KR101655781B1 - 항균 활성을 갖는 신규한 바실러스 테퀄엔시스 hd15 균주 및 이로부터 박테리오신을 생산하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항균 활성을 갖는 신규한 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주 및 이로부터 박테리오신을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주는 식중독균인 바실러스 시리우스 및 리스테리아 모노사이토제네스에 대해 높은 항균활성을 가지고 있어, 상기 균주로부터 생산되는 박테리오신은 식품첨가제, 사료첨가제, 항생제 대체제 및 항균포장재 등 다양한 분야에서 기능성 물질의 소재로 활용이 가능하다.
Description
본 발명은 항균 활성을 갖는 신규한 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주 및 이로부터 박테리오신을 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바실러스 시리우스(Bacillus cereus)와 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 대한 항균활성이 높은 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주 및 이로부터 박테리오신을 생산하는 방법이다.
바실러스 시리우스(Bacillus cereus)는 Bacillus 속(屬)의 1균종으로, 그램 양성, 아포(芽胞)를 형성하고 주모성(周毛性)의 편모(鞭毛)을 갖는 호기성 대간균(好氣性 大杆菌)이다. 토양, 물 등 자연계에 널리 분포하고, 식품을 오염시킬 기회도 많다. 내열성의 아포를 잘 형성하기 때문에, 가열식품에도 잔존하여 증식하여 식품부패의 원인으로 된다. 일반적으로 비병원균으로 되어 있으나, 때로는 식중독의 원인이 된다. 본균에 기인하는 식중독은 독소형과 설사형이 있고, 본균은 구토형 독소인 세레우리드 (cereulide)와, 설사나 장염을 일으키는 독소인 Nhe (non-hemolytic enterotoxin), Hbl (hemolytic enterotoxin), CytK (cytotoxin K)를 분비한다.
한편, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)는 리스테리아속에 속하는 식중독균으로 사람과 동물에게 질병을 일으킨다. 그람양성, 비아포성의 통성혐기성간균으로 1 ~ 45 ℃ 범위에서 생존할 수 있다. 최적온도는 30 ~ 37 ℃이며, 4 ℃에서도 느린 속도로 생육한다. 냉동, 건조, 열에 비교적 강한 저항력을 나타낸다.
대한민국 공개특허 제10-2012-0020624호 (2012.03.08)에는 바실러스 세레우스 증식 억제능을 갖는 비독성 신규 균주 및 이를 포함하는 장류에 대해 기재되어 있다. 또한 대한민국 특허 제10-0509559호 (2005.08.22.)에는 리스테리아에 대하여 항균성을 가지며, 광범위의 pH 안정성 및 열 안정성을 나타내는 박테리오신을 생산하는 락토바실러스 사케이 P3-1에 대해 기재되어 있다.
식중독균인 바실러스 시리우스(Bacillus cereus) 또는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 대해 높은 항균활성을 갖는 신규한 미생물 균주에 대한 많이 알려져 있지 않은 편이다.
본 발명의 목적은 식중독균에 대해 항균 활성을 갖는 신규한 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주(KACC 91944P) 또는 이 균주의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주로부터 박테리오신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주로부터 박테리오신의 특성을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 본 발명은 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주 (Bacillus tequilensis HD15, KACC 91944P)를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주(KACC 91944P) 또는 상기 균주의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주(Bacillus tequilensis HD15, KACC 91944P)를 배양하는 단계; 상기 배양액을 황산암모늄으로 침전하여 침전물을 생성하는 단계; 상기 침전물을 음이온 교환수지를 이용하여 용출하는 단계; 및 상기 용출된 분획을 겔 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 박테리오신 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 상기 박테리오신 생산 방법에 의해 생산되며 3.6kDa의 분자량을 갖는 박테리오신을 제공한다.
상기한 구성의 본 발명에 의한 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주는 항균 활성이 우수하여 특히 식중독균인 바실러스 시리우스 및 리스테리아 모노사이토제네스에 대한 항균 활성이 높다.
따라서, 본 발명에 의한 HD15 균주 및 이로부터 생산되는 박테리오신은 독성이 없고 안전한 식품첨가제, 사료첨가제, 항생제 대체제 및 항균포장재 등 다양한 분야에서 기능성 물질의 소재로 활용가능하다.
