CN111226528B - 一种利用枯草芽孢杆菌延缓土壤盐结晶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用枯草芽孢杆菌延缓土壤盐结晶的方法。所述方法将枯草芽孢杆菌接种到盐碱土壤溶液中进行蒸发结晶，然后对蒸发结晶后的固相、液相等组分进行分析，发现枯草芽孢杆菌可以明显延缓土壤盐结晶。本发明表明枯草芽孢杆菌发酵产物可以延缓盐碱土的盐结晶过程，方法新颖、成本较低，具有较大的生态应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，尤其涉及一种利用枯草芽孢杆菌延缓土壤盐结晶的方法。
背景技术
土壤盐渍化是造成可耕土地退化，粮食作物产量降低、品质下降的最大胁迫。世界耕地的20％和灌溉农业用地的30％受到高盐胁迫。而且，世界盐化面积正因为各种原因以每年10％的速度增加，具体原因为低降水、高蒸发量、岩石的风化、盐水灌溉以及较差的栽培技术。据估计可耕土地面积的50％将在2050年盐化。在盐土中的作物遭受着高的渗透压、营养失调、离子毒害、氧化压力、土壤条件恶化等毒害，最终导致作物产量下降。
盐土影响植物主要以两个直接的方式：一是土壤溶液中的盐分增加导致植物脱水，降低植物对水分的利用；二是集中的土壤溶液有利于对不同有害离子数量的累积，进而影响植物。碱性土壤对植物的影响主要有以下三个特征：一是这些土壤胶体中相当高的可溶性盐离子的交换量会抑制阳离子的可利用性；二是氢氧离子的活性会严重地毒害植物；三是土壤中交换络合物上累积的钠离子对土壤起到分散作用，会严重削弱水和空气的渗透性。
研究发现高浓度的Ca2+、Na+、Cl-、CO3 2-及C、N的可利用性的降低，从而对微生物量产生不利作用，因此使得盐土中微生物库较少。当土壤中交换性钠百分率(ESP)超过50，钙离子是不可被大多数植物所利用的。很早就有研究表明含有较高比例的钠的土壤交换络合物对钙具有亲和力，会阻止植物根吸收充分的钙。
枯草芽孢杆菌通过发酵培养产生一系列发酵产物，通过研究微生物发酵过程对盐碱土壤中盐蒸发结晶的影响，能进一步阐明微生物合成高分子聚合物在农业中的利用前景，具有生态意义及科学意义。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术的不足，提出一种利用枯草芽孢杆菌延缓土壤盐结晶的方法，枯草芽孢杆菌(编号BNCC190341)从中国北京北纳生物菌种保存库中购得，该菌株发酵菌液在土壤盐蒸发结晶过程中可以延缓盐结晶。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种利用枯草芽孢杆菌延缓土壤盐结晶的方法，该方法具体步骤如下：
(1)菌种驯化培养
(1.1)先将枯草芽孢杆菌以2％～5％(V/V)的接种量接种至种子培养基，并于25-35℃、100-140r/min摇床培养24～48h得到菌液；种子培养基的配方为：大豆蛋白胨15-20g/L，葡萄糖30-40g/L，谷氨酸钠25-35g/L，NaCl 10-30g/L，其中溶质为经过高压灭菌的无菌水。
(1.2)再将步骤(1.1)中培养的菌液以2％-5％(V/V)的接种量接入发酵培养基，并于25-35℃、100-140r/min摇床培养24～48h后得到发酵菌液；发酵培养基的配方为：大豆蛋白胨15-30g/L，葡萄糖25-35g/L，谷氨酸钠30-40g/L，NaCl 10-30g/L，MgSO4 0.5-1g/L，CaCl2 0.25-0.5g/L，K2HPO4 2.0-3.0g/L，KH2PO4 4.0-5.0g/L以及0.1～0.5g/L生物素，其中溶质为经过高压灭菌的无菌水。
(2)接种菌株的盐碱土壤蒸发结晶
将步骤(1.2)中得到的发酵菌液接入盐碱土壤溶液，发酵菌液与盐碱土壤溶液的体积比为10％～20％，盐碱土取自某碱荒地，pH 8.36，EC 14.42mS/cm，土壤含盐总量为767.6g/kg，首先盐碱土干热灭菌(121℃)2h，杀死土壤溶液中的微生物，通过水土比5:1浸提过滤得到盐碱土壤溶液，然后加入(NH4)2HPO4使得溶液体系中磷酸盐的浓度为5-10mM，培养2-6h后在温度为35-45℃条件下的水浴锅中进行蒸发结晶。接种菌株后在蒸发结晶过程中析出的晶体类型稳定，没有新的盐结晶出现。蒸发结晶结束后，出现的盐结晶类型较少。Ca-P的析出形式由十水合磷酸三钙(Ca3(PO3)610H2O)转化为羟基磷灰石(Ca5(PO4)3(OH))。接种菌株后在一定程度上能抑制盐结晶。
