CN111747792A - 一种微生物源组合型生物刺激素及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种微生物源组合型生物刺激素，其特征在于，所述微生物源组合型组合型生物刺激素包含如下质量百分比的组分：0.1‑17.5％的聚谷氨酸、0‑5.0％的氨基寡糖素、0.05‑2.0％的泛菌多糖、0‑1.5％γ‑氨基丁酸和余量的辅料。本发明的微生物源组合型生物刺激素能有效提高植物肥料利用率、提高其抗病抗逆能力以及诱导其自身防御体系，且在土壤中可完全被生物降解，对植物本身以及对土壤环境无毒无害无污染。

Description

一种微生物源组合型生物刺激素及其应用

技术领域

本发明属于农业应用领域，具体涉及一种微生物源组合型生物刺激素及其应用。

背景技术

我国是农业大国，耕地土壤是农业发展的基础，过度使用和地力透支是我国的土地环境现状。与此同时，化肥农药的大量使用，虽然为农业发展和粮食增产做出了突出贡献，但是也带来了很多负面问题。肥料的利用率低，土壤板结、土传病害、盐渍化、水体污染等现象，很大程度上威胁了农业的可持续发展。“到2020年实现化肥和农药使用量零增长”进入行动期，绿色防控、有机农业示范基地的开展，农村一二三产业的创新与融合——这些都标志着中国农业的转型升级已正式开启。

生物刺激素既不是农药，更不是传统肥料。生物刺激素的靶标是农作物本身，它可以改善植物的生理生化状态，提高农药效果和肥料的利用率，改善农作物抵抗逆境的水平，也改善农作物的最终产量和农产品品质。目前大多数生物刺激素只是侧重于提高肥料的利用率上，而不是很注重植物自身防御以及抗逆的能力。作物增产的内因为作物本身，外因是肥料，单独强调某一方面，无法达到最大化增产、抗病、抗逆等目的。

因此，开发高效化、生态化、专业化和多功能化的新型农用生物刺激素是现代农业的必然趋势和发展潮流，也是未来农业可持续发展的前景产品。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足，本发明提供一种能有效提高植物肥料利用率、提高其抗病抗逆能力以及诱导其自身防御体系的一种多功能化微生物源组合型生物刺激素。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种微生物源组合型生物刺激素，所述微生物源组合型组合型生物刺激素包含如下质量百分比的组分：0.1-17.5％的聚谷氨酸、0-5.0％的氨基寡糖素、0.05-2.0％的泛菌多糖、0-1.5％γ-氨基丁酸和余量的辅料，其中，所述微生物源组合型生物刺激素中不少于除辅料外的上述两种组分，并且至少包含聚谷氨酸或泛菌多糖中的任意一种。

优选地，所述微生物源组合型组合型生物刺激素包含如下质量百分比的组分：0.1-10％的聚谷氨酸、0.5-4.0％的氨基寡糖素、0.1-2.0％的泛菌多糖、0.5-1.2％γ-氨基丁酸和余量的辅料。

其中，所述聚谷氨酸为γ-聚谷氨酸纯品、γ-聚谷氨酸盐纯品、γ-聚谷氨酸发酵液或γ-聚谷氨酸发酵液喷雾干燥粉剂中的任意一种或几种的组合，其中，聚谷氨酸的分子量为5-100kDa。γ-聚谷氨酸是由微生物发酵产生的一种均聚氨基酸，含有末端胺和多个COO-基团，土壤以及肥料中的Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等可以直接和聚谷氨酸的羧基位点与酰胺基位点键合，形成水溶性的、稳定的聚谷氨酸盐，缓慢的为作物生长提供营养。同时特有的聚羧基结构具有超强的吸水、保水能力，能减少土壤里面的水肥流失，重塑土壤团粒机构。提高农作物光合作用效率和抗逆能力，增加产量、提升作物品质。

所述微生物多糖为泛菌多糖，其是由骆驼刺泛菌经发酵后制得，其分子量为100-2000kDa，其是由骆驼刺泛菌经发酵后制得，所述骆驼刺泛菌其分类学命名为Pantoeaalhagi，具体制备方法为：发酵培养基成分包含了碳源、氮源、无机盐和氧载体，其中，碳源浓度为30～50g/L；氮源浓度为2～8g/L；无机盐总浓度为0.5～2.5g/L；氧载体总浓度为0.5～10g/L；发酵过程中，温度为25～32℃，通气强度为0.1～0.8vvm，发酵周期为16～48h，pH为6.5～7.5。

