CN113501734A - 一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种γ‑聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料，属于肥料技术领域。所述水溶肥料的组分包括γ‑PGA发酵液、黄腐酸、壳寡糖、尿素、磷酸二氢钾、苯甲酸钠和水。制备γ‑PGA发酵液的两株γ‑PGA产生菌地衣芽孢杆菌产生菌均具有解磷和固氮的能力，使用未除去菌体的聚谷氨酸发酵原液配制成本发明的水溶肥料，使环境当中的氮元素和磷元素供作物加以利用，让作物得以吸收。本发明的水溶肥料缓释性能良好，可促进农作物生长和防治土传真菌、细菌病害。

Description

一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料
技术领域
本品属于肥料技术领域，具体涉及一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料及其制备方法。
背景技术
当下农业绿色发展已成为主旋律，在国家农药化肥“双减”及“零”增长的背景下，发展新型肥料增效剂是大环境的需要，更是时代的需要，也是农资行业未来的发展趋势，于肥料中添加合适的肥料增效剂在保障农业丰产增收，维护生态和谐，减少化肥使用等方面均具有重要的作用与意义。
γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，简称γ-PGA），是一种新型可生物降解的水溶性髙分子材料，其优良的性能已经在医药、日化、轻工和食品等许多领域得以应用，随着研究的深入，γ-PGA在农业中的应用也逐渐崭露头角，γ-聚谷氨酸能将土壤中的钙镁等金属阳离子固定在根系附近，增大根系营养吸收效率，促进根系快速生长。
壳寡糖（Chitosan），又称脱乙酰甲壳素、可溶性甲壳素、壳糖胺等。壳寡糖能改变土壤菌群, 促进有益微生物的生长。能诱导植株产生免疫力，可用于防治多种作物的真菌性病害、细菌性病害和病毒病害。对小麦花叶病、棉花黄萎病、水稻稻瘟病、番茄晚疫病等病害具有良好的防治作用。
黄腐酸（Fulvic acid）是一种是从低级别煤中或微生物发酵后的植物废料中提取而来的混合物。主要是芳香族羟基羧酸类物质，还有一定数量的水溶性碳水化合物、蛋白质、氨基酸等物质。其具有促进植物生长，提高植物抗逆能力，增加作物产量和改善品质等诸多效果。
发明内容
本发明的目的在提供一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料，按重量百分比计，包括以下组分：γ-PGA发酵液10-20％、黄腐酸钾10-20％、壳寡糖1-4％、尿素12-19％、磷酸二氢钾1-8％、苯甲酸钠0.5-1.5％和水27.5%-65.5%。
上述γ-PGA发酵液的制备方法，包括以下步骤：
（1）斜面培养：取甘油管保藏的地衣芽孢杆菌WX-02和地衣芽孢杆菌DYF7-02，分别涂布于PDA斜面培养基上，30℃培养24-48h，至菌体生长对数期；
（2）混合菌悬液制备：使用生理盐水将两种地衣芽孢杆菌斜面上的菌落洗脱制成1011-1013/ml的菌悬液，按体积比1∶1混合制备混合菌悬液；
（3）种子罐发酵：种子培养基灭菌完成并降温至30℃，按10vol%的接种量将混合菌悬液接入种子罐进行种子培养，培养工艺如下：静置10小时后开始15-75r/min搅拌，温度37°空气流量0.1-0.8vvm，当菌体断裂为单体时移种；
（4）发酵培养：发酵培养基灭菌完成并降温至30°，按10vol%的量将种子液接入发酵罐，按以下工艺进行培养：
溶氧控制：①流量：30小时前0.2-0.8vvmm，控制DO不低于30%；②搅拌：60-120r/min ，30小时，控制DO不低于5%；
温度：30℃；
pH控制：氨水控制pH 6.9-7.0；
压力：罐压0.05MPa；
取样：0h、4h、8h、……每4h取样一次，记录pH值、DO值、温度、空气流量、罐压、搅拌转速、运行体积，直到放罐，记录放罐体积；
放罐指标：①还原糖耗尽；②发酵液pH达到7.6以上；放罐后得4wt%含量的γ-PGA发酵液。
所述种子培养基配方：柠檬酸钠15 g/L、氯化钠10 g/L、硝酸钠5 g/L、酵母粉0.5g/L、硫酸铵1 g/L、麦芽糊精20 g/L、葡萄糖15 g/L。
所述发酵培养基配方：谷氨酸钠20 g/L、葡萄糖50 g/L、麦芽糊精50 g/L、氯化钠50 g/L、磷酸氢二钠30 g/L、硝酸钠30 g/L、硫酸镁10 g/L、硫酸锌10 g/L、磷酸氢二钾10g/L、碳酸钙10 g/L、消泡剂0.1g/L、硫酸亚铁0.15 g/L、酵母粉25 g/L。
上述γ-PGA发酵液的制备方法中所述地衣芽孢杆菌WX-02：其分类命名为：Bacillus licheniformis WX-02；已于2008年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：CCTCC NO: M 208065；
