상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 리스테리아 모노사이토제네스에 대하여 항균활성을 나타내는 락토바실러스 사케이 P3-1(KCTC 10509BP)를 제공한다.
또한 본 발명은 락토바실러스 사케이 P3-1(KCTC 10509BP), 이의 배양액 및 이로부터 생산되는 박테리오신으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택되는 것을 포함하는 항-리스테리아증 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 바람직하기로는 식품, 식품 첨가제, 사료첨가제 또는 약제이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 신규한 균주인 락토바실러스 사케이 P3-1에 관한 것이다.
락토바실러스 사케이 P3-1는 김치시료로부터 분리한 것으로, 세포외로 항균물질인 박테리오신을 분비한다. 균주 분리방법은 도 1에 간략하게 언급되어 있다.
락토바실러스 사케이 P3-1는 각각 대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지에 소재한 유전자은행에 2003년 8월 18일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC 10509BP를 받았다.
락토바실러스 사케이 P3-1는 리스테리아 모노사이토제네스의 생육을 저해하는 박테리오신을 생산하며, 락토바실러스 사케이 P3-1에서 생산되는 박테리오신은 이하 박테리오신 P3-1이라 기재한다.
박테리오신 P3-1은 단백질 또는 펩타이드에 작용하는 효소를 제외한 효소에 대해서는 안정성을 가지며, 통상적인 용매 예를들면 에탄올, 메탄올, 아세토니트릴, 아세톤 및 클로로포름에 의하여 활성이 저해되지 않는다. 또한 박테리오신 P3-1은 pH 3 내지 10 범위에서 안정적이며, 열에도 매우 안정한다. 따라서, 락토바실러스 사케이 P3-1 또는 이들로부터 생산되는 박테리오신은 리스테리아증 유발을 예방 및 치료할 목적으로 사용될 수 있다.
이에, 본 발명에서는 락토바실러스 사케이 P3-1로부터 박테리오신을 최적으로 생산하기 위한 조건을 확립하였다. P3-1은 각 균주의 배양시 2시간경부터 생산되기 시작하며, 배양온도 및 배양시간에 따라 박테리오신 생산량은 다소 차이가 난다. 락토바실러스 사케이 P3-1는 25 내지 37 ℃에서 최소 18시간 배양하여 박테리오신 P3-1을 수득할 수 있으며, 바람직하기로는 30 ℃에서 최소 18시간, 더욱 바람직하기로는 18 내지 40시간 배양하는 것이다.
상기 균주들로부터 각각 박테리오신을 분리하는 방법은 통상의 박테리오신 분리방법으로 실시할 수 있으며, 대표적인 방법인 이온교환수지크로마토그래피 또는 이후 역상 HPLC를 추가로 실시하여 박테리오신을 분리할 수 있다. 상기한 박테리오신 P3-1은 식품 보존제 또는 약제로 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 락토바실러스 사케이 P3-1, 이의 배양액 및 이로부터 생산되는 박테리오신으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택되는 것을 포함하는 항-리스테리아증 조성물을 제공한다. 상기 항-리스테리아증 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 약제일 수 있다.
항-리스테리아증 조성물을 약제로 사용하는 경우 투여방법은 경구 또는 비경구 모두 가능하며, 바람직하기로는 경구 투여이다. 상기 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으나, 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 침제(INFUSIONS), 정제(TABLETS), 주사제(INJECTIONS), 캅셀제(CAPSULES) 및 환제(PILLS)등으로 제조할 수 있다.
본 발명의 항-리스테리아증 조성물은 통상의 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있으며, 상기 희석제 또는 부형제는 항-리스테리아증 조성물의 사용방법 및 용도에 적절한 것을 채택할 수 있다. 대표적인 희석제 또는 부형제로는 물, 덱스트린 또는 생리식염수가 있다.
또한 본 발명의 락토바실러스 사케이 P3-1 또는 이의 배양액을 포함하는 식품을 제공한다. 상기 식품은 바람직하기로는 발효식품이고, 대표적인 것으로는 김치가 있다. 락토바실러스 사케이 P3-1 또는 이의 배양액은 김치 제조시 김치에 첨가할 수 있으며 이때 첨가함량은 김치의 종류 및 김치 양념 등의 조건에 따라 적절히 조절할 수 있다. 일예로 배양액은 김치 1 ㎏당 10 내지 500 ㎖ 첨가할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 신규한 유산균 분리
슈퍼, 대형마트, 재래 시장 등에서 100 여개의 서로 다른 배추김치를 구입하여, 박테리오신을 생산하는 유산균을 분리하고자 하였다.