所述泛菌多糖的存在形式为泛菌多糖纯品、泛菌多糖发酵液原液或发酵液处理液，或泛菌多糖发酵液直接干燥后的粉剂，其中，添加量按照泛菌多糖纯品的重量计。由于该胞外多糖具有吸水性，通过与植物共生，能维持干旱条件下植物内部的水势，因此具有增强植物抗干旱的能力，同时改善根际微生物环境，促进植物生长，增强植物抗盐能力。

所述氨基寡糖素是由壳聚糖经酶法降解制备得到，其中壳聚糖的脱乙酰度为65～85％，酶法降解后氨基寡糖素的聚合度为4-6。氨基寡糖素(壳寡糖)是指D－氨基葡萄糖以β－1，4糖苷键连接的低聚糖，是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基寡糖，由几丁质经部分脱乙酰制得壳聚糖后再降解获得，或由微生物发酵提取的低毒杀菌剂，具有水溶性好、安全无毒、易吸收等优点。在农业应用上，氨基寡糖素(农业级壳寡糖)能对一些病菌的生长产生抑制作用，影响真菌孢子萌发，诱发菌丝形态发生变异、孢内生化发生改变等，能激发植物体内基因，产生具有抗病作用的几丁酶、葡聚糖酶、保素及PR蛋白等，并具有细胞活化作用，有助于受害植株的恢复，促根壮苗，增强作物的抗逆性，促进植物生长发育。氨基寡糖素溶液，具有杀毒、杀细菌、杀真菌作用。在上应用具有微量(PPM级)、高效、低成本、无公害等特点。

所述γ-氨基丁酸是由酶法制备的γ-氨基丁酸、γ-氨基丁酸纯品、γ-氨基丁酸发酵液原液、γ-氨基丁酸发酵液处理液或γ-氨基丁酸发酵液直接干燥后的粉剂中的任意一种或几种的组合物。γ-氨基丁酸长久以来被认为与植物多种应激和防御系统有关。γ-氨基丁酸会随着植物受到刺激而升高，被认为是植物中响应于各种外界变化、内部刺激和离子环境等因素如pH、温度、外部天敌刺激的一种有效机制。

所述辅料根据组合型生物刺激素的产品形式而改变，当产品形式呈现为液体状时，辅料为水，当品形式呈现为固体颗粒或者固体粉末时，辅料为粘土、高岭土、滑石、硅藻土、锯末或陶土中的任意一种或几种的组合。

上述微生物源组合型生物刺激素的制备方法为：在聚谷氨酸或泛菌多糖中的至少一种存在的条件之下，通过调整聚谷氨酸、氨基寡糖素、微生物多糖、γ-氨基丁酸及辅料的配比进行调配混合。

本发明进一步提出了上述微生物源组合型生物刺激素在提高作物的抗病、抗逆能力、促进作物增产上的应用。

具体地，所述的微生物源组合型生物刺激素施用浓度为1g/L-10g/L可通过水培、喷施或灌根施用于农作物，能显著提高作物的抗病、抗逆能力，促进作物增产

有益效果：

(1)本发明在聚谷氨酸或泛菌多糖中的至少一种存在的条件之下，通过调整聚谷氨酸、氨基寡糖素、泛菌多糖、γ-氨基丁酸及辅料的配比，制得一种多功能化微生物源组合型生物刺激素，能有效提高植物肥料利用率、提高其抗病抗逆能力以及诱导其自身防御体系。

(2)本发明中聚谷氨酸以及微生物多糖的发酵液中除了聚谷氨酸和泛菌多糖外，还富含氨基酸、维生素等营养成分，不仅能促进作物微量元素吸收，这些成分作为生物刺激素也能提高肥料对作物的促生效果，有效提高作物质量。

(3)本发明农用制剂配方中的聚谷氨酸、氨基寡糖素、微生物多糖和γ-氨基丁酸均是生物制品，在土壤中可完全被生物降解，对植物本身以及对土壤环境无毒无害无污染。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明名做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明提供了一种微生物组合型生物刺激，其包含如下质量百分比的组分：0-17.5％的聚谷氨酸、0-5.0％的氨基寡糖素、0-2.0％的泛菌多糖、0-1.5％γ-氨基丁酸和余量的辅料，其中，所述微生物源组合型生物刺激素中至少包含聚谷氨酸或泛菌多糖中的任意一种。