특히 본 발명에 의한 HD15 균주가 생성하는 항균물질은 식품유래 바실러스나 유산균에 대해서는 항균활성이 없고, 바실러스 시리우스와 리스테리아 모노사이토제네스에 대해서만 선택적인 항균활성이 있어, 식품첨가제 등으로 안전하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 유용 박테리오신의 확보는 신선육뿐만 아니라 다양한 축산식품에 적용할 수 있음으로 독성이 없는 안전한 축산식품의 생산에 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명에 의해 분리된 미생물의 바실러스 시리우스(Bacillus cereus)에 대한 항균활성을 비교한 결과를 나타낸 도면.
도 2는 본 발명에 의해 동정된 바실러스 테퀄엔시스(Bacillus tequilensis) HD15 균주의 염기서열(서열번호 1)을 BLASTN의 데이터와 비교하여 분자 생물학적 연관성을 나타낸 계통도.
도 3은 본 발명에 의한 바실러스 테퀄엔시스(Bacillus tequilensis) HD15의 생육곡선과 항균물질 생산 곡선을 나타낸 도면.
도 4는 본 발명에 의한 항균물질을 정제하는 방법을 개략적으로 나타낸 도면.
도 5는 본 발명에 의해 황산암모늄 침전을 이용하여 항균물질을 침전하여 항균활성을 측정한 결과를 나타내는 도면.
도 6은 본 발명에 의해 음이온 교환수지를 이용하여 항균물질을 정제한 결과를 나타내는 도면.
도 7은 본 발명에 의해 겔 컬럼을 이용하여 항균물질을 정제한 결과를 나타낸 도면.
도 8은 본 발명에 의해 SDS-PAGE와 직접검출 (direct detection) 방법을 이용하여 항균물질의 분자량을 측정한 결과를 나타낸 도면. A, Tricine SDS-PAGE; B, SDS-PAGE; C, direct detection. Lane M, Ultra-low range molecular weight marker; AS, 황산암모늄 침전; IEX, 이온교환 크로마토그래피; GF, 겔 크로마토그래피.
도 9는 본 발명에 의한 항균물질의 pH 안정성을 나타낸 도면.
도 10은 본 발명에 의한 항균물질의 온도 안정성을 나타낸 도면.
도 2는 본 발명에 의해 동정된 바실러스 테퀄엔시스(Bacillus tequilensis) HD15 균주의 염기서열(서열번호 1)을 BLASTN의 데이터와 비교하여 분자 생물학적 연관성을 나타낸 계통도.
도 3은 본 발명에 의한 바실러스 테퀄엔시스(Bacillus tequilensis) HD15의 생육곡선과 항균물질 생산 곡선을 나타낸 도면.
도 4는 본 발명에 의한 항균물질을 정제하는 방법을 개략적으로 나타낸 도면.
도 5는 본 발명에 의해 황산암모늄 침전을 이용하여 항균물질을 침전하여 항균활성을 측정한 결과를 나타내는 도면.
도 6은 본 발명에 의해 음이온 교환수지를 이용하여 항균물질을 정제한 결과를 나타내는 도면.
도 7은 본 발명에 의해 겔 컬럼을 이용하여 항균물질을 정제한 결과를 나타낸 도면.
도 8은 본 발명에 의해 SDS-PAGE와 직접검출 (direct detection) 방법을 이용하여 항균물질의 분자량을 측정한 결과를 나타낸 도면. A, Tricine SDS-PAGE; B, SDS-PAGE; C, direct detection. Lane M, Ultra-low range molecular weight marker; AS, 황산암모늄 침전; IEX, 이온교환 크로마토그래피; GF, 겔 크로마토그래피.
도 9는 본 발명에 의한 항균물질의 pH 안정성을 나타낸 도면.
도 10은 본 발명에 의한 항균물질의 온도 안정성을 나타낸 도면.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 본 발명은 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주 (Bacillus tequilensis HD15, KACC 91944P)을 제공한다.
본 발명자들은 항생제를 대체할 수 있고 무독성인 항균활성이 우수한 미생물을 분리하였다 (도 1 참조). 상기 분리된 미생물을 형태학적, 생화학적, 분자생물학적 분석한 결과 바실러스 테퀄엔시스 균주에 속하는 신규한 미생물로 동정되었다. 이를 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주로 명명하고 농업생명공학연구원에 2014.06.10에 기탁하였고, 기탁번호 KACC 91944P를 부여받았다 (표 1 및 도 2 참조).