MRS 고체 배지에 김치시료를 10 배씩 단계적으로 희석(10-1∼10-7)한 것을 100 ㎕ 도말하여 30 ℃에서 24 시간 배양하였다. 여기에 리스테리아 모노사이토제네스(ATCC 19111), 스타필로코커스 아우레우스(subsp. aureusv ATCC 25923) 및 락토바실러스 플란타룸(ATCC 14917) 각각의 배양액을 0.7 %상층아가와 혼합하여 도말된 플레이트 위에 5 ㎖ 중층하였고, 24 시간, 30 ℃에서 배양한 다음 저해환을 형성하는 균주를 선별하였다. 김치시료로부터 박테리오신 생산균을 분리하는 방법은 도 1에 간략하게 기재하였다.
락토바실러스 플란타룸은 MRS 배지에서, 리스테리아 모노사이토제네스는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지에서, 그리고 스타필로코커스 아우레우스는 LB 배지에서 배양하였다. 각 균주 배양액은 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상등액 2 ㎕를 MRS 한천배지에 점적하여 두고 건조한 다음 시킨 후 리스테리아 모노사이토게네스(ATCC19111), 스타필로코커스 아우레우스(subsp. aureusv ATCC 25923) 또는 락토바실러스 플란타룸를 중층하였다. 또한 점적하기 전에 시료들중 하나는 상등액에 프로테이즈K를 처리하여 사용하였다. 중층한 플레이트는 배양기에 두어 균주를 배양시키고, 저해환의 생성유무를 확인하였다.
김치로부터 선별한 선별균주의 배양액 및 배양액의 상등액에서 항균활성을 갖는 균주를 P3-1 균주로 분리하였다. 또한 배양액의 상등액을 프로테아제 처리한 경우 항균 역가가 상실되는 것으로 관찰되어 미생물 생육 억제물질은 단백질인 박테리오신인 것으로 확인되었다.
실시예 2: 신규 균주의 동정
P3-1 균주를 동정하였다.
2-1. 일반적인 특징
P3-1 균주의 형태학적, 생화학적 특성을 조사하였으며(Bergey's Manual of Systeratic Bacteriology), 그 결과 P3-1는 그람양성, 카탈라제 음성, 비운동성인 막대기형태(bacilli form)으로 관찰되었다.
2-2. 당 이용성
API 50 CHL 키트(bioMeriux)를 사용하여 당 이용성을 조사하였다. 먼저 3 번의 순수분리를 거친 균주 각각을 API 50 CHL 배지에 녹여 2 McFarland로 탁도를 적정하였다. 각각의 균액을 스트립의 튜브에 분주하고 미네랄 오일을 첨가하여 30 ℃에서 혐기적 배양하였다. 24 시간 및 48 시간 후에 각각의 이용성을 확인한 다음(표 2), API LAB PLUS (판독프로그램)으로 해석하였다(Daeschel, M. :Procedures to detect antimicrobial activities of microorganism. In "Food biopreservatives of mocrobial origin" B. Ray and Daeschel, M.(eds.) CRC press, Boca Raton, p.57, 1992).
당 |
P3-1 |
당 |
P3-1 |
글리세롤 |
- |
살리신 |
+ |
에리트리톨 |
- |
셀로비오스 |
+ |
D-아라비노스 |
- |
말토스 |
+ |
L-아라비노스 |
+ |
락토스 |
+ |
리보스 |
+ |
멜리빌스 |
+ |
D-자일로스 |
- |
사카로스 |
+ |
아도니톨 |
- |
트레할로스 |
+ |
β-메틸-자일로사이드 |
- |
이눌린 |
+ |
갈락토스 |
+ |
멜레지토스 |
+ |
D-글루코스 |
+ |
D-라피노스 |
+ |
D-프룩토스 |
+ |
아미돈 |
- |
D-만노스 |
+ |
글리코겐 |
- |
L-소르보스 |
- |
자일리톨 |
- |
람노스 |
+ |
β-제네티오비오스 |
+ |
둘시톨 |
- |
D-투라노스 |
+ |
이노시톨 |
- |
D-리소스 |
- |
만니톨 |
+ |
D-푸코스 |
- |
소르비톨 |
+ |
L-푸코스 |
- |
α-메틸-D-마노시드 |
- |
D-아라비톨 |
- |
α-메틸-D-글루코시드 |
- |
L-아라비톨 |
- |
N-아세틸 글루코스아민 |
+ |
글루코네이트 |
+ |
아미그달린 |
+ |
2-세토-글루코네이트 |
- |
아루부틴 |
+ |
5-세토-글루코네이트 |
- |
에스큘린 |
+ |
|
|
P3-1 균주는 일치도가 낮아서 16S rDNA 염기서열을 분석하여 최종 동정을 시도하였다.