下述实施例中，通过如下方法制备各组分：

聚谷氨酸的制备：往发酵结束后的聚谷氨酸发酵液(参照文献Xu Z,Feng X,DanZ,et,al.Enhanced poly(γ-glutamic acid)fermentation by Bacillus subtilis,NX-2immobilized in aerobic plant fibrous-bed bioreactor[J].Bioresour Technol,2014,155:8-14)中添加浓硫酸调节pH至3.5左右，升温至80℃，保温并同时搅拌1小时，随后用氢氧化钠调整pH至7.5，即制备得到本发明所述分子量为5-100kDa的聚谷氨酸；

氨基寡糖素的制备：大肠杆菌发酵制备的粗酶制剂，按照1：100(v粗酶制剂/v底物体积)添加至50g/L壳聚糖溶液中，50℃条件下反应8小时。反应混合物经灭酶活后即为氨基寡糖的浓缩液，即制备得到本发明所述的聚合度为4-6的氨基寡糖素浓缩溶液；

微生物多糖的制备：发酵培养基成分包含了碳源、氮源、无机盐和氧载体，其中，碳源浓度为40g/L；氮源浓度为6g/L；无机盐总浓度为1.3g/L；氧载体总浓度为2.6g/L；发酵过程中，温度为30℃，通气强度为0.6vvm，发酵周期为36h，pH为6.8；发酵结束之后往泛菌多糖发酵液中添加浓硫酸调节pH至3.5左右，升温至80℃，保温并同时搅拌1小时，随后用氢氧化钠调整pH至7.5，即制备得到本发明所述分子量为100-2000kDa的泛菌多糖，下述实施例中泛菌多糖发酵液可参照专利CN108865951B中公开的方法进行制备，下述实施例中采用的菌株为Pantoea alhagi XK-11，藏编号为CGMCC 15526，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年3月29日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。γ-氨基丁酸的制备：通过微生物发酵产谷氨酸脱羧酶，以L-谷氨酸为底物，通过酶转化的方式制备γ-氨基丁酸。

其中，上述发酵产物的获得均可通过现有技术中公开的方法进行制备。

通过将上述所制备的各组分通过一定配比混合，具体为1.0-17.5％的聚谷氨酸、0-5.0％的氨基寡糖素、1.0-2.0％的泛菌多糖、0-1.5％γ-氨基丁酸，其余成分为辅料，其中各配比方式中至少包含聚谷氨酸或泛菌多糖中的任意一种。

实施例1一种微生物源组合型生物刺激素及其对水稻幼苗的促生效果。

所述组合型生物刺激素包含以下三种组合：

组合1：将聚谷氨酸、氨基寡糖素、微生物多糖、以及水经过混合制备得到组合型生物刺激素。其中，聚谷氨酸浓度为10g/L，氨基寡糖素浓度为8g/L，微生物多糖浓度为15g/L。

组合2：将聚谷氨酸、γ-氨基丁酸、以及水经过混合制备得到组合型生物刺激素。其中，聚谷氨酸浓度为10g/L，γ-氨基丁酸浓度为13g/L。

组合3：将微生物多糖、氨基寡糖素、γ-氨基丁酸以及水经过混合制备得到组合型生物刺激素。其中，微生物多糖浓度为5g/L，氨基寡糖素浓度为8g/L，γ-氨基丁酸浓度为13g/L。

为考察本发明组合型植物生物刺激素对水稻幼苗的促生效果，试验设计了5个处理：

处理1：不施肥，施加水；

处理2：施用有机肥、复合肥；

处理3：施用有机肥、复合肥以及本发明所述组合1型生物刺激素；

处理4：施用有机肥、复合肥以及本发明所述组合2型生物刺激素；

处理5：施用有机肥、复合肥以及本发明所述组合3型生物刺激素

本实施例为水稻促生试验，品种为日本晴水稻，试验设3次重复，共计9个小区，小区面积为3m×5m＝15m²，各小区随机分布。处理1不施用肥料。处理2亩施用200kg有机肥，10kg复合肥作基肥，肥料施用后土壤进行翻耕。处理3基肥施用与处理2相同，喷施本实施例所述组合型生物刺激素，稀释100倍后使用，用量为5L/亩。

