CN109504635B - 利用地衣芽孢杆菌发酵生产纳米硒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供利用地衣芽孢杆菌发酵生产纳米硒的方法。本发明采用改良的发酵培养基和发酵工艺，大大提高了地衣芽孢杆菌(特别是菌株S13)生物合成纳米硒的产量和转化率，大幅度缩短发酵时间，显著提高了生物纳米硒的生产效率。具体来讲，地衣芽孢杆菌S13在5mM初始亚硒酸钠浓度下，生物纳米硒产量可提高至5mM，比已有方法提高了1.2倍，发酵时间由48h缩短至12h；在10mM初始亚硒酸钠浓度下，纳米硒产量可提高至9.6mM，比已有方法提高了4倍，发酵时间由48h缩短至24h。将本发明方法用于生物纳米硒的工业化制备，应用前景广阔。

Description

利用地衣芽孢杆菌发酵生产纳米硒的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及利用地衣芽孢杆菌发酵生产纳米硒的方法。
背景技术
硒是人和动物必需的微量元素，是构成哺乳动物体内包括谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还原蛋白酶等在内的25种含硒蛋白和含硒酶的重要组成成分。研究表明，克山病、大骨节病、心血管疾病、癌症、肝病、糖尿病和生殖系统疾病等多种疾病均与缺硒有关。动物体硒元素主要来自膳食摄入，我国是世界上缺硒严重的国家之一，居民膳食硒摄入不足现象突出，根据《中国居民营养与慢性病状况报告(2015)》，2012年我国居民人均膳食硒摄入量只有44.6μg/d，远低于中国营养学会推荐的60-250μg/d的范围。而硒的安全剂量范围较窄，过量摄入会导致硒中毒。与亚硒酸钠、硒酵母、硒氨基酸等补充剂相比，纳米级别的单质硒毒性小，且具有显著的生物活性，是一种新型安全高效的硒补充剂。
纳米硒的合成主要有化学合成法和生物合成法两种，生物合成的纳米硒耐高温、稳定性更好，不易转化为无活性的黑色单质硒。又以微生物合成生物纳米硒最具开发潜力，研究发现，多种微生物都具有转化无机硒为低毒红色纳米硒的能力，如肠杆菌属(Enterobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、根瘤菌属(Rhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、伯克氏菌属(Burkholderia)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、链霉菌属(Streptomyces)等。其中，芽孢杆菌易于发酵生产，地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌等多种菌又是动物的益生菌，作为微生态制剂在养殖、医药上广泛应用，安全性高，是大规模生产生物纳米硒的重要菌种。但是现有技术条件下，芽孢杆菌合成生物纳米硒的产量比较低，硒的添加又导致菌体生长慢、发酵时间延长。因此，如何发挥现有菌种的潜力，提高纳米硒产量、缩短发酵时间、降低发酵成本，是生物纳米硒产业化过程中首先需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单高效的利用地衣芽孢杆菌发酵生产纳米硒的方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种地衣芽孢杆菌发酵培养基，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖5-25g/L或淀粉质碳源10-45g/L、酵母提取物5-25g/L、大豆蛋白胨5-25g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
优选地，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖10-20g/L或淀粉质碳源40-45g/L、酵母提取物10-20g/L、大豆蛋白胨10-20g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
其中，所述淀粉质碳源选自玉米粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉或其它可溶性淀粉中的至少一种。