2-3. 16S rDNA 염기서열
유전자은행(GeneBank) 상에 등록 되어있는 16S rDNA의 염기서열과 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction: PCR)을 16S rDNA 단편을 증폭시킨 수 이의 염기서열을 비교하였다.
바이오닉스(Korea)에서 주문 제작한 서열번호 1의 LAB16s-F 프라이머와 서열번호 2의 LAB16s-R 프라이머를 이용하여, 상기 두 균주의 염색체 DNA로부터 16S rDNA 유전자를 증폭하였으며, 약 600 bp의 PCR 산물을 수득하였다. PCR 산물은 pEZ-T 벡터(RNA Inc, Korea)에 클로닝하여 염기서열을 결정하였다. 염기서열은 NCBI의 블라스트 프로그램에 넣어 유전자은행에 등록되어 있는 다른 16S rDNA 유전자들과 상동성을 비교하였다. 그 결과 P3-1 균주는 락토바실러스 사케이(Accession NO-AF401673)와 100 %의 상동성을 가지는 것으로 확인되었다.
이상의 결과로, P3-1은 락토바실러스 사케이 P3-1로 각각 명명하였다.
2-4. 플라스미드 비교
락토바실러스 사케이 P3-1를 기존에 실험실에서 보유하고 있는 엔테로코커스 속. A1(사람 장내 유래), 락토코커스 락티스 B2(5), 루코노스톡 파라메센테로이데스 B4, 락토바실러스 플라타룸 B8, 루코노스톡 메센테로이드 C7, 락토코커스 락티스 섭. 락티스(ATCC 7962) 및 락토바실러스 플란타룸(ATCC 14917)과의 차별성을 확인하고자 하였다.
각 균주들은 MRS 5 ㎖에 하룻밤 배양한 다음 플라스미드를 분리하여 아가로즈 젤 상에 전기영동하여 플라스미드 프로파일을 비교하였다.
도 3은 락토바실러스 사케이 P3-1의 플라스미드 프로파일을 비교한 것으로, M은 사이즈마커이고, 1은 엔테로코커스 속. A1이고, 2는 락토코커스 락티스 B2이고, 3은 루코노스톡 파라메센테로이데스 B4이고, 4는 락토바실러스 플란타룸 B8이고, 5는 루코노스톡 메센테로이드 C7이고, 6은 락토바실러스 사케이 P3-1이고, 7은 락토코커스 락티스 섭. 락티스(ATCC 7962)이고, 8은 락토바실러스 플란타룸(ATCC 14917)이다. 도 3에서, 락토바실러스 사케이 P3-1는 비교적 크기가 작은 5개의 플라스미드를 포함하고 있었으며, 이전에 김치로부터 분리한 다른 유산균주들(B2, B4, B8, C7)의 플라스미드 프로파일과 비교하였을 때 크기나 개수에서 확연히 차이가 나타났다.
상기와 같은 동정의 결과들로부터, 본 발명에서 분리한 락토바실러스 사케이 P3-1은 기존의 박테리오신 생산균들과는 다른 새로운 균임을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 박테리오신 생산
3-1. 박테리오신의 저해 스펙트럼 조사
락토바실러스 사케이 P3-1을 MRS 액체배지에 배양하고, 배양액을 원심분리하여 상징액 2 ㎕를 MRS 고체배지에 점적한 다음 여러 가지 균주들을 각각 중층하여 24 시간 배양한 다음 저해 여부를 관찰하였다(표 3).