对试验水稻进行随机取样，选择株高、根长、单株重等指标进行考察，具体如表1所示。

表1施用组合型生物刺激素对水稻促生的影响

通过表1可知，处理3、处理4和处理5的株高较处理1分别增加了20.2cm、18.4cm和22.5cm，较处理2分别增加7.8cm、6cm和10.1cm；处理3、处理4和处理5的根长较处理1分别增加3.5cm、2.8cm和3.8cm，较处理2增加2.1cm、1.3cm和2.3cm；单株重处理3、处理4和处理5较处理1分别增加0.14g、0.08g和0.16g，较处理2增加0.1g、0.04g和0.12g。由本实施例可知，本发明中三种组合型生物刺激素对作物水稻的生长均有很明显的促进作用。

实施例2微生物源组合型生物刺激素及其对水稻抗盐能力的影响。

所述组合型生物刺激素包含以下三种组合：

组合4：将聚谷氨酸、泛菌多糖以及水经过混合制备得到组合型生物刺激素。其中，聚谷氨酸浓度为20g/L，泛菌多糖浓度为10g/L。

组合5：将泛菌多糖、γ-氨基丁酸、以及水经过混合制备得到组合型生物刺激素。其中，泛菌多糖浓度为10g/L，γ-氨基丁酸浓度为13g/L。

组合6：将聚谷氨酸、γ-氨基丁酸、以及水经过混合制备得到组合型生物刺激素。其中，聚谷氨酸浓度为10g/L，γ-氨基丁酸浓度为13g/L。

为考察本发明组合型植物生物刺激素对水稻抗盐能力的影响，试验设计了5个处理：

处理1：CK

处理2：盐胁迫组

处理3：盐胁迫以及本发明所述组合4型生物刺激素

处理4：盐胁迫以及本发明所述组合5型生物刺激素

处理5：盐胁迫以及本发明所述组合6型生物刺激素

具体操作流程为将水稻种子消毒、浸泡、催芽，待种子刚露白，挑选饱满、大小均一的小麦种子播撒到培养皿中，每皿30粒，用Hoagland(霍格兰氏)营养液在光照培养箱中培养，培养条件为25/20℃(昼/夜)、光照强度800μmol/m²/s、光照周期14/l0h(昼/夜)，相对湿度65±5％；待水稻幼苗生长至2叶1心期时，用本实施例中制得的两组组合型生物刺激素对水稻幼苗叶片进行灌根及喷施，使叶片完全湿润，但液体不流下，阴性对照组喷以等量的清水；24h后将水稻幼苗置于盐胁迫10d，然后测定水稻幼苗各项指标。

表2水稻幼苗各项指标

表2得到的结果为：在盐胁迫下，水稻幼苗生长受到抑制，苗高、根长、单株重均显著降低；经本发明所述组合型生物刺激素处理后，与盐胁迫组相比，处理3、处理4和处理5水稻株高分别较处理2增加了21.7cm、19.7cm和18.7cm，处理3、处理4和处理5水稻根长分别较处理2增加了3.3cm、2.5cm和2.3cm，处理3、处理4和处理5水稻单株重分别较处理2增加了0.1g、0.07g和0.05g，该结果表明，该组合型生物刺激素可以促进盐胁迫下植物幼苗生物量的积累，能有效提高水稻幼苗的抗盐能力。

实施例3微生物源组合型生物刺激素及其对黄瓜抗病效果的影响。

所述组合型生物刺激素包含以下两种组合：

组合7：将聚谷氨酸、泛菌多糖、γ-氨基丁酸以及水经过混合制备得到组合型生物刺激素。其中，聚谷氨酸浓度为20g/L，泛菌多糖浓度为10g/L，γ-氨基丁酸5g/L。

组合8：将泛菌多糖、氨基寡糖素、γ-氨基丁酸以及水经过混合制备得到组合型生物刺激素。其中，泛菌多糖浓度为10g/L，氨基寡糖素浓度为20g/L，γ-氨基丁酸浓度为13g/L。

组合9：将聚谷氨酸、γ-氨基丁酸以及水经过混合制备得到组合型生物刺激素。其中，聚谷氨酸浓度为20g/L，γ-氨基丁酸浓度为13g/L。

将本实施例所述组合型生物刺激素用于防控黄瓜黑斑病的实验，实验过程如下：

(1)准备：将本实施例所述组合型生物刺激素稀释500倍，清水作为对照。

(2)试验准备：试验田面积为4亩，每个处理为0.5亩，土质为壤土，pH为6.8，每个实验组设3个重复，每周喷洒一次(喷于黄瓜成株叶片)，一周后喷施病原菌孢子悬液接种病原菌。表中处理1、2、3、4、5分别代表了空白对照组、接种病原菌组以及经本发明所述三种组合型生物刺激素处理对照组，处理2和处理3、4、5唯一的区别在于组合型生物刺激素的处理。

