CN108587996B

CN108587996B - 高产聚γ-谷氨酸的工程菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN108587996B
Application number: CN201810426631.8A
Authority: CN
Inventors: 陈守文; 何鹏辉; 蔡冬波; 陈耀中; 王世依; 莫非; 马昕
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2018-05-07
Filing date: 2018-05-07
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2038-05-07
Also published as: CN108587996A

Abstract

本发明提供了一种高产聚γ‑谷氨酸的工程菌及其构建方法与应用。本发明公开的高产聚γ‑谷氨酸的工程菌为强化表达dltB基因的重组微生物，所述强化表达为引入一个或多个拷贝的dltB基因和/或将dltB基因的表达元件替换为具有较高活性的表达元件。本发明通过提高dltB基因的表达获得的工程菌发酵生产聚γ‑谷氨酸产量提高20％以上。本发明获得的工程菌能够提高发酵生产聚γ‑谷氨酸的产量、降低生产成本，具有良好的市场应用价值。

Description

高产聚γ-谷氨酸的工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物发酵领域，具体涉及高产聚γ-谷氨酸的工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

聚γ-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid，γ-PGA)是一类天然的阴离子型生物高分子聚合物，主要由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体通过γ-酰胺键聚合而成。γ-PGA分子上带有大量游离的带负电荷的羧基，使其具有与大量金属阳离子结合的能力和亲水的性能。这些结构特点使得γ-PGA具备良好的水溶性、较强的吸附能力、可生物降解、对人体和环境无毒害等特性，在医药、食品、化妆品、环境保护及农业等领域具有广泛的应用。

作为γ-PGA的合成前体的L-谷氨酸的来源主要有两种，一种是是通过外源培养基的添加；另一种则是通过微生物细胞代谢途径中的三羧酸循环(TCA)的重要中间产物α-酮戊二酸经过谷氨酸脱氢酶催化生成。γ-PGA合成的另一个前体D-谷氨酸则通过L-谷氨酸经谷氨酸异构(消旋酶)消旋而来。目前，提高菌株γ-PGA产量的研究报道一般集中在针对合成、分解途径的改造和优化。细胞代谢产物的膜转运过程是代谢产物胞外积累的关键步骤，胞内合成的代谢产物需要被高效地转运到胞外，以便于产物的分离提取，同时避免胞内产物大量积累导致的代谢抑制。然而，目前尚没有对于γ-PGA的跨膜转运过程的研究及其在促进γ-PGA高效合成方面的应用。

磷壁酸(TA)对于菌体生长，生物膜形成，革兰氏阳性致病菌的黏附性和毒力具有重要作用，是细胞壁的重要组成部分。其能浓缩Mg2+浓度，提高细胞膜部分合成酶活性，并能贮藏元素、抑制自溶素活力，防止菌体因自溶而死亡。大多数革兰氏阳性菌中，TA进一步需要用D-丙氨酰修饰，其赋予细胞膜正电荷，这种修饰在调节自溶素活性和胞壁内Mg2⁺的结合中起重要作用。dlt操纵子介导磷壁酸的D-丙氨酰修饰，包含四个基因dltA、dltB、dltC和dltD，其中dltA编码D-丙氨酸-D-丙氨酰载体蛋白连接酶(DCl)，其催化D-丙氨酸的腺苷酸化；dltB编码参与活化的D-丙氨酸分泌的跨膜蛋白；dltC编码D-丙氨酰载体蛋白(Dcp)；dltD编码促进Dcp和Dcl与D-Ala连接的蛋白质，并具有硫代酯酶活性，通过N-末端疏水序列锚定到膜上。基因dltB编码的蛋白促使活化的D-丙氨酸从胞内运输到细胞膜上，对D-丙氨酰化作用起着重要作用。本发明旨在通过增加基因dltB的表达量以增强这种修饰作用，将更多的D-丙氨酸掺入到胞壁内，探究地衣芽胞杆菌D-丙氨酰化作用的加强是否能提高γ-PGA产量。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供高产聚γ-谷氨酸的工程菌及其构建方法与在发酵生产并提高γ-谷氨酸产量中的应用。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供高产聚γ-谷氨酸的工程菌，所述工程菌为强化表达dltB基因的重组微生物，所述强化表达为引入一个或多个拷贝的dltB基因和/或将dltB基因的表达元件替换为具有较高活性的表达元件。