进一步地，步骤(1)中，所述枯草芽孢杆菌首先以2-5％的接种量接种到种子培养基中驯化，然后再以2-5％的接种量加入到发酵培养基中进行发酵，提高枯草芽孢杆菌发酵产物的量。
本发明的有益效果：
(1)本发明利用原料为枯草芽孢杆菌的发酵菌液，成本较低、污染较小，且该菌株可以耐受高盐碱环境；
(2)菌株产物能起到调节土壤性质的作用，本发明表明枯草芽孢杆菌在盐碱土中能缓解盐蒸发结晶的过程；
(3)本发明方法环保无害，在农业生产以及盐碱地修复治理中均有积极意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
(1)菌种的来源：所述枯草芽孢杆菌购买于中国北京北纳生物菌种保存库(编号BNCC190341)。
(2)枯草芽孢杆菌的驯化培养：先将枯草芽孢杆菌以2％的接种量接种至种子培养基并于25℃、100r/min摇床培养48h。种子培养基的配方为：大豆蛋白胨15g/L，葡萄糖30g/L，谷氨酸钠25g/L，NaCl 10g/L，其中溶质为经过高压灭菌的无菌水。再将菌液以2％的接种量接入发酵培养基并于25℃、100r/min摇床培养48h得到发酵菌液。发酵培养基的配方为：大豆蛋白胨15g/L，葡萄糖25g/L，谷氨酸钠30g/L，NaCl 10g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.25g/L，K2HPO4 2.0g/L，KH2PO4 4.0g/L以及0.1g/L生物素，其中溶质为经过高压灭菌的无菌水。
(3)接种菌株的盐碱土壤蒸发结晶：盐碱土取自某碱荒地，pH 8.36，EC 14.42mS/cm，土壤含盐总量为767.6g/kg。首先盐碱土干热灭菌(121℃)2h，杀死土壤溶液中微生物。通过水土比5:1浸提过滤得到盐碱土壤溶液，进一步将发酵菌液接入盐碱土壤溶液，发酵菌液与盐碱土壤溶液的体积比为10％。并加入(NH4)2HPO4使得溶液体系中含磷酸盐的浓度为5mM，培养6h后在水浴锅温度为35℃条件下进行蒸发结晶。接菌后在蒸发结晶过程中析出的晶体类型稳定，没有新的盐结晶出现。蒸发结晶结束后，出现的盐结晶类型较少。Ca-P的析出形式由十水合磷酸三钙(Ca3(PO3)610H2O)转化为羟基磷灰石(Ca5(PO4)3(OH))。接种菌株后在一定程度上能抑制盐结晶。
不加磷处理实验：测得盐碱土壤溶液pH 8.92，EC 14.42mS/cm。将培养24h的菌株接入10％到盐碱土壤溶液中进行蒸发结晶，加入菌液之后，明显降低土壤溶液的pH，加入10％时即可降到7.25左右，EC变化不显著。制备的盐碱土壤原液中活性磷酸盐的含量未检测到，在蒸发结晶过程中，空白组中未检测到活性磷，但是加入10％菌液后，能检测到20mg/L的活性磷。加磷处理实验：测得土壤原液pH 8.51，加磷酸盐处理浓度为5mM后测定pH为7.59，EC 12.60mS/cm。将培养48h的菌株接入10％到盐碱土壤溶液中进行蒸发结晶。其中对pH的影响同不加磷处理的相同，但加磷进行蒸发结晶之后，接入菌液10％相比空白组，EC平均增加2％。活性磷相比空白组提高60％。
实施例2
(1)菌种的来源：所述枯草芽孢杆菌购买于中国北京北纳生物菌种保存库(编号BNCC190341)。
(2)枯草芽孢杆菌的驯化培养：先将枯草芽孢杆菌以5％的接种量接种至种子培养基并于35℃、140r/min摇床培养24h。种子培养基的配方为：大豆蛋白胨20g/L，葡萄糖40g/L，谷氨酸钠35g/L，NaCl 30g/L，其中溶质为经过高压灭菌的无菌水。再将菌液以5％的接种量接入发酵培养基并于35℃、140r/min摇床培养24h得到发酵菌液。发酵培养基的配方为：大豆蛋白胨30g/L，葡萄糖35g/L，谷氨酸钠40g/L，NaCl 30g/L，MgSO4 1g/L，CaCl2 0.5g/L，K2HPO4 3.0g/L，KH2PO4 5.0g/L以及0.5g/L生物素，其中溶质为经过高压灭菌的无菌水。
(3)接种菌株的盐碱土壤蒸发结晶：盐碱土取自某碱荒地，pH 8.36，EC 14.42mS/cm，土壤含盐总量为767.6g/kg。首先盐碱土干热灭菌(121℃)2h，杀死土壤溶液中的微生物。通过水土比5:1浸提过滤得到盐碱土壤溶液，进一步将培养24h的菌株按照15％(V/V)的接种量接入盐碱土壤溶液，并加入(NH4)2HPO4使得溶液体系中含磷酸盐的浓度为10mM，培养2-6h后在水浴锅温度为45℃条件下进行蒸发结晶。接菌后在蒸发结晶过程中析出的晶体类型稳定，没有新的盐结晶出现。情况同实施例1。