본 발명에 의한 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주는 특히 식중독을 유발하는 바실러스 시리우스(Bacillus cereus) 또는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 대해 높은 항균활성을 가지고 있음을 확인하였다 (표 3 참조).
본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 상기 균주는 서열번호 1로 나타나는 염기서열의 16S 리보좀 RNA을 갖는다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주(KACC 91944P) 또는 상기 균주의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 본 발명에 따른 항균 조성물은 농약, 의약, 화장품, 생활용품, 식품 등에서 항균, 살균, 소독, 방부 등의 목적을 달성하기 위해 광범위하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 농업에 있어서는 항균, 살균, 소독의 목적으로, 의약에 있어서는 항생제나 오염방지제와 같은 목적으로, 식품에 있어서는 방부나 항균목적으로, 화장품이나 생활용품에 있어서는 비듬억제용, 무좀방지용, 겨드랑이 채취억제용, 항여드름용 등 미생물과 직접 연관된 제품에 사용되거나 청소용 세정제나 식기세척용 세정제 등에 방부나 항균 또는 살균목적으로 사용되어 질 수 있으며, 이러한 목적으로만 한정되는 것은 아니다. 이에 한정되는 것은 아니나, 본 발명의 항균 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 항생제 대체제 또는 항균포장재로 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 항균 조성물 중 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주 또는 상기 균주의 배양물 이외의 성분은 미생물 활성 및 항균 작용을 촉진하는 성분으로써 당업계에 공지된 다양한 성분이 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주(Bacillus tequilensis HD15, KACC 91944P)를 배양하는 단계; 상기 배양액을 황산암모늄으로 침전하여 침전물을 생성하는 단계; 상기 침전물을 음이온 교환수지를 이용하여 용출하는 단계; 및 상기 용출된 분획을 겔 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 박테리오신 생산 방법을 제공한다.
이에 한정되는 것은 아니나, 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주(Bacillus tequilensis HD15, KACC 91944P)를 배양한 후 배양 상등액을 20 ~ 60 % 포화도의 황산암모늄으로 침전하는 것이 바람직하다. 황산암모늄 포화도 별로 100%까지 분별침전하였을 때, 배양 상등액을 포화도 20 ~ 60 %의 황산암모늄으로 침전한 경우 항균활성이 우수한 분획을 획득하였다.
다음, 황산암모늄 침전물은 음이온 교환수지를 이용하여 용출한다. 양이온 교환수지(CM-sepharose CL-6B)에서는 항균물질이 흡착이 안 되어 음이온 교환수지를 사용하였다.
용출된 시료 중 항균활성을 나타내는 분획을 겔 크로마토그래피를 수행하여 항균활성이 있는 분획에서 항균물질을 정제하였다. 상기 방법에 의하면 정제도와 수율을 높일 수 있는 이점이 있다 (표 2 참조).
본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주를 배양하는 단계에서 24 ~ 96 시간 배양한다. 본 발명에 의한 균주는 대수증식기인 배양 24시간부터 항균활성이 나타나기 시작하여 60 시간에 가장 높은 활성을 유지하고 96시간까지 활성이 유지된다 (도 3 참조).
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의해 생산되며 3.6kDa의 분자량을 갖는 박테리오신을 제공한다 (도 8의 A 참조).
본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 본 발명에 의한 박테리오신은 pH 3 ~ 9에서 80% 이상의 잔존 항균활성을 갖는다 (도 9 참조). 본 발명에 의한 박테리오신은 pH 5~7까지 활성이 100%로 유지하였고, pH 2에서는 50%, pH 3과 pH 9에서는 80%, pH 10에서는 30%로 잔존 항균활성이 감소하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 본 발명에 의한 박테리오신은 0 ~ 70℃에서 70% 이상의 잔존 항균활성을 갖는다 (도 10 참조). 본 발명에 의한 박테리오신은 0 ~ 50℃에서 100% 잔존 항균활성을 유지하였고 70℃에서부터 70% 잔존 항균활성으로 낮아지면서 90℃에는 항균활성을 소실하였다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예
1. 미생물의 분리 및 선발
수집한 시료는 멸균 생리식염수로 단계 희석하고 TSA plate에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후에 미생물 집락의 형태에 따라 된장에서 312주, 메주에서 158주, 청국장에서 200주, 볏짚에서 230주를 각각 순수분리하였다. 분리한 미생물 900주를 TSB 액체배지에서 각각 배양한 후, 웰 확산 (well diffusion) 방법을 이용하여 식중독균인 바실러스 시리우스(Bacillus cereus)에 대해 항균활성을 수행한 결과, 우수한 항균활성을 보유한 분리미생물 HD15(생육저지대 17±1 mm)를 최종 선발하였다(도 1).