第二方面，本发明提供所述发酵培养基在地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)S13发酵生产纳米硒中的应用。
地衣芽孢杆菌S13可参见ZL201610946282.3，菌株S13的保藏编号为CGMCCNo.11742。菌株S13可通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)获得。
第三方面，本发明提供利用地衣芽孢杆菌发酵生产纳米硒的方法，包括以下步骤：
S1、菌种活化；
S2、种子液的制备；
S3、纳米硒发酵：将S2的种子液接入所述发酵培养基中，加入亚硒酸盐溶液(过滤灭菌或单独高温灭菌，母液浓度1M)，使发酵体系中亚硒酸盐的终浓度在5-100mM，进行发酵培养，发酵结束后，从发酵产物中分离纯化纳米硒。
前述方法中，S3的发酵条件为：温度35-38℃，转速150-250rpm，通气量0.5-1.5vvm，发酵时间24-72h。发酵时间取决于培养基中所使用的碳源，当碳源为葡萄糖时，发酵时间为24h左右；若使用淀粉质碳源，发酵时间为72h左右。
优选地，按2-5％v/v的接种量将种子液接入装有所述发酵培养基的摇瓶或发酵罐中，摇瓶装液量为20-30％，发酵罐装液量不超过80％。
S1具体为：用SOC培养基对地衣芽孢杆菌进行活化培养，SOC培养基的配方为：胰蛋白胨16g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，氯化钾2.5mM，氯化镁10mM，葡萄糖20mM，琼脂15g/L，pH 7.0-7.2；将地衣芽孢杆菌接种于SOC培养基斜面上，37℃培养48h。
S2具体为：用SOB液体培养基进行种子培养，SOB液体培养基的配方为：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，氯化钾2.5mM，氯化镁10mM，pH 7.0-7.2；将S1活化好的地衣芽孢杆菌用无菌生理盐水配制成108CFU/mL的菌悬液，以1％v/v的接种量接种于SOB液体培养基中，37℃、150-250rpm振荡培养4-8h。
在本发明的一个具体实施方式中，利用地衣芽孢杆菌高效合成生物纳米硒的发酵工艺包括以下步骤：
1)菌种活化，同上述S1所述；
2)种子液的制备：将S1活化好的地衣芽孢杆菌用无菌生理盐水配制成108CFU/mL的菌悬液，以1％v/v的接种量接种于SOB液体培养基中，37℃、150rpm振荡培养8h；
3)纳米硒发酵：将2)的种子液按2％v/v的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，装液量65％，加入亚硒酸盐(亚硒酸钠)溶液，使发酵体系中亚硒酸钠的终浓度在10mM，在37℃、180rpm、通气量0.5vvm条件下培养，发酵时间24h，发酵结束后，从发酵产物中分离纯化纳米硒。
其中，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖10g/L、酵母提取物10g/L、大豆蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
在本发明的另一个具体实施方式中，利用地衣芽孢杆菌高效合成生物纳米硒的发酵工艺包括以下步骤：
1)菌种活化，同上述S1所述；
2)种子液的制备：将S1活化好的地衣芽孢杆菌用无菌生理盐水配制成108CFU/mL的菌悬液，以1％v/v的接种量接种于SOB液体培养基中，37℃、150rpm振荡培养4h；
3)纳米硒发酵：将2)的种子液按4％v/v的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，装液量70％，加入亚硒酸盐(亚硒酸钠)溶液，使发酵体系中亚硒酸钠的终浓度在10mM，在37℃、200rpm、通气量1.2vvm条件下培养，发酵时间72h，发酵结束后，从发酵产物中分离纯化纳米硒。
其中，所述发酵培养基的配方为：玉米粉40g/L、酵母提取物10g/L、大豆蛋白胨15g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
