CN107502585A

CN107502585A - 一株高效合成聚‑γ‑谷氨酸的地衣芽孢杆菌工程菌

Info

Publication number: CN107502585A
Application number: CN201710796200.6A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Wuhan Junan Biological Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Junan Biological Technology Co ltd
Priority date: 2017-09-06
Filing date: 2017-09-06
Publication date: 2017-12-22

Abstract

一株高效合成聚‑γ‑谷氨酸的地衣芽孢杆菌工程菌，属于微生物代谢工程领域。本发明采用常规的分子生物学技术，在实验室保存的地衣芽孢杆菌WX‑02的基础上，通过外源强化表达双组份调控因子degU，得到了一株可以在无外源谷氨酸添加的情况下，高效合成聚‑γ‑谷氨酸的地衣芽孢杆菌工程菌株WX‑02/pHY‑degU。进行液体发酵验证，发酵终点的聚‑γ‑谷氨酸浓度达到了32.78g/L，与原始菌株地衣芽孢杆菌WX‑02相比提高了47.59%，聚‑γ‑谷氨酸的合成能力显著增强。该菌株于2016年5月27日保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M2016294。

Description

一株高效合成聚-γ-谷氨酸的地衣芽孢杆菌工程菌

技术领域

一株高效合成聚-γ-谷氨酸的地衣芽孢杆菌工程菌，属于微生物代谢工程领域。

背景技术

聚-γ-谷氨酸是一种主要由微生物合成的阴离子型高分子聚合物，其具有可食用性、絮凝性、保湿性和生物降解性等特点，在食品、医药、环保、化妆品和农业等领域有着广泛的应用价值，受到了国内外研究者的高度重视。

聚-γ-谷氨酸主要由微生物产生，并且大多属于芽孢杆菌属，其中地衣芽孢杆菌因其易于培养和生物安全性等特点，受到了国内外研究者的广泛关注。然而地衣芽孢杆菌从葡萄糖直接合成聚-γ-谷氨酸（从头合成）的能力较弱，为提高聚-γ-谷氨酸的产率，目前聚-γ-谷氨酸的发酵培养基中需添加大量外源谷氨酸，这直接导致了聚-γ-谷氨酸的发酵成本过高，严重制约着其规模化生产。如果能实现菌株从葡萄糖到聚-γ-谷氨酸的高效从头合成，将极大的降低发酵成本，推动其工业化生产。

聚-γ-谷氨酸合成酶基因的转录是调控聚-γ-谷氨酸合成的关键过程。聚-γ-谷氨酸合成酶操纵子基因包括pgsB、pgsC、pgsA、pgsE，双组分调控系统DegS/U和ComA/P是调控聚-γ-谷氨酸合成的关键调控系统。研究发现pgs操纵子的充分激活需要磷酸化的DegU和SwrA相互协调作用，并由DegU-P直接与pgsB上游的-35区结合，启动pgs操纵子的转录。

我们前期做了地衣芽孢杆菌WX-02发酵聚-γ-谷氨酸的50L罐小试研究，探索了碱胁迫对菌体合成聚-γ-谷氨酸的影响，当培养基中不添加外源谷氨酸时，非胁迫组发酵终点聚-γ-谷氨酸的浓度为20.4g/L，碱胁迫组聚-γ-谷氨酸的产量达到了36.26g/L，并且单位菌体聚-γ-谷氨酸合成能力由3.92g/g_DCW提高到了 8.82g /g_DCW，提高了125%。对关键基因转录水平分析发现，碱胁迫组双组份调控因子degU显著上调，和对照组相比提高了3.0倍。以上内容为我们利用分子生物学手段对菌株进行基因改造提供了理论依据，为构建高效从头合成聚-γ-谷氨酸的基因工程菌株指明了方向。

发明内容

本发明提供了一株可以在无外源谷氨酸添加的情况下高效合成聚-γ-谷氨酸的地衣芽孢杆菌工程菌(保藏编号为CCTCC NO：M2016294)。通过将携带双组份调控因子degU的表达载体转入地衣芽孢杆菌WX-02，获得了可以高效合成聚-γ-谷氨酸的工程菌株地衣芽孢杆菌WX-02/pHY-degU(Bacillus licheniformis WX-02/pHY-degU)，该菌株于2016年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2016294。其在之后的液体发酵过程中，可以不依赖外源谷氨酸的添加高效合成聚-γ-谷氨酸，发酵终点产量达到了32.78g/L。

技术路线

高效合成聚-γ-谷氨酸的地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法如下：

1. 双组份调控因子degU强化表达载体中表达元件的克隆

（1）以枯草芽孢杆菌168的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出P43启动子，引物为P43-F/R。