所述dltB具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸替换、缺失、或插入的氨基酸序列但具有如SEQ ID NO.1所示的蛋白相同功能。

具体地，所述dltB具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或具有特异性序列且能够表达与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列相同功能的蛋白。

所述dltB来源于细菌，优选来源于芽胞杆菌属细菌。

所述微生物包括但不限于芽胞杆菌属的细菌，优选为地衣芽胞杆菌。

进一步地，本发明还提供了上述高产聚γ-谷氨酸的工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建dltB基因表达盒，所述表达盒包括启动子、dltB基因和终止子；

(2)将dltB基因表达盒连接至载体，构建含有dltB基因表达盒的载体；

(3)将含有dltB基因表达盒的载体转化至出发菌株中，筛选获得阳性转化子。

其中，所述步骤1)中的dltB基因的序列优选为如SEQ ID NO.2所示序列，所述启动子和终止子包括但不限于本发明实施例中使用的枯草芽胞杆菌的P43启动子和淀粉酶终止子TamyL，本领域技术人员可以根据需要选择常用的操纵基因转录起始和终止的启动子和终止子不同程度地调控dltB基因的表达。

所述步骤2)中的载体，包括但是不限于本发明实施例中使用的pHY300PLK载体，本领域技术人员可以根据增强表达dltB基因的方式选择任意一种在基因工程改造中使用的载体。

在本发明的一个实施例中，一种通过强化表达dltB基因高产聚γ-谷氨酸的芽胞杆菌工程菌株构建方法为：

(1)以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，PCR扩增出dltB基因片段；

(2)在dltB基因片段上游连接P43启动子、下游连接淀粉酶终止子，构成完整的dltB表达元件；

(3)采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；

(4)准备质粒pHY300PLK，并采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对质粒pHY300PLK进行双酶切得到线性质粒片段；

(5)将步骤(3)得到的酶切基因片段和步骤(4)得到的线性质粒片段经T4-DNA连接酶进行连接，经过氯化钙转化法将酶连的产物转入大肠杆菌DH5α中，以氨苄青霉素为抗性筛选标记，并经过菌落PCR，以pHY-F和pHY-R为验证引物得到阳性转化子，经过测序得到游离表达质粒pHY-dltB；

(6)将游离表达质粒pHY-dltB电转入地衣芽胞杆菌WX-02中，以四环素抗性作为筛选标记，并经过菌落PCR，以pHY-F和pHY-R为验证引物筛选得到阳性转化子，命名为地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-dltB

此外，本发明还提供上述工程菌在发酵生产聚γ-谷氨酸或提高聚γ-谷氨酸产量中的应用。

更进一步地，本发明提供一种聚γ-谷氨酸的生产方法，以本发明所述的工程菌为发酵菌株。

发酵使用的培养基包括但不限于以下任意一种发酵培养基：70～90g/L葡萄糖或60～100g/L甘油，20～40g/L谷氨酸钠，10～15g/L柠檬酸钠，8～10g/L NaNO₃，8～10g/LNH₄Cl，0.5～2g/L K₂HPO₄·3H₂O，0.5～2g/L MgSO₄·7H₂O，0.5～2g/L ZnSO₄·7H₂O，0.1～0.2g/L MnSO₄·H₂O，0.5～2g/L CaCl₂，pH 7.0～7.5。

本发明的有益效果在于，本发明通过提高dltB的表达水平构建了产聚γ-谷氨酸地衣芽胞杆菌，增加出发菌株的细胞膜和细胞壁的修饰作用，得到了显著提高地衣芽胞杆菌γ-PGA产量的技术效果，采用本发明构建得到的强化表达dltB的工程菌进行发酵，不同发酵培养基中发酵的聚γ-谷氨酸的产量提高均在20％以上。本发明的研究结果表明：通过强化表达dltB基因从而加强胞壁内的D-丙氨酰化作用是一种十分有效的提高γ-PGA产量的方法。