前述方法中，所述地衣芽孢杆菌为保藏编号为CGMCC No.11742的地衣芽孢杆菌S13。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明采用改良的发酵培养基和发酵工艺，大大提高了地衣芽孢杆菌(特别是菌株S13)生物合成纳米硒的产量和转化率，大幅度缩短发酵时间，显著提高了生物纳米硒的生产效率。具体来讲，地衣芽孢杆菌S13在5mM初始亚硒酸钠浓度下，生物纳米硒产量可提高至5mM，比ZL201610946282.3方法提高了1.2倍，发酵时间由48h缩短至12h；在10mM初始亚硒酸钠浓度下，纳米硒产量可提高至9.6mM，比ZL201610946282.3方法提高了4倍，发酵时间由48h缩短至24h。将本发明方法用于生物纳米硒的工业化制备，应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明实施例1中地衣芽孢杆菌S13发酵生物纳米硒培养基的碳源和氮源筛选结果。
图2为本发明实施例2中地衣芽孢杆菌S13发酵生物纳米硒培养基的碳源和氮源含量优化结果。
图3为本发明实施例3中菌株S13转化高浓度亚硒酸钠为纳米硒的能力。
图4为本发明实施例3中菌株S13在20-100mM亚硒酸钠浓度下的发酵液照片(发酵24h)。
图5为本发明实施例4中地衣芽孢杆菌S13应用本发明的生物纳米硒发酵培养基和发酵工艺，在5mM、10mM、15mM、20mM和30mM亚硒酸钠浓度下，摇培0～72h生物纳米硒的产量曲线。
图6为本发明实施例4中地衣芽孢杆菌S13应用本发明的生物纳米硒发酵培养基和发酵工艺，在5mM、10mM、15mM、20mM和30mM亚硒酸钠浓度下，摇培24h的发酵液照片。
图7为本发明实施例5和实施例6中地衣芽孢杆菌S13应用本发明的生物纳米硒发酵培养基和发酵工艺进行发酵罐发酵生产时，分别发酵24h和72h生物纳米硒的产量。
图8A为本发明实施例7中菌株S13合成生物纳米硒的电镜照片。
图8B为本发明实施例7中菌株S13合成生物纳米硒的EDX能谱分析结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1地衣芽孢杆菌S13发酵生物纳米硒培养基的碳源和氮源筛选实验
实验目的：筛选适合地衣芽孢杆菌S13发酵生产生物纳米硒的培养基。
将地衣芽孢杆菌S13保藏菌株接种在LB平板上，在37℃下培养2d，挑取单菌落接种于LB液体试管中，37℃、150rpm振荡培养8h后，移取1mL菌液转接到装有50mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃、150rpm振荡培养4h作为种子液。
LB培养基配方：酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，pH7.0-7.2，固体培养基添加15g/L琼脂。
移取2mL种子液转接至装有100mL下列不同碳源和氮源的生物纳米硒发酵培养基(C1、C2、C3、C4、N1、N2、N3、N4、N5、CN1、CN2)的500mL锥形瓶中，同时加入相应体积的亚硒酸钠溶液(母液浓度1M，过滤灭菌)，使培养液中亚硒酸钠的终浓度为10mM，每个浓度三个重复，37℃、150rpm振荡培养72h后取样测定发酵液中的生物纳米硒含量。
所述生物纳米硒发酵培养基C1：葡萄糖20g/L、酵母提取物20g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
所述生物纳米硒发酵培养基C2：蔗糖20g/L、酵母提取物20g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
所述生物纳米硒发酵培养基C3：甘露醇20g/L、酵母提取物20g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
所述生物纳米硒发酵培养基C4：玉米粉40g/L、酵母提取物20g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
所述生物纳米硒发酵培养基N1：葡萄糖20g/L、大豆蛋白胨20g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
所述生物纳米硒发酵培养基N2：葡萄糖20g/L、玉米浆粉20g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