（2）以地衣芽孢杆菌WX-02的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出双组份调控因子degU和淀粉酶基因amyL的终止子序列，引物分别为degU- F/R，TamyL-F/R。

双组份调控因子degU强化表达载体的构建

（1）通过SOE-PCR方法将P43启动子、双组份调控因子degU及淀粉酶基因amyL的终止子片段连接到一起，引物为P43-F，TamyL-R。

（2）以实验室保存的表达质粒pHY300PLK为初始载体，进行BamHI/XbaI双酶切，并与同样经过BamHI/XbaI双酶切的SOE-PCR融合片段进行酶连反应，酶连产物随后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选转化子进行菌落PCR验证，挑取PCR验证正确的转化子接种至含有5 mL LB培养基的PA瓶中（含有50 ug/mL氨苄青霉素），抽质粒并测序。

地衣芽孢杆菌WX-02/pHY-degU的构建

将构建好的双组份调控因子degU强化表达载体转化地衣芽孢杆菌WX-02。首先制备地衣芽孢杆菌WX-02的感受态细胞，在平板上活化菌种，然后接种至含有5 mL LB的PA瓶中，37℃过夜培养，随后以5%的接种量转接至50ml生长培养基中，37 ℃，240 r/min培养至 OD₆₀₀达到2.2，5500 r/min离心6 min收集菌体，用洗涤培养基重悬菌体，5500 r/min离心6 min，重复三次后加入1 mL洗涤培养基重悬菌体，分装至1.5 mL的无菌EP管中，每管100 ul，-80℃保存。

将吹干后的电转杯在冰上预冷15 min，然后将100 ul的地衣芽孢杆菌WX-02感受态细胞与10 ul重组载体混匀后加入预冷电转杯中，以2.2kV的电压进行电击，电击时间4.8-5.2ms，随后立即加入900ul恢复培养基并转移至1.5 mLEP管中。37 ℃，100r/min培养3h后涂LB平板（含有20 ug/mL的四环素）。待长出转化子后挑取单菌落进行菌落PCR验证和抽质粒测序验证，验证正确后保存菌种。验证引物为pHY300-F/R。

地衣芽孢杆菌WX-02/pHY-degU的发酵实验

在LB平板上活化菌种，接种至含有50 mL液体LB的250 mL三角瓶中，37 ℃、240 r/min培养9 h，随后以3%的接种量接种至发酵培养基中，37 ℃、240 r/min培养36 h。

发酵液中聚-γ-谷氨酸的浓度测定

采用凝胶渗透色谱法测定发酵液中的聚-γ-谷氨酸浓度，首先制作聚-γ-谷氨酸的标准曲线，然后参照标准曲线计算出发酵液中聚-γ-谷氨酸的浓度。

凝胶渗透色谱检测条件为：采用TSK Gel G6000 PWXL凝胶渗透色谱柱，检测波长220nm，进样量10ul，流动相为25 mM的无水硫酸钠和乙腈的混合液，体积比为8:1，流速0.5mL/min。

附图说明

图1为双组份调控因子degU强化表达载体的质粒图谱

以表达质粒pHY300PLK为原始质粒，在其基础上加入来源于枯草芽孢杆菌168的启动子P43，来源地衣芽孢杆菌WX-02的双组份调控因子degU及来源于地衣芽孢杆菌WX-02中淀粉酶基因amyL的终止子，构建了重组质粒pHY-degU。

图2为双组份调控因子degU强化表达载体中表达元件的琼脂糖凝胶电泳图谱

泳道1为来源于枯草芽孢杆菌168中启动子P43的片段条带（305 bp）；

泳道2为来源于地衣芽孢杆菌WX-02双组份调控因子degU的片段条带（690 bp）；

泳道3为来源于地衣芽孢杆菌WX-02中淀粉酶基因amyL的终止子片段条带（501 bp）；

泳道4为以上三个表达元件的SOE-PCR融合片段条带；

泳道M为5K DNA marker（从上到下依次为：5000 bp，3000 bp，2000 bp，1500 bp，1000bp，750bp，500 bp，250 bp，100 bp）。

图3为重组强化表达载体转化地衣芽孢杆菌WX-02菌落PCR验证图谱

泳道1为用验证引物pHY-F/ R进行菌落PCR验证条带（1734 bp）；

泳道M 为5K marker（从上到下依次为：5000 bp，3000 bp，2000 bp，1500 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp）。

