物肥进行盆栽试验。将病原镰刀菌(Fusarium.sp)、丝核菌(Rhizoctonia.sp)和腐霉菌(Pythium.sp)活化后接入高压灭菌的麸皮培养物上，25℃培养7-10天。将长满病原菌菌丝的麸皮培养物风干、捣碎。
不同处理栽培基质的制备。处理1：灭菌土：ZCM18生物肥：病原接种物＝8.5:1:0.5(体积比，下同)，使ZCM18在栽培基质中的活菌含量为2×106cfu/g；处理2：灭菌土：ZCM18生物肥：病原接种物＝9.3：0.2：0.5，ZCM18在栽培基质中的活菌含量为4×105cfu/g；处理3：灭菌土：ZCM5生物肥：病原接种物＝8.5:1:0.5，ZCM5在栽培基质中的活菌含量为4×106cfu/g；处理4：灭菌土：ZCM5生物肥：病原接种物＝9.3:0.2:0.5，ZCM5在栽培基质中的活菌含量为4×105cfu/g；处理5为对照组：按灭菌土：有机肥(生物肥载体)：病原接种物＝8.5:1:0.5的比例混合制备栽培基质。
试验植物为四叶期的黄瓜苗，挑选生长一致的栽培苗，进行移栽，然后浇透水一次。每处理30株。各处理置于25℃光照培养室培养。25天观察发病情况，对结果进行统计分析，结果见表3。可见ZCM18生物肥对三种土传病害的相对防效均达到了80％以上，对镰刀菌和丝核菌的防控效果均显著优于ZCM5，而ZCM5对腐霉菌的仿效显著优于ZCM18。
表3不同生物肥防控土传病害盆栽试验效果
实施例5 解淀粉芽孢杆菌ZCM18和特基拉芽孢杆菌ZCM5发酵产品在含NaCl0.4％－1.0％土壤上小麦盆栽效果试验
将ZCM18和ZCM5分别进行培养，最终获得的发酵液菌数大于1010cfu/mL。将两者按1：3的体积比例混合后使用。盆栽实验采用来自海兴县的盐碱土壤，调整含盐量为0.4％、0.7％和1.0％。试验组将前述混合菌液接种到小麦种子周围，每颗小麦种子50μL。对照组接种等量的无菌水。重复10次。光照室培养25d后统计小麦的株高、地上干重和根干重。最终试验组的株高，地上干重，根干重见表4。
表4 ZCM18和ZCM5发酵产品在不同浓度含NaCl土壤上小麦盆栽试验数据
实施例6 解淀粉芽孢杆菌ZCM18和特基拉芽孢杆菌ZCM5有机肥在中度盐碱地小麦田间效果试验
本试验使用实施例3制得的含有解淀粉芽孢杆菌ZCM18和特基拉芽孢杆菌ZCM5的生物有机肥进行田间试验。试验地点设在河北省沧州市海兴县中度盐碱地，土壤含盐量为0.4％。施肥方式：旋耕1遍，撒施复混肥(39％)18kg/亩，再旋耕1遍，找平。采用常用的施肥一体播种机，对照组按2kg/亩施用化学复混肥(氮磷钾含量39％)，播种，处理组按15kg/亩的用量施用生物有机肥(氮磷钾含量5.2％)，播种。最终统计小麦的根干重和产量。最终处理组的根干重和产量分别比对照组增加13.3％，19.4％。
表5
实施例7 解淀粉芽孢杆菌ZCM18和特基拉芽孢杆菌ZCM5生物有机肥在重度盐碱地苏丹草的田间效果试验
本试验使用实施例3制得的含有解淀粉芽孢杆菌ZCM18和特基拉芽孢杆菌ZCM5的生物有机肥进行田间试验。试验地点设在河北省沧州市海兴县盐碱地。含盐量为1.0％。施肥方式：旋耕2遍，找平，采用常用的施肥一体播种机，对照组按2kg/亩施用化学复混肥(氮磷钾含量39％)，播种，处理组按15kg/亩的用量施用生物有机肥(氮磷钾含量5.2％)，播种。最终统计苏丹草两茬的生物量(以每小区为单位，每株留茬30cm)。最终处理组的第一茬和第二茬的生物量分别比对照组增加9.5％，20.1％。
表6
实施例8 解淀粉芽孢杆菌ZCM18和特基拉芽孢杆菌ZCM5生物有机肥在中度盐碱地玉米的田间效果试验
本试验使用的是实施例3制得的解淀粉芽孢杆菌ZCM18和特基拉芽孢杆菌ZCM5生物有机肥。田间试验的地点设在河北省沧州市海兴县盐碱地。含盐量为0.5％。施肥方式：采用常用的施肥一体播种机，对照组按2kg/亩施用化学复混肥(氮磷钾含量39％)，播种，处理组按15kg/亩的用量施用生物有机肥(氮磷钾含量5.2％)。其余田间管理一致。最终统计玉米的根干重和产量。最终处理组的根干重和产量分别比对照组增加12.6％，23.0％。
表7
实施例9 解淀粉芽孢杆菌ZCM18和特基拉芽孢杆菌ZCM5生物有机肥提高番茄耐寒耐旱试验