所述生物纳米硒发酵培养基N3：葡萄糖20g/L、豆粕粉20g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
所述生物纳米硒发酵培养基N4：葡萄糖20g/L、硝酸钠20g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
所述生物纳米硒发酵培养基N5：葡萄糖20g/L、酵母提取物10g/L、大豆蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
所述生物纳米硒发酵培养基CN1：玉米粉40g/L、酵母提取物10g/L、大豆蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
所述生物纳米硒发酵培养基CN2：可溶性淀粉40g/L、酵母提取物10g/L、大豆蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
发酵液的纳米硒含量测定采用硫化钠分光光度法。用蒸馏水配制1M的Na2S溶液(现配现用)，取500μL待测发酵液，12000rpm离心5min，弃上清，用无菌生理盐水清洗3遍，弃去上清，加入1mL浓度为1M的硫化钠溶液，充分混匀后反应1h，12000rpm再次离心5min，取上清测定波长500nm处的吸光度。
根据纳米硒吸光度标准曲线换算得到发酵液中纳米硒的产量，结果如图1所示。以酵母提取物为氮源，分别以葡萄糖(C1)、蔗糖(C2)、甘露醇(C3)、玉米粉(C4)为碳源，10mM初始亚硒酸钠浓度下发酵72h后的纳米硒产量分别为6.47、1.05、1.18、6.29mM，可知葡萄糖和玉米粉是地衣芽孢杆菌S13发酵生物纳米硒的最优碳源，而蔗糖和甘露醇作为碳源时纳米硒产量较低。
以葡萄糖为碳源，分别以酵母提取物(C1)、大豆蛋白胨(N1)、玉米浆粉(N2)、豆粕粉(N3)、硝酸钠(N4)以及酵母提取物和大豆蛋白胨复配(N5)为氮源，10mM初始亚硒酸钠浓度下发酵72h后的纳米硒产量分别为6.47、7.56、2.53、2.45、0.14、9.42mM，可知酵母提取物和大豆蛋白胨是S13发酵生物纳米硒的最优氮源。对比图1中C1、N1、N5的结果，在培养基碳源和无机盐相同的情况下，20g/L酵母提取物作为氮源时(C1)纳米硒产量为6.47mM，20g/L大豆蛋白胨作为氮源时(N1)纳米硒产量为7.56mM，而将C1和N1按照质量比1:1复配后，即10g/L酵母提取物和10g/L大豆蛋白胨作为复合氮源时(N5)纳米硒产量为9.42mM，显著优于单独使用。可知在用量不变的情况下，酵母提取物和大豆蛋白胨复配能够显著提高纳米硒产量，两者复配有显著增效作用。而玉米浆粉、豆粕粉作为氮源时纳米硒产量较低，无机氮源硝酸钠作为氮源时纳米硒的产量最低。
另外，将葡萄糖替换成淀粉质碳源(CN1为玉米粉，CN2为可溶性淀粉)，同时以酵母提取物和大豆蛋白胨作为氮源，发酵72h后纳米硒产量分别达到9.41和8.99mM，可知淀粉质碳源同样适于S13发酵生产生物纳米硒。
实施例2地衣芽孢杆菌S13发酵生物纳米硒培养基的碳源和氮源含量优化
实验目的：优化地衣芽孢杆菌S13发酵生物纳米硒培养基中碳源和氮源的含量。
将地衣芽孢杆菌S13保藏菌株接种在LB平板上，在37℃下培养2d，挑取单菌落接种于LB液体试管中，37℃、150rpm振荡培养8h后，移取1mL菌液转接到装有50mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃、150rpm振荡培养4h作为种子液。
LB培养基配方：酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，pH7.0-7.2，固体培养基添加15g/L琼脂。
移取2mL种子液转接至装有100mL下列各生物纳米硒发酵培养基(A1、A2、A3、A4、A5)的500mL锥形瓶中，同时加入相应体积的亚硒酸钠溶液(母液浓度1M，过滤灭菌)，使培养液中亚硒酸钠的终浓度为10mM，每个浓度三个重复，37℃、150rpm振荡培养72h后取样测定发酵液中的生物纳米硒含量。
所述生物纳米硒发酵培养基A1：葡萄糖5g/L、酵母提取物5g/L、大豆蛋白胨5g/L，氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