具体实施方法

结合以下实例，对本发明进行进一步说明：

实例1双组份调控因子degU强化表达载体中表达元件的克隆

根据NCBI公布的枯草芽孢杆菌168的基因组序列，采用PCR的方法扩增出启动子P43基因片段。引物分别为：

P43-F：CGGGATCCCG TGATAGGTGGTATGTTTTCG

P43-R：ATTACAATATTTACTTTAGTCACTCATGTGTACATTCCTCTC

根据NCBI公布的地衣芽孢杆菌WX-02基因组序列，采用PCR的方法扩增出淀粉酶基因amyL的终止子片段。引物如下：

TamyL-F：ACGGCTGGGTAGAAATGAGATAAAAGAGCAGAGAGGACGGATT

TamyL-R：GCTCTAGAGCCGCAATAATGCCGTCGCACTG

PCR扩增体系如下：

5×TransStart^® FastPfu缓冲液	5 μL
		dNTPs (2.5 mmol/L)	2.5 μL
上游引物(10 mol/L)	1.0 μL
		下游引物(10 mol/L)	1.0 μL
模板DNA	0.5 μL
		TransStart^® FastPfu DNA聚合酶	0.5 μL
加去离子水至总体系	25.0 μL

PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 sec，55 ℃ 30 sec，72 ℃ 1 min，30个循环；72℃延伸10 min；10 ℃保温。

实例2双组份调控因子degU强化表达载体的构建

（1）以实例1中扩增出的强化表达元件为模板，通过SOE-PCR方法，将P43启动子、双组份调控因子degU及淀粉酶基因amyL的终止子片段连接在一起。引物为：

P43-F：CGGGATCCCG TGATAGGTGGTATGTTTTCG

TamyL-R：GCTCTAGAGCCGCAATAATGCCGTCGCACTG

SOE-PCR扩增体系如下：

5×TransStart^® FastPfu缓冲液	5.0 μL
		dNTP (2.5 mmol/L)	2.5 μL
上游引物(10 mol/L)	1.0 μL
		下游引物(10 mol/L)	1.0 μL
模板1	0.5 μL
		模板2	0.5 μL
模板3	0.5 μL
		TransStart® FastPfu DNA聚合酶	0.5 μL
加去离子水至总体系	25.0 μL

SOE-PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 sec，55 ℃ 30 sec，72 ℃ 2 min，7个循环；72 ℃延伸10 min（不加引物）；在反应体系中加入引物进行以下反应程序：95 ℃ 30sec，55 ℃ 30 sec，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min；10 ℃保温。

（2）以实验室保存的表达质粒pHY300PLK为初始载体，进行BamHI/XbaI双酶切，并与同样经过BamHI/XbaI双酶切的SOE-PCR融合片段进行酶连反应，酶连产物随后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选转化子进行菌落PCR验证，将PCR验证正确的转化子接种至含有5mL LB培养基的PA瓶中（含有50 ug/mL的氨苄青霉素），抽提质粒并测序。

酶切体系如下：

BamHI	2.5 μL
		XbaI	2.5 μL
10×K buffer	2.5 μL
		pHY300PLK/SOE-PCR融合片段	15 μL
加去离子水至总体系	50.0 μL

酶切温度为30℃，时间12小时。

酶连体系如下：

pHY300PLK质粒双酶切回收产物	1.0 μL
		SOE-PCR融合片段双酶切回收产物	3.0 μL
T₄ DNA ligase	0.5 μL
		加去离子水至总体系	10.0 μL

酶连温度为16℃，时间12小时。

大肠杆菌感受态的制备方法如下：

①接种-80°C冻藏的大肠杆菌菌种于5ml LB培养基进行种子活化，于37℃、240 r/min震荡过夜培养；

②将步骤①中获得的菌液以体积比1%接种于50 mL LB培养基，37°C、240 r/min震荡培养3 h扩增菌体；

③将步骤②中获得的菌液冰浴10 min，4℃、5000 r/min离心3 min收集菌体；

④利用20 mL预冷的CaCl₂溶液(0.1 mol/L)洗涤菌体，4℃、5000 r/min离心3 min收集菌体；

⑤用1.5 mL预冷的CaCl₂溶液 (0.1 mol/L)重悬菌体，并分装于无菌的1.5mL离心中，每管100μL，即获得大肠杆菌感受态细胞，置-80 ℃保存备用。

大肠杆菌的转化方法如下：

①取100 μL大肠杆菌感受态细胞与重组质粒pHY300degU于离心管中混合，冰上吸附15min；

②经步骤①处理后，将离心管置于42 ℃循环水中热击90s，并迅速转至冰上冰浴5min；

③冰浴后，加入900 μL LB培养基，37 ℃，150 r/min培养45 min；

④离心收集菌体，并将其均匀涂布与LB平板（含有50 ug/mL的氨苄青霉素）表面，37℃培养16 h，可长出单菌落；

⑤挑取单菌落平板划线，置于37 ℃培养12h，进行菌落PCR验证，挑取 PCR验证正确的转化子接种至含有5 mL LB培养基（含有50 ug/mL氨苄青霉素）的PA瓶中扩增菌体，抽提质粒并测序。