所述地衣芽孢杆菌DYF7-02：其分类命名为：Bacillus licheniformis DYF7-02；已于2021年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：CCTCC NO: M 2021817。
上述制备γ-PGA发酵液的两株γ-PGA产生菌地衣芽孢杆菌产生菌WX-02和DYF7-02均具有解磷和固氮的能力，使用未除去菌体的聚谷氨酸发酵原液配制成本发明的水溶肥料，可使环境当中的氮元素和磷元素供作物加以利用，让作物得以吸收。
上述一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料的制备方法包括：按原料组分加入PGA原液和水，1200 r/min开启搅拌，缓慢加入尿素，再依此加入磷酸二氢钾、壳寡糖、黄腐酸，苯甲酸钠，1400 r/min搅拌1.5~2小时使料液均匀混合，即得到γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料。
上述一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料在农业生产中的应用。
本发明的有益效果：
（1）γ-聚谷氨酸具备改良土壤，保肥保水，增加肥效，促进作物生长等诸多功能，壳寡糖则对防治由真菌、细菌、病毒导致的的植物病害具有显著效果。将二者融合，能够保水保肥，促进作物快速生长，同时还能防治多种病害。本配方充分结合了二者优势，减少了施肥和用药的次数，大幅降低了人工成本。本发明将γ-PGA和壳寡糖以及其他活性物质，按照一定比例结合，特制而成的水溶肥，可促进农作物生长和防治土传真菌、细菌病害。
（2）本发明的水溶肥料性能良好，用于叶面喷施，能在表面形成水膜，缓慢释放养分；选用的聚谷氨酸分子量≥3000kda，用于冲施，进入土壤后，与其他产品对比肥效可延长72-120小时，缓释性能良好。
附图说明：
图1. 2株地衣芽孢杆菌在无氮培养基上的生长情况（24h）。A：空白对照，B：WX-02，C：DYF7-02。
图2. 2株地衣芽孢杆菌在无机磷培养基上的生长情况（24h）。A：空白对照，B：WX-02，C：DYF7-02。
图3. 2株地衣芽孢杆菌在无机磷培养基上生长产生的透明圈。A：空白对照，B：WX-02，C：DYF7-02。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，在此发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1 γ-PGA发酵液的制备
（1）菌种：
地衣芽孢杆菌WX-02：其分类命名为：Bacillus licheniformis WX-02；已于2008年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：CCTCC NO: M 208065。
地衣芽孢杆菌DYF7-02：其分类命名为：Bacillus licheniformis DYF7-02；已于2021年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：CCTCC NO: M 2021817。
地衣芽孢杆菌WX-02和地衣芽孢杆菌DYF7-02能在缺氮培养基上生长，生长状况见图1。表明两株地衣芽孢杆菌均具有固氮作用。
地衣芽孢杆菌WX-02和地衣芽孢杆菌DYF7-02能在无机磷培养基上生长，生长状况见图2。
制备地衣芽孢杆菌WX-02和地衣芽孢杆菌DYF7-02的种子液，将其OD600调整为1.000左右，使用移液枪取10μl接种于无机磷培养基上，在28°培养箱静置培养7天，生长状况见图3。地衣芽孢杆菌WX-02及地衣芽孢杆菌DYF7-02透明圈与菌落大小的比值分别为77%、46%。表明两株地衣芽孢杆菌均具有解磷作用。
（2）γ-PGA发酵液的制备方法，包括以下步骤：
（1）斜面培养：取甘油管保藏的地衣芽孢杆菌WX-02和地衣芽孢杆菌DYF7-02分别涂布于PDA斜面培养基上，30℃培养24-48h，至菌体生长至对数期；
（2）混合菌悬液制备：使用生理盐水将两种地衣芽孢杆菌斜面上的菌落洗脱制成1011-1013/ml的菌悬液，按体积比1∶1混合制备混合菌悬液；
（3）种子罐发酵：种子培养基灭菌完成并降温至30℃，按10vol%的接种量将混合菌悬液接入种子罐进行种子培养，培养工艺如下：静置10小时后开始15-75r/min搅拌，温度37℃空气流量0.1-0.8vvm，当菌体断裂为单体时移种；
（4）发酵培养：发酵培养基灭菌完成并降温至30°，按10vol%的接种量将种子液接入发酵罐，按以下工艺进行培养：
溶氧控制：①流量：30小时前0.2-0.8vvmm，控制DO不低于30%；②搅拌60-120r/min，30小时，控制DO不低于5%；
温度：30℃；
pH控制：氨水控制pH 6.9-7.0；
压力：罐压0.05MPa；
取样：0h、4h、8h、……每4h取样一次，记录pH值、DO值、温度、空气流量、罐压、搅拌转速、运行体积，直到放罐，记录放罐体积；