所述生物纳米硒发酵培养基A2：葡萄糖10g/L、酵母提取物10g/L、大豆蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
所述生物纳米硒发酵培养基A3：葡萄糖15g/L、酵母提取物15g/L、大豆蛋白胨15g/L，氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
所述生物纳米硒发酵培养基A4：葡萄糖20g/L、酵母提取物20g/L、大豆蛋白胨20g/L，氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
所述生物纳米硒发酵培养基A5：葡萄糖25g/L、酵母提取物25g/L、大豆蛋白胨25g/L，氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
发酵液的纳米硒含量测定采用硫化钠分光光度法。用蒸馏水配制1M的Na2S溶液(现配现用)，取500μL待测发酵液，12000rpm离心5min，弃上清，用无菌生理盐水清洗3遍，弃去上清，加入1mL浓度为1M的硫化钠溶液，充分混匀后反应1h，12000rpm再次离心5min，取上清测定波长500nm处的吸光度。
根据纳米硒吸光度标准曲线换算得到发酵液中纳米硒的产量，结果如图2所示。在培养基中葡萄糖5-25g/L、酵母提取物5-25g/L、大豆蛋白胨5-25g/L范围内S13均可发酵合成生物纳米硒，并且在葡萄糖10-20g/L、酵母提取物10-20g/L、大豆蛋白胨10-20g/L范围内产量最高，均在9mM以上。而在碳源氮源浓度过低(A1)以及过高(A5)时产量明显降低。
实施例3利用地衣芽孢杆菌S13发酵生产纳米硒的方法
实验目的：在本发明的生物纳米硒发酵培养基和发酵工艺条件下，地衣芽孢杆菌S13在20-100mM亚硒酸钠浓度下合成生物纳米硒的产量。
将地衣芽孢杆菌S13保藏菌株接种在LB平板上，在37℃下培养2d，挑取单菌落接种于LB液体试管中，37℃、150rpm振荡培养8h后，移取1mL菌液转接到装有50mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃、150rpm振荡培养4h作为种子液。
LB培养基配方：酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，pH7.0-7.2，固体培养基添加15g/L琼脂。
移取2mL种子液转接至装有100mL生物纳米硒发酵培养基的500mL锥形瓶中，同时加入相应体积的亚硒酸钠溶液(母液浓度1M，过滤灭菌)，使培养液中亚硒酸钠的终浓度分别为20mM、40mM、60mM、80mM和100mM，每个浓度三个重复，37℃、150rpm振荡培养24h后取样测定发酵液中的生物纳米硒含量。
所述生物纳米硒发酵培养基配方：葡萄糖15g/L、酵母提取物15g/L、大豆蛋白胨15g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
发酵液的纳米硒含量测定采用硫化钠分光光度法。用蒸馏水配制1M的Na2S溶液(现配现用)，取500μL待测发酵液，12000rpm离心5min，弃上清，用无菌生理盐水清洗3遍，弃去上清，加入1mL浓度为1M的硫化钠溶液，充分混匀后反应1h，12000rpm再次离心5min，取上清测定波长500nm处的吸光度。
根据纳米硒吸光度标准曲线换算得到发酵液中纳米硒的产量，结果如图3和图4所示。使用本发明的生物纳米硒发酵培养基和发酵工艺，在20-60mM亚硒酸钠浓度下，培养24h后S13菌株发酵液的生物纳米硒产量均达到12mM，而80mM和100mM亚硒酸钠浓度下生物纳米硒产量略低于2mM，可能是菌体生长受到较大抑制作用的缘故。
在接入种子液和亚硒酸钠之后，S13发酵液逐渐变红，发酵24h后，添加20-100mM亚硒酸钠的S13发酵液均已转变为鲜红色，而只接入种子液不添加亚硒酸钠的发酵液未变红(图4)。
对比例：采用ZL201610946282.3中的培养基(TB液体培养基)和发酵方法，菌株S13分别在3mM、5mM和10mM亚硒酸钠浓度下发酵80-120h，纳米硒的产量分别为2.6mM、2.4mM和2.1mM。
可见，本发明通过对S13发酵培养基进行优化，纳米硒的产量得以显著提升。
实施例4利用地衣芽孢杆菌S13发酵生产纳米硒的方法