실시예
2. 선발미생물의 동정
바실러스 시리우스(Bacillus cereus)에 대해 항균활성이 가장 우수한 HD15 선발미생물을 형태학적으로 관찰한 결과, TSA 고체배지 상에서 미생물 콜로니는 불규칙한 모양(irregular)의 거친표면(rough)이 있는 형태로 관찰되었고, 그람염색과 아포염색하여 현미경 관찰한 결과, 내생포자를 형성하는 그람양성 간균으로 확인하였다. API 50 CHB system을 이용한 당이용성 조사를 통한 동정 결과는 바실러스 테퀄엔시스(Bacillus tequilensis)와 99.1% 상동성을 나타내었다(표 1). 보다 더 정확한 동정을 위하여 선발미생물의 16S 리보좀 RNA (ribosomal RNA) 분석을 실시하였다. 16S rRNA 유전자(gene) 염기서열(서열번호 1)을 GenBenk의 BLAST 데이터와 비교하여 분자 생물학적 연관성을 나타내는 계통도를 얻었다(도 2). 이 결과에 따라 선발미생물은 바실러스 테퀄엔시스(Bacillus tequilensis)와 98%의 상동성으로 가장 가까운 유연관계를 나타내었다. 따라서, 선발미생물을 바실러스 테퀄엔시스(Bacillus tequilensis)로 동정하였고, 바실러스 테퀄엔시스 HD15(Bacillus tequilensis HD15)로 명명하고, 2014.06.10.에 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였다(기탁번호 KACC91944P).
실시예
3. 선발미생물의 생육곡선과 항균물질 생산
선발미생물의 생육에 따른 항균활성 특성을 조사하였다(도 3). 바실러스 테퀄엔시스 HD15(Bacillus tequilensis HD15)가 TSB 액체배지에서 배양하였을 때 생육은 37℃에서 배양 36시간까지 대수증식기이었고 72시간까지는 정체기이며 그 이후, 사멸기에 도달하였음을 확인하였다. 바실러스 시리우스(Bacillus cereus)에 대한 항균활성은 대수증식기인 배양 24시간부터 생성되어 사멸기인 60시간에 가장 높은 활성 (80 AU/mL)을 나타내었다. 대부분의 항균물질은 영양원이 고갈되는 정체기에 축적되는 것과 같이 바실러스 테퀄엔시스 HD15(Bacillus tequilensis HD15)가 생산한 항균물질 또한 정체기인 36시간 이후부터 항균활성이 나타나는 것을 확인하였다. 또한 항균활성은 가장 높은 배양 60시간부터 96시간 (4일)까지 활성이 유지되는 것으로 확인하였다.
실시예
4. 선발미생물에 의해 생산된 항균물질의 분리 및 정제
도 4에 나타난 바와 같이, 바실러스 테퀄엔시스 HD15(Bacillus tequilensis HD15) 배양상등액 500 mL을 20 ~ 60% 포화도의 황산암모늄으로 침전한 후(도 5), 이온교환과 겔 크로마토그래피 방법으로 항균물질을 정제하였다. 황산암모늄 침전물은 음이온 교환수지인 페닐-세파로즈 패스트 플로우 (DEAE-sepharose fast flow)를 사용하여 0 ~ 1 M NaCl의 이온강도와 1 mL/min의 유속으로 용출하였다. 용출한 시료를 5 mL씩 분취하여 240개의 분획을 획득하였고 각 분획마다 항균활성을 측정 한 결과, 34 ~ 55번 분획에서 항균활성이 나타났다(도 6).
이온교환 크로마토그래피에서 항균활성이 있는 부분을 모아 투석을 실시하고 동결건조한 후, 세파크릴 S-200HR (sephacryl S-200HR)을 이용하여 겔 크로마토그래피를 수행하였다. 겔 크로마토그래피는 0.5 mL/min 유속으로 용출하고 3mL씩 분취하여 160개의 분획을 획득하였다. 각 분획의 항균활성을 측정한 결과, 49~61번 분획에서 항균활성이 있어 취합하여 정제한 항균물질로 사용하였다(도 7). 항균물질의 정제 결과는 표 2에 나타냈고, 12.4배의 정제도와 26.2%의 수율로 정제되었다.