放罐指标：①还原糖耗尽；②发酵液pH达到7.6以上；放罐后得4wt%含量的γ-PGA发酵液。
所述种子培养基配方：柠檬酸钠15 g/L、氯化钠10 g/L、硝酸钠5 g/L、酵母粉0.5g/L、硫酸铵1 g/L、麦芽糊精20 g/L、葡萄糖15 g/L。
所述发酵培养基配方：谷氨酸钠20 g/L、葡萄糖50 g/L、麦芽糊精50 g/L、氯化钠50 g/L、磷酸氢二钠30 g/L、硝酸钠30 g/L、硫酸镁10 g/L、硫酸锌10 g/L、磷酸氢二钾10g/L、碳酸钙10 g/L、消泡剂0.1g/L、硫酸亚铁0.15 g/L、酵母粉25 g/L。
实施例2
一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料：
其配方，按重量百分比计包括：实施例1制备的γ-PGA发酵液10％、黄腐酸10％、尿素19％、壳寡糖1％、磷酸二氢钾1％、苯甲酸钠0.5％和水58.5％。
其制备方法：
检查配制罐是否清洗干净，按上述配方称取聚谷氨酸、黄腐酸、尿素、磷酸二氢钾、苯甲酸钠物料。加入γ-PGA发酵液和水，1200 r/min开启搅拌，缓慢加入尿素，再依次加入磷酸二氢钾，壳寡糖、黄腐酸，苯甲酸钠，1400 r/min搅拌1.5小时使料液均匀混合，即得到γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料。
实施例3
一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料：
其配方，按重量百分比计包括：实施例1制备的γ-PGA发酵液20％、黄腐酸20％、壳寡糖4％、尿素12％、磷酸二氢钾8％、苯甲酸钠1.5％和水34.5％。
其制备方法：
检查配制罐是否清洗干净，按上述配方称取聚谷氨酸、黄腐酸、壳寡糖、尿素、磷酸二氢钾、苯甲酸钠等物料。加入γ-PGA发酵液和水，1200 r/min开启搅拌，缓慢加入尿素，再依次加入磷酸二氢钾、壳寡糖、黄腐酸、苯甲酸钠，1400 r/min搅拌2.0小时使料液均匀混合。即得γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料。
实施例4
一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料：
其配方，按重量百分比计包括：实施例1制备的γ-PGA发酵液15％、黄腐酸15％、壳寡糖2％、尿素14％、磷酸二氢钾6％、苯甲酸钠1％和水47％。
其制备方法：
检查配制罐是否清洗干净，按上述配方称取聚谷氨酸、黄腐酸、壳寡糖、尿素、磷酸二氢钾、苯甲酸钠等物料。加入γ-PGA发酵液和水，1200 r/min开启搅拌，缓慢加入尿素，再依次加入磷酸二氢钾、壳寡糖、黄腐酸、苯甲酸钠，1400 r/min搅拌1.8小时使料液均匀混合。即得γ聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料。
实施例4 地衣芽孢杆菌WX-02和DYF7-02发酵液对豌豆苗根系生长的影响。
地衣芽孢杆菌WX-02 γ-PGA发酵液和地衣芽孢杆菌DYF7-02 γ-PGA发酵液的制备方法与实施例1中γ-PGA发酵液的制备方法相同。
将豌豆种子浸泡到温水中，大约浸泡10小时。将泡发好的种子均匀平铺于定植篮上，用湿纸巾盖上，放置阴凉、干燥的地方催芽，等待生长，待根长到3cm。按表1配制不同的营养液进行处理，每个处理进行三个重复。以大量元素水溶肥20-20-20（购自山东农大肥业科技有限公司）为底肥，加入地衣芽孢杆菌WX-02 γ-PGA发酵液或/和地衣芽孢杆菌DYF7-02 γ-PGA发酵液，分别配制培养液，加入下层容器当中。观察豌豆根系及茎叶生长情况并记录。培养20天后剪下各配方的豌豆根系及茎叶称重并记录，并将茎叶及根系置鼓风干燥箱干燥后称重并记录。具体见表1。
表1 不同处理对豌豆苗根茎增长情况
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表1结果表明不同浓度γ-PGA（WX-02）与（DYF7-02）单独施用均能促进豌豆苗茎杆及根系的生长。PGA发酵液（单独、组合）对茎杆、根系鲜干重的增长与浓度呈正相关。不同浓度的两种PGA发酵液组合对茎杆、根系鲜干重的增长优于单一菌株发酵液的处理。
实施例5 一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料在小油菜上的肥效试验
(1)试验时间和地点：2019年9月19日至2019年11月8月；河北省石家庄市廉州镇西垒下村。
试验方案和方法
试验地基本情况：土壤类型：潮褐土；土壤质地：轻壤；前茬作物：油麦菜；前茬作物亩施肥量：底施猪粪3000千克。前茬作物产量：2000千克/亩。试验田土壤养分状况见表2。
表2 试验田土壤养分状况表
Figure 769528DEST_PATH_IMAGE002
供试肥料：实施例2制备的一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料。