采用实施例3的方法，分别制得ZCM18和ZCM5单一菌株和混合菌株生物有机肥，作为供试肥料。以菜田土为栽培基质，进行番茄盆栽试验。处理设置如下：
处理1：栽培基质+ZCM18和ZCM5复合生物有机肥，比例9:1(体积比，下同)
处理2：栽培基质+ZCM5生物有机肥
处理3：栽培基质+ZCM18生物有机肥
处理4：对照，只有栽培基质
处理：将长到三个复叶、均匀一致的番茄苗移栽于不同处理的花盆中，定量浇透水。每处理20盆。在日光温室培养一个月。
耐寒试验：每处理各取5盆放入0℃培养箱中，处理12小时。取相同部位叶片检测相对电导率。
相对电导率的测定方法：分别剪取不同处理番茄同叶位叶片，超纯水冲洗5遍，用洁净滤纸吸干叶片表面水分。用干净的剪刀将叶片剪成1cm左右均匀等重条块，分别放入刻度试管中，用超纯水冲洗3遍，然后用超纯水定容至20mL，室温放置1h，期间可摇匀几次，到时间后，摇匀，用DDS-11A型电导率仪测定其初始电导值C1。将试管至沸水浴中15min，取出自然冷却至室温，摇匀后测定其最终电导值C2。每个处理重复三次。
相对电导率(％)＝C1/C2×100
将冷处理番茄苗移至20℃室温下，恢复24小时，观察受冻害叶片恢复情况。上述检测结果见下表8。
表8不同处理耐寒情况比较
处理 相对电导率％ 受冻害叶片恢复率％
对照 67.2 33.5
ZCM5生物肥 35.4 83.5
ZCM18生物肥 21.5 97.2
ZCM18+ZCM5 20.1 98.2
耐旱性能试验：(1)干旱胁迫法：每处理取5盆，进行缺水处理5天以上，待叶片打蔫，有植株顶尖含水率不足20％时，浇透水，24小时后观察叶片恢复情况，检测相对电导率。(2)测定叶片相对含水量法：取相同部位叶片检测叶片相对含水量，该数值越高说明叶片保水性能越好，越耐旱。检测方法：剪取叶片2份，迅速放入已知重量的铝盒中，称出鲜重Wf；其中一份连同铝盒一并放入烘箱中，先105℃杀青，然后80℃烘干至恒温，称取重量Wd；另一份放入蒸馏水中浸泡6-7小时，取出用滤纸吸干表面水分，称重Wt。
相对含水量％＝(Wf-Wd)/(Wt－Wd)ⅹ100
结果见表9。
表9不同处理耐旱情况比较
处理 相对电导率％ 相对保水率％ 干旱叶片恢复率％
对照 48.5 24.2 47.4
ZCM5生物肥 25.9 26.4 79.2
ZCM18生物肥 16.8 35.7 85.3
ZCM18+ZCM5 16.0 35.9 89.5
可见，ZCM18+ZCM5生物肥可显著提高番茄植株的耐旱、耐寒性，其效果显著优于单一菌株处理。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)ZCM5，其保藏编号为CGMCCNo.12960。
2.权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)ZCM5在提高中重度盐碱地作物耐盐性中的应用。
3.一种提高中重度盐碱地作物耐盐性的促生菌组合，其包含以下两种菌株，分别为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ZCM18和特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)ZCM5，其保藏编号分别为CGMCC No.12959和CGMCC No.12960。
4.如权利要求3所述的促生菌组合，其特征在于，ZCM18和ZCM5二者有效活菌的数量比例为1-2:1-5。
5.含有权利要求3或4所述促生菌组合的菌剂或生物肥料。
6.权利要求3或4所述的促生菌组合或其发酵产物或权利要求5所述的菌剂或生物肥料在作物促生中的应用。
7.权利要求3或4所述的促生菌组合或其发酵产物或权利要求5所述的菌剂或生物肥料在防控植物根部病害中的应用，所述的植物根部病害是由镰刀菌、丝核菌和腐霉菌侵染植物造成的。
8.权利要求3或4所述的促生菌组合或其发酵产物或权利要求5所述的菌剂或生物肥料在提高作物抗逆性中的应用，所述的抗逆性为抗0.4％～1.0％中重度盐碱度。
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