附图说明

图1为dltB基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为dltB基因片段；

图2为dltB表达元件的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为P43启动子，泳道3为淀粉酶终止子TamyL，泳道4为dltB表达元件；

图3为游离表达质粒pHY-dltB进行菌落PCR验证图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为游离表达质粒pHY-dltB进行菌落PCR验证的条带；

图4为实施例1中的转化子进行菌落PCR验证图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为阳性转化子WX-02/pHY-dltB进行菌落PCR验证的条带；

其中，上述DNA marker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 pHY-dltB表达质粒的构建

根据地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA序列中的dltB基因的基因序列，设计dltB基因的上游引物(dltB-F)和下游引物(dltB-R)；并以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到dltB基因片段(1158bp)；

其中，dltB-F和dltB-R的序列为：

dltB-F:TAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGACACCCTATGGTTCATTTCdltB-R:GAAATCCGTCCTCTCTGCTCTTTTAGTGTATTAGTTTCCCTGAG

以枯草芽胞杆菌168的基因组DNA为模板，PCR扩增得到P43启动子(所用引物为P43-F和P43-R)；以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，PCR扩增得淀粉酶终止子(所用引物为TamyL-F和TamyL-R)，随后将启动子、目的基因和终止子通过SOE-PCR连到一起(所用引物为P43-F和TamyL-R)，构成完整的dltB表达元件(1959bp)；

其中，P43-F、P43-R、TamyL-F、TamyL-R的序列为：

P43-F:GCGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCGCT

P43-R:GAAATGAACCATAGGGTGTCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTA

TamyL-F:CTCAGGGAAACTAATACACTAAAAGAGCAGAGAGGACGGATTTC

TamyL-R:GGTCTAGACGCAATAATGCCGTCGCACTGG

采用限制性内切酶EcoRI和XbaI对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段(1953bp)；准备质粒pHY300PLK，并采用限制性内切酶EcoRI和XbaI对质粒pHY300PLK进行双酶切得到线性质粒片段(4870bp)将得到的酶切基因片段和线性质粒片段经T4DNA连接酶进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有氨苄青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：pHY-F和pHY-R)。若转化子的PCR验证结果为：在2230bp处出现电泳条带，进一步结合序列测定结果证明游离表达载体pHY-dltB构建成功，其中pHY-F和pHY-R的序列分别为：

pHY-F：GTTTATTATCCATACCCTTAC

pHY-R：CAGATTTCGTGATGCTTGTC

实施例2地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-dltB的构建

将游离表达载体pHY-dltB转入地衣芽胞杆菌WX-02(公开于中国专利CN106497857A)中，在37℃的条件下、含有四环素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：pHY-F和pHY-R)。阳性转化子的PCR验证结果为在2230bp处出现电泳条带，结合序列测定结果，证明游离表达载体pHY-dltB成功转入地衣芽胞杆菌WX-02中，地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-dltB)构建成功，对照菌株WX-02/pHY300为将质粒pHY300转化至WX-02中，其操作步骤同WX-02/pHY-dltB的构建。

实施例3地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-dltB发酵生产γ-PGA试验

1.种子培养

将地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-dltB和WX-02/pHY300活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于装有5mL LB培养基中，180～300r/min、温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子发酵的培养基后于180～300r/min、37℃中培养10～12小时，得到种子培养的菌液。

2.发酵生产γ-PGA

为更好地分析dltB的表达对于地衣芽胞杆菌发酵生产γ-PGA的作用，分别采用如表1所示的培养基进行发酵试验。

表1发酵培养基的配方

18种培养基中其他成分均为：10g/L柠檬酸钠，10g/L NaNO₃，8g/L NH₄Cl，1g/LK₂HPO₄·3H₂O，1g/L MgSO₄·7H₂O，1g/L ZnSO₄·7H₂O，0.15g/L MnSO₄·H₂O，1g/L CaCl₂，pH7.2。

向500mL三角瓶中装入25～150mL的生产发酵的培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为3％(体积百分比)接种至发酵培养基中。培养条件为转速180～300r/min，温度37℃。发酵培养36小时，得到生产发酵的菌液。