(3)结果处理：药后1周，取样分析，病情指数分为5级(0级，叶片无病斑；1级，病斑占叶面积10％以下；2级，病斑占叶面积10～20％；3级，病斑占叶面积20～40；4级，病斑占叶面积50％以上或叶片干枯)；实验结果如表3。

表3组合型生物刺激素对黄瓜抗病效果的影响

由表3的实验结果可以看出，在施用了本发明所述组合型生物刺激素后对黄瓜黑斑病有了明显的防控作用，其中处理3、处理4和处理5发病率较处理2分别降低了28.7％、35.9％和35％，该结果表明，该组合型生物刺激素可以有效降低黄瓜黑斑病的发病率，能有效抑制病原菌对植物造成的侵害。

本发明提供了一种微生物组合型生物刺激素的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种微生物源组合型生物刺激素，其特征在于，所述微生物源组合型生物刺激素包含如下质量百分比的组分：0.1-17.5％的聚谷氨酸、0-5.0％的氨基寡糖素、0.05-2.0％的泛菌多糖、0-1.5％γ-氨基丁酸和余量的辅料。

2.一种微生物源组合型生物刺激素，其特征在于，所述微生物源组合型生物刺激素包含如下质量百分比的组分：0.1-10％的聚谷氨酸、0.5-4％的氨基寡糖素、0.1-2.0％的泛菌多糖、0.5-1.2％γ-氨基丁酸和余量的辅料。

3.根据权利要求1所述的微生物源组合型生物刺激素，其特征在于，所述聚谷氨酸为γ-聚谷氨酸纯品、γ-聚谷氨酸盐纯品、γ-聚谷氨酸发酵液或γ-聚谷氨酸发酵液喷雾干燥粉剂中的任意一种或几种的组合，其中，聚谷氨酸的分子量为5-100kDa。

4.根据权利要求1所述的微生物源组合型生物刺激素，其特征在于，所述微生物多糖为泛菌多糖，其分子量为100-2000kDa，其是由骆驼刺泛菌经发酵后制得，所述骆驼刺泛菌其分类学命名为Pantoea alhagi，所述泛菌多糖的存在形式为为泛菌多糖纯品、泛菌多糖发酵液原液或发酵液处理液，或泛菌多糖发酵液直接干燥后的粉剂，泛菌多糖的加入量以泛菌多糖纯品质量计。

5.根据权利要求1所述的微生物源组合型生物刺激素，其特征在于，所述氨基寡糖素是由壳聚糖经酶法降解制备得到，其中壳聚糖的脱乙酰度为65～85％，酶法降解后氨基寡糖素的聚合度为4-6。

6.根据权利要求1所述的微生物源组合型生物刺激素，其特征在于，所述γ-氨基丁酸是由酶法制备的γ-氨基丁酸、γ-氨基丁酸纯品、γ-氨基丁酸发酵液原液、γ-氨基丁酸发酵液处理液或γ-氨基丁酸发酵液直接干燥后的粉剂中的任意一种或几种的组合物。

7.根据权利要求1所述的微生物源组合型生物刺激素，其特征在于，所述辅料根据组合型生物刺激素的产品形式而改变，当产品形式呈现为液体状时，辅料为水；当品形式呈现为固体颗粒或者固体粉末时，辅料为粘土、高岭土、滑石、硅藻土、锯末或陶土中的任意一种或几种的组合。

8.根据权利要求1或4所述的微生物源组合型生物刺激素，，其特征在于，所述微生物多糖的制备方法如下：发酵培养基成分包含了碳源、氮源、无机盐和氧载体，其中，碳源浓度为30～50g/L；氮源浓度为2～8g/L；无机盐总浓度为0.5～2.5g/L；氧载体总浓度为0.5～10g/L；发酵过程中，温度为25～32℃，通气强度为0.1～0.8vvm，发酵周期为16～48h，pH为6.5～7.5。

9.权利要求1-8任一项所述的微生物源组合型生物刺激素的制备方法，其特征在于，在聚谷氨酸或泛菌多糖中的至少一种存在的条件之下，通过调整聚谷氨酸、氨基寡糖素、微生物多糖、γ-氨基丁酸及辅料的配比进行调配混合得到。

10.权利要求1-8任一项所述的微生物源组合型生物刺激素在提高作物的抗病、抗逆能力、促进作物增产上的应用。