实例3地衣芽孢杆菌WX-02/pHY-degU的构建

首先制备地衣芽孢杆菌WX-02的感受态细胞，然后将构建成功的pHY300degU强化表达质粒转化地衣芽孢杆菌WX-02感受态细胞，即得到可高效表达聚-γ-谷氨酸的地衣芽孢杆菌WX-02/pHY-degU菌株。

地衣芽孢杆菌WX-02感受态细胞制备方法如下：

① 接种地衣芽孢杆菌WX-02于5mL的LB培养基中，37℃，240 r/min过夜培养；

② 以5%的接种量转接至生长培养基中，37 ℃，240 r/min培养至OD₆₀₀达到2.2；

③ 将菌液置于冰上预冷15min， 4℃、5500 r/min离心6 min，收集菌体；

④ 用30ml洗涤培养基重悬菌体，5500 r/min离心6 min，重复三次；

⑤ 加入1 mL洗涤培养基重悬菌体，分装至无菌的1.5 mLEP管中，每管100ul，即为地衣芽孢杆菌WX-02感受态细胞，-80 ℃保存。

电转化方法如下：

①电转杯吹干预冷，然后将100 ul的地衣芽孢杆菌WX-02感受态细胞与10 ul重组载体混匀，加入预冷电转杯中；

②以2.2kV的电压进行电击，电击时间4.8-5.2ms；

③加入900ul恢复培养基并转移至1.5 mLEP管中，37 ℃培养3h；

④将经步骤③处理获得的菌液涂在布含四环素的LB平板，过夜培养。

⑤待长出转化子后挑取单菌落进行菌落PCR验证，并抽提质粒进行测序验证，验证正确后保存菌种。

实例4地衣芽孢杆菌WX-02/pHY-degU的发酵实验

种子培养基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母浸粉，10 g/L氯化钠 pH7.2 - 7.4

种子培养方法：250 mL三角瓶装液量为50 mL，37 ℃ 、240r/min培养9h。

发酵培养基：葡萄糖 80 g/L，柠檬酸钠 30 g/L，硝酸钠 15 g/L，氯化铵 8 g/L，三水合磷酸氢二钾1 g/L，七水合硫酸镁 1 g/L，七水合硫酸锌 1 g/L，无水氯化钙1 g/L，一水合硫酸锰 0.15 g/L，pH 7.0-7.2。

发酵培养方法：接种量为3%，250 mL三角瓶装液量为50 mL，37 ℃、240r/min培养36h。

实例5发酵液中聚-γ-谷氨酸的浓度测定

采用凝胶渗透色谱法测定发酵液中聚-γ-谷氨酸浓度，首先制作聚-γ-谷氨酸标准品的标准曲线，然后参照标准曲线计算出发酵液中聚-γ-谷氨酸的浓度。

聚-γ-谷氨酸标准曲线的制作方法：

首先配置不同浓度的聚-γ-谷氨酸标准品溶液：0.2g/L，0.4 g/L，0.6 g/L，0.8 g/L，1.0 g/L，1.2 g/L，1.4 g/L，1.6 g/L，经0.22um水相滤膜过滤后进行凝胶渗透色谱检测，根据标准品溶液的峰面积和标准品溶液浓度得到聚-γ-谷氨酸标准曲线。

发酵液中聚-γ-谷氨酸浓度的检测方法：

利用去离子水将发酵液稀释30倍，离心除菌体，再经0.22um水相滤膜过滤后进行凝胶渗透色谱检测，得到样品的峰面积，参照聚-γ-谷氨酸标准曲线计算出样品中的聚-γ-谷氨酸浓度。

凝胶渗透色谱检测条件为：

采用TSK Gel G6000 PWXL凝胶渗透色谱柱，检测波长220nm，进样量10ul，流动相为25mM的无水硫酸钠和乙腈的混合液，体积比为8:1，流速0.5 mL/min。

序列表

<110> 武汉骏安生物科技有限公司

<120> 一株高效合成聚-γ-谷氨酸的地衣芽孢杆菌工程菌

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1495

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌WX-02/pHY-degU(Bacillus licheniformis WX-02/pHY-degU)