실시예
5. 항균물질의 분자량 측정
정제한 항균물질의 분자량을 측정하기 위해 트리신 SDS-PAGE (tricine SDS-PAGE)와 SDS-PAGE를 실시하였고, 항균물질 유무를 확인하기 위해 직접 검출 (direct detection) 방법을 수행하였다. 항균물질의 분자량은 약 3.6 kDa임을 분석하였다(도 8의 A). 정제한 항균물질의 전기영동과 직접 검출 (direct detection)을 수행한 결과, 항균활성을 나타내는 투명환이 형성된 밴드가 확인되었고(도 8의 B) 그 밴드 주위로 투명환이 형성됨을 확인하였다(도 8의 C).
바실러스가 생산하는 항균물질 중에서 약 3,500 Da 분자량을 가지는 것은 lantibiotic에 속하는 subtilin, subtilosin A, sublancin 168, ericin S 등으로 알려져 있다. Subtilin은 pentacyclic peptide 형태로 3,319 Da 이고(Stein, 2008), ericin S는 3,442 Da 이며 subtilin과는 4개의 아미노산 잔기만 차이가 있고 매우 유사한 특성을 가진 항균물질(Stein et al., 2002)이다. Subtilosin은 3,399 Da으로 번역 후 과정을 통해 macrocyclic 형태가 되며(Marx et al., 2001), sublancin 168은 3,877 Da이고 두 개의 이황화 결합으로 연결된 lanthionine이 포함되어 있는 형태(Paik et al., 1998)로 보고되어 있다.
실시예
6. 항균물질의 항균스펙트럼 조사
다양한 식중독 및 식품유래 세균에 대한 바실러스 테퀄엔시스 HD15 (Bacillus tequilensis HD15)이 생성하는 항균물질의 항균효과는 표 3에 나타내었다. 웰 확산 (Well diffusion) 방법을 이용하여 항균활성을 측정한 결과, 그람 양성균인 바실러스 시리우스 KACC 40152 (Bacillus cereus KACC 40152)와 리스테리아 모노사이토제네스 ATCC 15313 (Listeria monocytogenes ATCC 15313)에 대한 항균활성이 우수한 것을 확인하였다. 그러나 동일한 그람 양성균인 스타필로코커스 아우레우스 ATCC 25923 (Staphylococcus aureus ATCC 25923), 바실러스 서틸리스 KACC 11779 (Bacillus subtilis KACC 11779), 락토바실러스 액시도필러스 KACC 40265 (Lactobacillus acidophilus KACC 40265), 락토바실러스 브레비스 KACC 11901 (Lactobacillus brevis KACC 11901)와 다양한 그람음성 식중독 세균에 대해서는 항균활성이 없는 것으로 확인되었다(표 3). 바실러스 테퀄엔시스 HD15 (Bacillus tequilensis HD15)이 생성하는 항균물질은 식품유래 바실러스나 유산균에 대해서는 항균활성이 없으므로, 식품첨가제로 사용시 바실러스 시리우스와 리스테리아 모노사이토제네스에 대해서만 선택적인 항균활성이 있는 것으로 확인되었다.
실시예
7. 항균물질의
pH
안정성
정제한 항균물질의 pH 안정성을 측정하기 위해 pH 2~10까지 각각 완충용액으로 항균물질을 희석하여 배양온도인 37℃에서 12시간 동안 방치한 후, 잔존 항균활성을 측정한 결과는 도 9에 나타내었다. 항균물질은 pH 5~7까지 활성이 100%로 유지하였고, pH 2에서는 50%, pH 3과 pH 9에서는 80%, pH 10에서는 30%로 잔존 항균활성이 감소하였다. pH의 영향으로 바실러스 시리우스(Bacillus cereus)의 성장을 저해한 것인지 확인하기 위하여 대조군으로 완충용액으로 항균활성을 측정하였는데 완충용액으로는 바실러스 시리우스(Bacillus cereus)가 저해되지 않았다.