균주 |
저해환 크기 |
- |
|
Sal. typhimurium
|
- |
Lb. plantarumATCC 14917 |
- |
Lb. delbrueakiisubsp. lactis ATCC 4797 |
- |
Lb. helveticus KFRI 00347 |
- |
Leu. mesenteroides ATCC 10830 |
- |
Leu. mesenteroides NRRL B-512 |
- |
Leu. mesenteroides ATCC 9135 |
+++ |
Listeria monocytogenes ATCC 19111 |
- |
Sta. aureus subsp. aureus ATCC 25923 |
- |
Streptococcus mutans ATCC 25175 |
- |
Bacillus coaqulans ATCC 7050 |
- |
Enterococcus fecalis ATCC 29212 |
- |
Enterococcus faecium ATCC 19953 |
- |
Pseudomonas fluorescens ATCC 21541 |
- |
Pseudomonas aeruginosaATCC 7700 |
- |
Pediococcus pentosaceus NRRL B-14009 |
- |
Aeromonas hydrophia ATCC 7966 |
- |
E.coli O157:H7 ATCC 43894 |
- |
Lb.pentosus KFRI 481 |
|
Leu.mesenteroides KFRI 666 |
- |
그람 양성균과 음성균 총 25 균주를 대상으로 저해 여부를 조사하였다. 락토바실러스 사케이 P3-1은 리스테리아 모노사이토제네스(ATCC 19111) 생육을 강하게 저해하였다. 그 외 그람 음성균은 저해하지 못하였는데, 이는 유산균 박테리오신들에 공통된 특징이다.
락토바실러스 사케이 P3-1이 만드는 박테리오신들은 이상 결과에서 보는 것처럼 니신과 같이 저해 범위가 넓은 박테리오신이 아니라 저해범위가 좁은 것을 알 수 있다. 그리고 리스테리아를 뚜렷하게 저해하는 것으로 보아, 박테리오신들 중에서 분류상으로 ClassⅡ-a 에 속하는 신규 박테리오신들로 추정된다(Klaenhammer, T. R. 1993. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 2 ; 39-86).
락토바실러스 사케이 P3-1에서 각각 생산되는 박테리오신은 리스테리아에 대한 저해 효과가 우수하므로, 열 저항성 및 pH 안정성이 확인되는 경우 리스테리아 오염이 문제되는 육류제품이나 유제품 저장에 유용하다.
3-2. 박테리오신의 안정성 측정
락토바실러스 사케이 P3-1에서 각각 생산되는 박테리오신의 열, 효소 및 pH 안정성을 측정하였다.
여러 효소 처리, 열처리 및 유기용매 처리에 대한 P3-1 박테리오신의 안정성을 조사한 결과는 하기 표 4에 나타낸다.
처리 |
활성(AU/㎖) |
대조군 |
8000 |
효소 |
β-아밀레이즈 |
8,000 |
라이소자임 |
8,000 |
프로테이즈 K |
0 |
펩신 |
0 |
RNaseA |
8,000 |
트립신 |
0 |
카탈라제 |
8,000 |
프로테이즈 |
0 |
용매 |
에탄올 |
8,000 |
메탄올 |
8,000 |
아세토니트릴 |
8,000 |
아세톤 |
8,000 |
클로로포름 |
8,000 |
pH |
pH 3-10 |
8,000 |
열 처리 |
60 ℃, 10분 |
8,000 |
60 ℃, 30분 |
4,000 |
60 ℃, 60분 |
4,000 |
80 ℃, 10분 |
8,000 |
80 ℃, 30분 |
4,000 |
80 ℃, 60분 |
4,000 |
100 ℃, 60분 |
4,000 |
100 ℃, 30분 |
2,000 |
100 ℃, 60분 |
2,000 |
121 ℃, 15분 |
1,000 |
락토바실러스 사케이 P3-1에서 생산되는 박테리오신은 베타-아밀레이즈, 라이소자임, RNase 및 카탈라제 효소처리시 활성에 변화가 없었으나, 프로테이즈K, 펩신, 트립신 또는 프로테이즈 처리시 불활성화되어 박테리오신 활성을 상실하였다.
유기용매처리에서는, 락토바실러스 사케이 P3-1에서 생산되는 박테리오신은 에탄올, 메탄올, 아세토니트릴, 아세톤 또는 클로로포름에 의하여 그 활성이 변화되지 않았으며, pH가 3 내지 10 사이에서도 안정된 박테리오신 역가를 나타내었다. 이는 니신이 산성 pH에서만 안정한 것에 비하여 보다 광범위한 pH에서도 안정한 것으로 확인된 바, 여러 식품들에 첨가되는 식품보존제로 사용하는데 있어서 큰 장점이 될 수 있다.