<400> 1

tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60

taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120

tttgcgtttt taccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180

aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240

gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300

atgagtgact aaagtaaata ttgtaattat tgacgatcat cagttattcc gtgaaggtgt 360

caaacggatt ttggatttcg aacctacctt tgaggtagtg gccgaaggag acgacggaga 420

tgaagcggct cgcattgtcg agcactacca tcctgatgtt gttatcatgg atattaatat 480

gccgaatgtg aacggagtag aagcgacaaa acaactggtc gacttgtatc cggaatcaaa 540

ggttattatt ttatccatcc atgatgacga aaactatgtt acacatgcat taaaaacagg 600

agcccggggc tatctgctga aagaaatgga tgccgatacg ctgatcgaag ccgtgaaagt 660

agtagctgaa ggcggatctt atctgcatcc taaggttaca cacaatcttg tgaatgaatt 720

ccgccgtctt gcaacaagcg gtgtatcatc tcacgctcag catgaggtgt atccggaaat 780

ccggagacct cttcacattc tcacaagaag ggaatgcgag gtactgcaga tgctggcgga 840

tggaaaaagc aaccgcggaa tcggcgaatc attatttatc agtgaaaaaa cggttaaaaa 900

ccatgtcagc aacatccttc aaaaaatgaa tgtaaacgac agaacgcagg ctgttgttgt 960

agccattaaa aacggctggg tagaaatgag ataaaagagc agagaggacg gatttcctga 1020

aggaaatccg tttttttatt ttgcccgtct tataaatttc tttgattaca ttttataatt 1080

aattttaaca aagtgtcatc agccctcagg aaggacttgc tgacagtttg aatcgcatag 1140

gtaaggcggg gatgaaatgg caacgttatc tgatgtagca aagaaagcaa atgtgtcgaa 1200

aatgacggta tcgcgggtga tcaatcatcc tgagactgtg acggatgaat tgaaaaagct 1260

tgttcattcc gcaatgaagg agctcaatta tataccgaac tatgcagcaa gagcgctcgt 1320

tcaaaacaga acacaggtcg tcaagctgct catactggaa gaaatggata caacagaacc 1380

ttattatatg aatctgttaa cgggaatcag ccgcgagctg gaccgtcatc attatgcttt 1440

gcagcttgtc acaaggaaat ctctcaatat cggccagtgc gacggcatta ttgcg 1495

Claims

1.本发明在实验室保存菌株地衣芽孢杆菌WX-02的基础上，强化表达其双组份调控因子degU，将构建成功的含有P43强启动子、degU基因和TamyL终止子的高表达载体，转化地衣芽孢杆菌WX-02，得到了高效合成聚-γ-谷氨酸的代谢工程菌株地衣芽孢杆菌WX-02/pHY-degU，该菌在随后的液体发酵过程中，聚-γ-谷氨酸的产量显著提高，达到了32.78g/L。

2.根据权利要求1中表述的地衣芽孢杆菌WX-02，该菌保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M208065。

3.根据权利要求1中表述的地衣芽孢杆菌WX-02/pHY-degU，该菌保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M2016294。

4.根据权利要求1中所表述的关于地衣芽孢杆菌WX-02/pHY-degU的发酵，其特征在于：

（1）出发菌株：地衣芽孢杆菌WX-02/pHY-degU；

（2）种子培养：

种子培养基为LB培养基：10 g/L蛋白胨，5 g/L 酵母浸出粉，10 g/L氯化钠，pH 7.0-7.2；固体培养基加琼脂 18 g/L；

种子培养条件：培养温度为37 ℃，250 mL三角瓶中装液量为50 mL，摇床转速240r/min，培养时间为9h；

（3）液体发酵培养：

液体发酵培养基：葡萄糖60-100 g/L，柠檬酸钠10-30 g/L，硝酸钠5-15 g/L，氯化铵5-10 g/L，三水合磷酸氢二钾0.5-1.5 g/L，七水合硫酸镁0.5-1.5 g/L，七水合硫酸锌0.5-1.5 g/L，无水氯化钙0.5-1.5 g/L，一水合硫酸锰0.10-0.5 g/L，pH 7.0-7.2；

液体发酵培养条件：发酵温度为37 °C，250 mL三角瓶中装液量50 mL，接种量3%，摇床转速240 r/min，发酵周期36 h。

5.根据权利要求1中所表述强化表达双组份调控因子degU后得到工程菌株地衣芽孢杆菌WX-02/pHY-degU，其发酵终点的聚-γ-谷氨酸浓度为32.78g/L，原始菌株地衣芽孢杆菌WX-02的产量为22.21g/L，与原始菌株地衣芽孢杆菌WX-02相比提高了47.59%，聚-γ-谷氨酸合成能力显著增强。