实验目的：在本发明的生物纳米硒发酵培养基和发酵工艺条件下，地衣芽孢杆菌S13在5mM、10mM、15mM、20mM和30mM亚硒酸钠浓度下，摇培0～72h生物纳米硒的产量曲线。
将地衣芽孢杆菌S13保藏菌株接种在LB平板上，在37℃下培养2d，挑取单菌落接种于LB液体试管中，37℃、180rpm振荡培养8h后移取1mL菌液，转接到装有50mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃、180rpm摇培4h作为种子液。
移取2mL种子液转接至装有100mL生物纳米硒发酵培养基的500mL锥形瓶中，同时加入相应体积的亚硒酸钠溶液(母液浓度1M，过滤灭菌)，使培养液中亚硒酸钠的终浓度分别为5mM、10mM、15mM、20mM和30mM，37℃、180rpm振荡培养72h，分别于0.3h、2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h取样测定发酵液中的生物纳米硒含量。
所述生物纳米硒发酵培养基配方：葡萄糖15g/L、酵母提取物10g/L、大豆蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
发酵液的纳米硒含量测定采用硫化钠分光光度法。用蒸馏水配制1M的Na2S溶液(现配现用)，取500μL待测发酵液，12000rpm离心5min，弃上清，用无菌生理盐水清洗3遍，弃去上清，加入1mL浓度为1M的硫化钠溶液，充分混匀后反应1h，12000rpm再次离心5min，取上清测定波长500nm处的吸光度。
根据纳米硒吸光度标准曲线换算得到发酵液中纳米硒的产量，结果如图5所示。
使用本发明的培养基和发酵方法，在5mM亚硒酸钠浓度下，12h发酵液的生物纳米硒产量已达到5mM，转化率达到100％；在10mM亚硒酸钠浓度下，12h的转化率达到90％(纳米硒浓度8.99mM)，24h转化率达到96％(9.64mM)，72h转化率达到99％(9.93mM)；在15mM亚硒酸钠浓度下，12h的转化率为73％(10.88mM)，24h转化率达到83％(12.5mM)，72h转化率达到89％(13.38mM)；在20mM亚硒酸钠浓度下，12h的转化率为58％(11.66mM)，24h转化率达到67％(13.51mM)，72h转化率达到72％(14.31mM)；在30mM亚硒酸钠浓度下，12h的转化率为41％(12.20mM)，24h转化率为47％(14.05mM)，72h转化率约50％(15.07mM)。
如果对比ZL201610946282.3中的培养基(LB液体培养基)和发酵方法，在培养48h后，S13菌株在1mM亚硒酸钠浓度下纳米硒的转化效率为98.5％，3mM亚硒酸钠浓度下纳米硒的转化效率为82.4％，5mM亚硒酸钠浓度下纳米硒的转化效率为46.2％，10mM亚硒酸钠浓度下纳米硒的转化效率为19.3％。而在本发明的培养基和发酵工艺条件下，将菌株S13在5mM亚硒酸钠浓度下的纳米硒产量提高到5mM，提高了1.2倍，培养时间缩短至原来的1/4；将10mM亚硒酸钠浓度下的纳米硒产量提高到9.64mM，提高了4倍，培养时间缩短一半。
在添加亚硒酸钠之后，S13发酵液逐渐转变为红色，且随摇培时间加长，发酵液红色加深。发酵24h后，添加5-30mM亚硒酸钠的S13发酵液均已转变为鲜红色，而只加亚硒酸钠不接菌的发酵液和只接菌不加亚硒酸钠的发酵液均未变红(图6)。
实施例5地衣芽孢杆菌S13发酵生产生物纳米硒
1、菌种活化
将菌株S13接种于SOC试管斜面培养基上对菌株进行活化培养，37℃培养48h。SOC培养基配方为：胰蛋白胨16g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，氯化钾2.5mM，氯化镁10mM，葡萄糖20mM，琼脂15g/L，pH7.0-7.2。
2、种子培养
采用SOB液体培养基进行种子培养，将活化好的菌株S13用无菌生理盐水配成108CFU/mL的菌悬液，以1％接菌量接种于SOB液体培养基中，37℃、150rpm振荡培养8h。SOB液体培养基配方为：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，氯化钾2.5mM、氯化镁10mM，pH7.0-7.2。
3、纳米硒发酵