供试作物：小白菜，品种：夏美青梗菜。
试验设计：本试验设3个处理，4次重复，采用完全随机区组设计。小区面积5米×6米=30平方米。
试验处理：处理1：常规施肥；处理2：常规施肥+供试肥料；处理3：常规施肥+等量清水；其它田间管理措施相同。
施用方法：定植后开始叶面喷施，每亩每次60毫升兑水30千克，每次间隔7天，连续喷施3次。
施用时间：2019年10月1日、10月8日、10月15日。
田间管理：试验田露地小油菜于2019年9月18日整地施肥，亩底施史丹利复合肥25千克，9月19日播种，生长期间浇水2次，追肥一次，亩追氢氨50千克。于10月1日、10月8日、10月15日分3次喷施含氨基酸水溶肥料，11月8日收获。
（3）调查记载与结果分析
1）不同处理对小油菜的生物学性状的影响：
试验田露地小油菜喷施实施例2制备的一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料后，叶色浓绿，叶片厚绿。
2）不同处理对小油菜产量影响，见表3：
表3小区产量统计表（产量单位：千克/30平方米）
Figure DEST_PATH_IMAGE003
上表所示，试验田露地小油菜在常规施肥基础上喷施实施例2制备的一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料比常规施肥增产131.17千克，增产率6.57%；比常规施肥基础上喷施等量清水亩增产129.51千克，增产率6.48%，增产效果极显著。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (5)

1.一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料，其特征在于：按重量百分比计，包括以下组分：γ-PGA发酵液10-20％、黄腐酸10-20％、壳寡糖1-4％、尿素12-19％、磷酸二氢钾1-8％、苯甲酸钠0.5-1.5％和水27.5-65.5％。
2.根据权利要求1所述的一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料，其特征在于：所述γ-PGA发酵液的制备方法，包括以下步骤：
（1）斜面培养：取甘油管保藏的地衣芽孢杆菌WX-02和地衣芽孢杆菌DYF7-02，分别涂布于PDA斜面培养基上，30℃培养24-48h，至菌体生长对数期；
（2）混合菌悬液制备：使用生理盐水将两种地衣芽孢杆菌斜面上的菌落洗脱制成1011-1013/ml的菌悬液，按体积比1∶1混合得到混合菌悬液；
（3）种子罐发酵：种子培养基灭菌完成并降温至30℃，按10vol%的接种量将混合菌悬液接入种子罐进行种子培养，培养工艺如下：静置10小时后开始15-75r/min搅拌，温度37°空气流量0.1-0.8vvm，当菌体断裂为单体时移种；
（4）发酵培养：发酵培养基灭菌完成并降温至30℃，按10vol%的接种量将种子液接入发酵罐，按以下工艺进行培养：
溶氧控制：①流量：30小时前0.2-0.8vvmm，控制DO不低于30%；②搅拌：60-120r/min，30小时，控制DO不低于5%；
温度：30℃；
pH控制：氨水控制pH 6.9-7.0；
压力：罐压0.05MPa；
取样：0h、4h、8h、……每4h取样一次，记录pH值、DO值、温度、空气流量、罐压、搅拌转速、运行体积，直到放罐，记录放罐体积；
放罐指标：①还原糖耗尽；②发酵液pH达到7.6以上；放罐后得4wt%含量的γ-PGA发酵液。
3.根据权利要求2所述的水溶肥料，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌WX-02：其分类命名为：Bacillus licheniformis WX-02；已于2008年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：CCTCC NO: M 208065；
所述地衣芽孢杆菌DYF7-02：其分类命名为：Bacillus licheniformis DYF7-02；已于2021年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：CCTCC NO: M 2021817。
4.权利要求1所述的一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料的制备方法，其特征在于：按原料组分加入PGA原液和水，1200 r/min开启搅拌，缓慢加入尿素，再依此加入磷酸二氢钾、壳寡糖、黄腐酸，苯甲酸钠，1400 r/min搅拌1.5~2小时使料液均匀混合，即得到γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料。
5.权利要求1所述的一种γ-聚谷氨酸、壳寡糖组合的水溶肥料在农业生产中的应用。
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