3.γ-PGA产量和菌体生物量的测定

采用干重法测量γ-PGA产量和菌体生物量，具体操作步骤如下：取一定体积的发酵液样品，使用6mol/L HCl将pH调至3.0，12000r/min离心10min，菌体沉淀80℃烘箱烘干，测菌体干重。取上清，用6mol/L NaOH将上清液pH调至中性，加入3倍体积乙醇沉淀γ-PGA，离心收集γ-PGA絮状沉淀，将沉淀在80℃烘箱烘干，测干重。(魏雪团，2009，硕士毕业论文)。根据干重法计算生产发酵的菌液中γ-PGA的产量(见表2)。

表2

从表2可看出，在相同的发酵的条件下，采用本发明的地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-dltB的发酵的菌液中γ-PGA产量较对照菌有了大幅提升(提高20％以上)，说明本发明的技术方案在提高地衣芽胞杆菌γ-PGA产量方面具有重大应用价值。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 高产聚 γ-谷氨酸的工程菌及其构建方法与应用

<130> KHP181111962.0

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 385

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Pro Tyr Gly Ser Phe Leu Phe Phe Ile Ile Leu Gly Ile Leu

1 5 10 15

Leu Ala Pro Thr Ile Ile Leu Gly Leu Asn Gly Lys Ser Phe Arg Leu

20 25 30

Tyr Asn Met Ala Val Ser Val Leu Val Leu Ala Leu Ile Phe Ser Asn

35 40 45

Ser Leu His Gly Leu Ile Met Leu Cys Leu Phe Thr Leu Trp Gln Thr

50 55 60

Val Leu Ile Lys Gly Tyr Ile Ala Tyr Arg Leu Lys Ala Asn Ser Gly

65 70 75 80

Ile Val Phe Cys Leu Ala Ala Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ala Leu

85 90 95

Ser Lys Leu Leu Pro Phe Phe Ala Val Asp Asn Trp Ala Thr Phe Leu

100 105 110

Gly Ile Ser Tyr Leu Thr Phe Lys Gly Val Gln Leu Ile Ile Glu Thr

115 120 125

Arg Asp Gly Leu Ile Lys Lys Gln Leu Pro Ile Ser Arg Leu Leu Tyr

130 135 140

Phe Ile Leu Phe Phe Pro Thr Ile Ser Ser Gly Pro Ile Asp Arg Tyr

145 150 155 160

Arg Arg Phe Glu Lys Asp Asp Gln Thr Val Trp Thr Lys Glu Gln Tyr

165 170 175

Glu Glu Leu Leu Tyr Lys Gly Ile Asn Lys Ile Phe Leu Gly Phe Leu

180 185 190

Tyr Lys Phe Ile Ile Gly Tyr Cys Ile Asn Thr Tyr Val Ile Met Lys

195 200 205

Leu Pro Phe Leu Thr Ser Gly Ser Phe Ser His Gly Leu Ala Tyr Met

210 215 220

Tyr Ala Tyr Ser Leu Tyr Leu Phe Phe Asp Phe Ala Gly Tyr Thr Ala

225 230 235 240

Phe Ala Val Gly Val Ser Tyr Ile Met Gly Ile Lys Ser Pro Glu Asn

245 250 255

Phe Asn Lys Pro Phe Ile Ser Arg Asn Ile Lys Asp Phe Trp Asn Arg

260 265 270

Trp His Met Ser Leu Ser Phe Trp Phe Arg Asp Tyr Val Phe Met Arg

275 280 285

Phe Val Leu Trp Met Thr Lys Lys Lys Trp Ile Thr Asn Arg Met Ala

290 295 300

Val Ser Asn Ile Gly Tyr Val Leu Leu Phe Leu Leu Met Gly Val Trp

305 310 315 320

His Gly Leu Ala Pro Gln Tyr Ile Val Tyr Gly Leu Tyr His Ala Leu

325 330 335

Leu Met Val Gly Phe Asn Phe Phe Glu Lys Trp Asn Lys Lys His Lys

340 345 350

Trp Trp Pro Asn Asn Lys Trp Thr Thr Ala Val Ser Ile Val Val Thr

355 360 365

Phe His Phe Val Cys Phe Gly Phe Leu Ile Phe Ser Gly Lys Leu Ile

370 375 380

His

385

<210> 2

<211> 1158

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgacgcctt atggttcatt tcttttcttc attatattag gaattttact ggcgccgacc 60