将种子液按照2％的接种量接入装有本发明生物纳米硒发酵培养基的发酵罐中(装液量65％)，加入配制好的亚硒酸盐溶液(浓度1M，过滤灭菌)，控制培养液中亚硒酸盐的终浓度10mM，在37℃、180rpm、通气量0.5vvm条件下通气培养，发酵时间24h。
所述生物纳米硒发酵培养基配方：葡萄糖10g/L、酵母提取物10g/L、大豆蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
发酵液纳米硒含量测定采用硫化钠分光光度法。用蒸馏水配制1M的Na2S溶液(现配现用)，取500μL待测发酵液，12000rpm离心5min，弃上清，用无菌生理盐水清洗3遍，弃去上清，加入1mL浓度为1M的硫化钠溶液，充分混匀后反应1h，12000rpm再次离心5min，取上清测定波长500nm处的吸光度。
根据纳米硒吸光度标准曲线换算得到发酵液中纳米硒的产量，结果如图7所示，使用本发明的生物纳米硒发酵培养基和发酵工艺，在10mM亚硒酸钠初始浓度下，发酵罐发酵24h后，纳米硒的产量达到9.1mM。
实施例6地衣芽孢杆菌S13发酵生产生物纳米硒
1、菌种活化
将菌株S13接种于SOC试管斜面培养基上对菌株进行活化培养，37℃培养48h。SOC培养基配方为：胰蛋白胨16g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，氯化钾2.5mM，氯化镁10mM，葡萄糖20mM，琼脂15g/L，pH7.0-7.2。
2、种子培养
采用SOB液体培养基进行种子培养，将活化好的菌株S13用无菌生理盐水配成108CFU/mL的菌悬液，以1％接菌量接种于SOB液体培养基中，37℃、150rpm振荡培养4h。SOB液体培养基配方为：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，氯化钾2.5mM、氯化镁10mM，pH7.0-7.2。
3、纳米硒发酵
将种子液按照4％的接种量接入装有本发明的生物纳米硒发酵培养基的发酵罐中(装液量70％)，加入配制好的亚硒酸盐溶液(浓度1M，过滤灭菌)，控制培养液中亚硒酸盐的终浓度在10mM，在发酵罐37℃、200rpm、通气量1.2vvm条件下通气培养，发酵时间72h。
所述生物纳米硒发酵培养基配方：玉米粉40g/L、酵母提取物10g/L、大豆蛋白胨15g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
发酵液纳米硒含量测定采用硫化钠分光光度法。用蒸馏水配制1M的Na2S溶液(现配现用)，取500μL待测发酵液，12000rpm离心5min，弃上清，用无菌生理盐水清洗3遍，弃去上清，加入1mL浓度为1M的硫化钠溶液，充分混匀后反应1h，12000rpm再次离心5min，取上清测定波长500nm处的吸光度。
根据纳米硒吸光度标准曲线换算得到发酵液中纳米硒的产量，结果如图7所示，使用本发明的培养基和发酵方法，在10mM亚硒酸钠浓度下，发酵72h后，纳米硒的产量达到9.89mM。使用淀粉质碳源如玉米粉时，菌体生长和纳米硒合成速率较慢，但是亚硒酸盐转化为纳米硒的效率更高。
实施例7地衣芽孢杆菌S13合成生物纳米硒的特征分析
取1mL实施例5中发酵24h的生物纳米硒发酵液，6000rpm离心5min收集红色沉淀，用生理盐水清洗3遍后，用去离子水重悬沉淀，取悬浮液滴加一滴在碳支持膜铜网上，用滤纸吸去多余水分，晾干，在透射电子显微镜下(TEM，JEM-1230，Japan)观察，并利用能谱分析仪(EDX)对纳米颗粒进行分析。
结果如图8A和图8B所示，透射电镜下，S13菌体细胞膜与细胞外可见大量球形纳米硒颗粒，粒径在50-300nm，主要粒径为100-200nm(图8A)，通过EDX能谱分析箭头所指的纳米硒颗粒可知，出现在1.22KeV、11.22KeV、12.50KeV处特定吸收峰为硒的特征峰(图8B)，说明S13还原亚硒酸盐形成的纳米颗粒是纳米硒。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)S13发酵生产纳米硒的方法，所述地衣芽孢杆菌S13的保藏编号为CGMCC No.11742，其特征在于，包括以下步骤：
S1、菌种活化；
S2、种子液的制备；
S3、纳米硒发酵：将S2的种子液接入发酵培养基中，加入亚硒酸盐溶液，使发酵体系中亚硒酸盐的终浓度在5-100mM，进行发酵培养，发酵结束后，从发酵产物中分离纯化纳米硒；