열 처리시, 락토바실러스 사케이 P3-1에서 생산되는 박테리오신은 열에 매우 안정적이었다.
이상 결과들은 락토바실러스 사케이 P3-1이 생산하는 박테리오신들은 열안정성, pH 안정성을 함께 지니고 있어, 식품들에 첨가제로 사용하기에 매우 적합함을 의미한다.
3-3. 배양조건에 따른 박테리오신 생산율 측정
락토바실러스 사케이 P3-1의 배양조건에 따른 박테리오신 생산율을 조사하였다.
각 균주는 MRS 배지에서 미리 계대 배양한 다음 새로운 MRS 배지에 1 %로 접종하고, 25 ℃, 30 ℃ 및 37 ℃에서 각각 배양하면서 2 시간 단위로 균수 변화를 측정하였다. 또한 박테리오신 생산량의 변화는 2 시간별로 시료를 채취해 spot-도 3a 내지 3c는 락토바실러스 사케이 P3-1의 배양온도에 따른 생육정도(■) 및 박테리오신 생산율(◆)을 나타낸 것이다. 도 3a는 배양온도 25 ℃에서, 3b는 배양온도 30 ℃에서, 3c는 배양온도 37 ℃에서의 생육정도 및 박테리오신 생산율을 나타내고 있다.
락토바실러스 사케이 P3-1의 경우 30 ℃에서 배양하였을 때 박테리오신 역가가 가장 높았으며, 배양 18 시간부터 44 시간 사이에 1,000 AU/㎖의 역가를 관찰할 수 있었다. 25 ℃에서 배양할 경우 배양 28 시간부터 48 시간 사이에 1,000 AU/㎖의 역가를 나타내었고, 37 ℃에서 배양하였을 경우에는 배양 18 시간부터 24 시간까지 300 AU/㎖의 역가를 나타내었다. 따라서 락토바실러스 사케이 P3-1로부는 것이다.
이하 락토바실러스 사케이 P3-1에서 생산되는 박테리오신은 박테리오신 P3-1이라 기재한다.
실시예 4: 박테리오신 정제
4-1. 이온교환 크로마토그래피
박테리오신 P3-1을 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 하기의 방법으로 정제하였다.
락토바실러스 사케이 P3-1 각각을 MRS 액체배지에서 30 ℃, 24 시간 배양한 하였다. 여과액은 이온교환 크로마토그래피(SP-Sepharose Fast Flow: Pharmacia Biotech, France)에 통과시켜 박테리오신을 이온교환수지에 결합시킨 다음 50 mM 인산완충액(pH 8.0)으로 세척한 다음 NaCl 농도구배를 0에서 1 M로 설정하여 용출을 실시하였다. 분획별로 흡광도(OD280)를 측정하였고, 동시에 박테리오신에 민감한 지표균주를 사용하여 박테리오신 역가를 측정하였다.
도 4는 락토바실러스 사케이 P3-1 배양액의 이온교환 크로마토그래프를 나타낸 것이다. 락토바실러스 사케이 P3-1 배양액의 이온교환 크로마토그래피시, 박테리오신 역가가 관찰되는 분획은 23-26 번이었다. 도 4에서 알 수 있듯이, 4 개의 분획에서만 박테리오신 역가가 관찰되어 컬럼을 통하여 박테리오신 분리가 매우 잘 박테리오신 역가를 보이는 분획들은 별도로 모아 -70 ℃에 저장하였다.
4-2. HPLC
박테리오신 역가를 보이는 분획들은 C18-역상 HPLC 컬럼(μBondapak C18 equilibrated with ddH2O)을 통과시켰다. 0.1 % 트리플루오로아세트산를 완충액으로 사용하였고, 농도구배는 아세토니트릴로 0에서 60 %까지 설정하였다. 유속은 1 ㎖/min으로 하여 1 ㎖씩 분획하여 수집하였다. 분획물내 단백질 함량 측정은 시판되는 키트(BioRad)를 사용하였고, SDS-PAGE후 단백질 염색은 코마시 블루를 이용하거나 또는 실버 염색 키트를 사용하였다. 박테리오신 시료 농축시에는 센트리콘(Amicon, MWCO: 1,000)을 사용하였다. 박테리오신의 특이활성은 ㎎ 단백질 당 박테리오신 유닛(units)으로 나타내었다.