atcattctcg gattgaacgg aaaaagcttc cgcttatata atatggcggt ttccgttctg 120

gttctggcgc ttattttttc gaacagcctg cacgggctga tcatgctgtg cctgtttacg 180

ctttggcaga cggttctgat caaaggctat atcgcttacc gtctaaaagc gaacagcggc 240

atcgtatttt gtctggctgc agcagcttct atcctgcctc tggcactgtc aaagctgctg 300

ccgtttttcg ccgttgacaa ctgggcaaca tttctcggaa tctcgtattt aacttttaaa 360

ggggttcagc tcatcattga aacccgcgac ggtctcatta aaaagcagct cccaatcagc 420

agactgcttt actttattct cttttttcca accatctcgt caggtccgat cgacaggtac 480

cgccgttttg aaaaagacga tcagacggtt tggacaaagg agcaatacga agaactgctt 540

tacaaaggaa tcaataaaat ttttctcggc tttttgtaca aattcattat cggctactgc 600

attaatacgt atgtcataat gaaactgccg tttttgactt ccggcagctt ctcgcatgga 660

ttggcataca tgtatgcgta cagcctttat ctgttttttg acttcgccgg atacacggct 720

tttgcggtcg gcgtcagcta tatcatggga atcaaatccc ctgaaaactt taataagccg 780

ttcatcagcc gcaatattaa agatttctgg aaccgctggc atatgtcgct ttccttctgg 840

ttcagagact acgtcttcat gcgctttgtc ctttggatga cgaagaaaaa atggatcaca 900

aaccggatgg ctgtttccaa tatcggatat gtgctgctgt tccttctgat gggcgtctgg 960

cacggccttg cccctcagta catcgtctac gggctgtatc acgcgctgct catggtcggc 1020

tttaacttct ttgaaaaatg gaataagaag cacaagtggt ggccgaacaa caagtggacg 1080

acagccgtct caattgtggt gaccttccac tttgtatgtt ttggattttt aattttctca 1140

gggaaactaa tacactaa 1158

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taggtaagag aggaatgtac acatgacacc ctatggttca tttc 44

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaatccgtc ctctctgctc ttttagtgta ttagtttccc tgag 44

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgaattctg ataggtggta tgttttcgct 30

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaaatgaacc atagggtgtc atgtgtacat tcctctctta 40

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctcagggaaa ctaatacact aaaagagcag agaggacgga tttc 44

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtctagacg caataatgcc gtcgcactgg 30

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtttattatc cataccctta c 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cagatttcgt gatgcttgtc 20

Claims

1.高产聚γ-谷氨酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌为强化表达dltB基因的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）WX-02，所述强化表达为引入一个或多个拷贝的dltB基因；所述地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）WX-02的保藏编号为CCTCC No：M2016439；

所述dltB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述dltB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）构建dltB基因表达盒，所述表达盒包括启动子、dltB基因和终止子；

（2）将dltB基因表达盒连接至载体，构建含有dltB基因表达盒的载体；

（3）将含有dltB基因表达盒的载体转化至出发菌株中，筛选获得阳性转化子。

3.权利要求1所述工程菌在提高聚γ-谷氨酸产量中的应用。

4.一种聚γ-谷氨酸的生产方法，其特征在于，以权利要求1所述的工程菌为发酵菌株。

5.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，发酵采用如下发酵培养基：70~90 g/L葡萄糖或60~100 g/L 甘油，20~40 g/L 谷氨酸钠，10~15 g/L柠檬酸钠，8~10 g/L NaNO₃，8~10 g/L NH₄Cl，0.5~2 g/L K₂HPO₄·3H₂O，0.5~2 g/L MgSO₄·7H₂O，0.5~2 g/L ZnSO₄·7H₂O，0.1~0.2 g/L MnSO₄·H₂O，0.5~2 g/L CaCl₂，pH 7.0~7.5。