所述发酵培养基的配方为：葡萄糖5-25g/L或淀粉质碳源10-45g/L、酵母提取物5-25g/L、大豆蛋白胨5-25g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2；
其中，所述淀粉质碳源选自玉米粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉或其它可溶性淀粉中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖10-20g/L或淀粉质碳源40-45g/L、酵母提取物10-20g/L、大豆蛋白胨10-20g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S3的发酵条件为：温度35-38℃，转速150-250rpm，通气量0.5-1.5vvm，发酵时间24-72h。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S3中按2-5％v/v的接种量将种子液接入装有所述发酵培养基的摇瓶或发酵罐中，摇瓶装液量为20-30％，发酵罐装液量不超过80％。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S1具体为：用SOC培养基对地衣芽孢杆菌进行活化培养，SOC培养基的配方为：胰蛋白胨16g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，氯化钾2.5mM，氯化镁10mM，葡萄糖20mM，琼脂15g/L，pH 7.0-7.2；将地衣芽孢杆菌接种于SOC培养基斜面上，37℃培养48h。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S2具体为：用SOB液体培养基进行种子培养，SOB液体培养基的配方为：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，氯化钾2.5mM，氯化镁10mM，pH 7.0-7.2；将S1活化好的地衣芽孢杆菌用无菌生理盐水配制成108CFU/mL的菌悬液，以1％v/v的接种量接种于SOB液体培养基中，37℃、150-250rpm振荡培养4-8h。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)菌种活化，同权利要求5中所述；
2)种子液的制备：将S1活化好的地衣芽孢杆菌用无菌生理盐水配制成108CFU/mL的菌悬液，以1％v/v的接种量接种于SOB液体培养基中，37℃、150rpm振荡培养8h；
3)纳米硒发酵：将2)的种子液按2％v/v的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，装液量65％，加入亚硒酸钠溶液，使发酵体系中亚硒酸钠的终浓度在10mM，在37℃、180rpm、通气量0.5vvm条件下培养，发酵时间24h，发酵结束后，从发酵产物中分离纯化纳米硒；
其中，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖10g/L、酵母提取物10g/L、大豆蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)菌种活化，同权利要求5中所述；
2)种子液的制备：将S1活化好的地衣芽孢杆菌用无菌生理盐水配制成108CFU/mL的菌悬液，以1％v/v的接种量接种于SOB液体培养基中，37℃、150rpm振荡培养4h；
3)纳米硒发酵：将2)的种子液按4％v/v的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，装液量70％，加入亚硒酸钠溶液，使发酵体系中亚硒酸钠的终浓度在10mM，在37℃、200rpm、通气量1.2vvm条件下培养，发酵时间72h，发酵结束后，从发酵产物中分离纯化纳米硒；
其中，所述发酵培养基的配方为：玉米粉40g/L、酵母提取物10g/L、大豆蛋白胨15g/L、氯化钠10g/L、硫酸铵2g/L、氯化铵1g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0-7.2。
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