실시예
8. 항균물질의 온도 안정성
정제한 항균물질의 온도 안정성 측정을 위해 0 ~ 80℃에서는 12시간 동안 방치하였고, 100℃에서는 1시간 동안 방치한 후, 잔존 항균활성을 측정한 결과는 도 10에 나타내었다. 정제한 항균물질은 0 ~ 50℃에서 100% 잔존 항균활성을 유지하였고 70℃에서부터 70% 잔존 항균활성으로 낮아지면서 90℃에는 항균활성을 소실하였다.
실시예
9. 항균물질의 효소에 대한 영향
정제한 항균물질에 단백질 분해효소인 protease, proteinase K, pronase E를 처리한 경우, 모두 항균활성이 소실되었다. 또한 Lysozyme, α-amylase, lipase를 처리한 경우, 모두 100% 잔존 항균활성이 유지됨을 확인하였다(표 4). 따라서 단백질 분해효소에 의해 항균활성이 소실되므로 본 연구로부터 정제한 항균물질은 단백질성 물질이라 사료되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION
<120> Bacillus licheniformis HD15 with antibacterial activity and
purification method of bacteriocin using the same
<130> NPF-26297
<160> 1
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 1434
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis HD15
<400> 1
gtactatact tgctgtcgat cgtacagata ggagattgct cactgatgat agaggcgaac 60
gggtgagtat catgtgggta atctgcctgt atgactggga tatctccggg aaaccggggc 120
taataccgga tggttgtttg aaccgcatgg ttcaaacata aaaggtggct tcggctacca 180
cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac 240
gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 300
cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc 360
cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtacc 420
gttcgaatag ggcggtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc 480
agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccggg aattattggg cgtaaagggc 540
tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg 600
gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg 660
cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg 720
aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780
atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac 840
tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg agttgacgtg ggcccgcaca 900
agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat 960
cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg 1020
gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080
atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg 1140
aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca 1200
atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc 1260
agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat 1320
cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga 1380
gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtatc cttttagtag ccagtcgctg atgt 1434
Claims (13)
- 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주 (Bacillus tequilensis HD15, KACC 91944P).
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 바실러스 시리우스(Bacillus cereus) 또는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 대한 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주(KACC 91944P).
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1로 나타나는 염기서열의 16S rRNA를 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주(KACC 91944P).
- 제1항 기재의 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주(KACC 91944P) 또는 상기 균주의 배양물을 유효성분으로 포함하고, 바실러스 시리우스(Bacillus cereus) 또는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 대한 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 조성물은 식품 또는 식품 첨가제인 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
- 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주(Bacillus tequilensis HD15, KACC 91944P)를 배양하는 단계;
배양액을 황산암모늄으로 침전하여 침전물을 생성하는 단계;
상기 침전물을 음이온 교환수지를 이용하여 용출하는 단계; 및
상기 용출된 분획을 겔 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 박테리오신 생산 방법. - 제6항에 있어서, 상기 황산암모늄은 20 ~ 60 % 포화도를 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오신 생산 방법.
- 제6항에 있어서, 바실러스 테퀄엔시스 HD15 균주를 배양하는 단계에서 24 ~ 96 시간 배양하는 것을 특징으로 하는 박테리오신 생산 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제4항에 있어서, 상기 조성물은 사료 첨가제인 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 조성물은 항생제 대체제인 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
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Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Journal of Life Science, Vol.19, pp.994-1002(2009.)* |
The Journal of Microbiology, Vol.50, pp.452-458(2012.)* |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101885097B1 (ko) | 2016-11-25 | 2018-08-03 | 조선대학교산학협력단 | 신규한 바실러스 테퀴렌시스 균주 유래의 항균성 펩타이드 및 그의 용도 |
CN106635903A (zh) * | 2016-12-23 | 2017-05-10 | 河北省农林科学院遗传生理研究所 | 一种提高中重度盐碱地作物耐盐性的促生菌组合 |
CN106635903B (zh) * | 2016-12-23 | 2019-08-23 | 河北省农林科学院遗传生理研究所 | 一种提高中重度盐碱地作物耐盐性的促生菌组合 |
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KR20190012794A (ko) | 2017-07-28 | 2019-02-11 | 대한민국(농촌진흥청장) | 항균 활성을 갖는 바실러스 퍼밀러스 균주 및 이의 항균 용도 |
KR20200006866A (ko) | 2018-07-11 | 2020-01-21 | 대한민국(농촌진흥청장) | 항균 활성을 갖는 바실러스 사펜시스 균주 및 이의 항균 용도 |
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