不加磷处理实验：测得盐碱土壤溶液pH 8.92，EC14.42 mS/cm。将培养24h的菌株接入15％到盐碱土壤溶液中进行蒸发结晶。加入菌液之后，明显降低土壤溶液的pH，加入15％时即可降到7左右，最后下降到6.5，EC变化不显著。空白组活性磷酸盐的含量未检测到，加入15％菌液后，检测到60mg/L的活性磷。加磷处理实验：测得土壤原液pH 8.51，加磷10mM后测定pH为7.59，EC 12.60mS/cm。将培养24h的菌株接入15％到盐碱土壤溶液中进行蒸发结晶。其中对pH的影响同不加磷处理的相同，但加磷进行蒸发结晶之后，接入菌液15％相比空白组，EC平均增加3.5％。活性磷相比空白组提高63％。
实施例3
(1)菌种的来源：所述枯草芽孢杆菌购买于中国北京北纳生物菌种保存库(编号BNCC190341)。
(2)枯草芽孢杆菌的驯化培养：先将枯草芽孢杆菌以3％的接种量接种至种子培养基并于30℃、130r/min摇床培养36h。种子培养基的配方为：大豆蛋白胨18g/L，葡萄糖35g/L，谷氨酸钠30g/L，NaCl 20g/L，其中溶质为经过高压灭菌的无菌水。再将菌液以3％的接种量接入发酵培养基并于30℃、130r/min摇床培养36h得到发酵菌液。发酵培养基的配方为：大豆蛋白胨20g/L，葡萄糖30g/L，谷氨酸钠35g/L，NaCl 20g/L，MgSO4 0.75g/L，CaCl2 0.4g/L，K2HPO4 2.5g/L，KH2PO4 4.5g/L以及0.3g/L生物素，其中溶质为经过高压灭菌的无菌水。
(3)接种菌株的盐碱土壤蒸发结晶：盐碱土取自某碱荒地，pH 8.36，EC 14.42mS/cm，土壤含盐总量为767.6g/kg。首先盐碱土干热灭菌(121℃)2h，杀死土壤溶液中的微生物。通过水土比5:1浸提过滤得到盐碱土壤溶液，进一步将培养36h的菌株按照20％(V/V)的接种量接入盐碱土壤溶液，并加入(NH4)2HPO4使得溶液体系中含磷酸盐的量为7.5mM，培养4h后在水浴锅温度为40℃条件下进行蒸发结晶。接菌后在蒸发结晶过程中析出的晶体类型稳定，没有新的盐结晶出现。情况同实施例1。
不加磷处理实验：测得盐碱土壤溶液pH 8.92，EC 14.42mS/cm。将培养36h的菌株接入20％到盐碱土壤溶液中进行蒸发结晶。加入菌液之后，明显降低土壤溶液的pH，加入20％时降到5.5左右，EC上升3％左右。空白组活性磷酸盐的含量未检测到，加入20％菌液后，检测到140mg/L的活性磷。加磷处理实验：测得土壤原液pH 8.51，加磷5mM后测定pH为7.59，EC 12.60mS/cm。将培养24h的菌株接入20％到盐碱土壤溶液中进行蒸发结晶。其中对pH的影响同不加磷处理的相同，EC平均增加5％。活性磷相比空白组平均提高30％。
综上所述，本发明主要是利用一种枯草芽孢杆菌延缓盐碱土壤盐结晶，该方法通过利用微生物达到改良盐碱土、降低盐碱土壤中形成Ca-P沉淀的效果，从而能提高土壤中磷肥的利用效率，在土壤治理改良以及农业方面均有积极作用。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种利用枯草芽孢杆菌延缓土壤盐结晶的方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：
（1）菌种驯化培养
（1.1）先将枯草芽孢杆菌以2%~5%（V/V）的接种量接种至种子培养基，并于25-35℃、100-140 r/min 摇床培养24~48 h得到菌液；种子培养基的配方为：大豆蛋白胨15-20 g/L，葡萄糖30-40 g/L，谷氨酸钠25-35 g/L，NaCl 10-30 g/L；
（1.2）再将步骤（1.1）中培养的菌液以2%-5%（V/V）的接种量接入发酵培养基，并于25-35℃、100-140 r/min 摇床培养24~48 h后得到发酵菌液；发酵培养基的配方为：大豆蛋白胨15-30 g/L，葡萄糖25-35 g/L，谷氨酸钠30-40 g/L，NaCl 10-30 g/L，MgSO4 0.5-1 g/L，CaCl2 0.25-0.5 g/L，K2HPO4 2.0-3.0 g/L，KH2PO4 4.0-5.0 g/L以及 0.1~0.5 g/L 生物素；
（2）接种菌株的盐碱土壤蒸发结晶
将步骤（1.2）中得到的发酵菌液接入盐碱土壤溶液，发酵菌液与盐碱土壤溶液的体积比为10%~20%，所述盐碱土壤溶液通过浸提得到，其中盐碱土和二次去离子水的质量比为1:5，然后加入( NH4 ) 2HPO4使得溶液体系中磷酸盐的浓度为5-10 mM，培养2-6 h 后在温度为35-45℃条件下的水浴锅中进行蒸发结晶。
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