KR20120072562A - 락토바실러스 균주 또는 재조합 락토바실러스 균주를 이용한 글루탐산나트륨으로부터 감마-아미노부틸산의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 락토바실러스 균주 또는 재조합 락토바실러스 균주를 이용한 글루탐산나트륨으로부터 감마-아미노부틸산의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로 MSG로부터 GABA 전환 생산능이 있는 것으로 확인된 락토바실러스 속 균주, 또는 상기 균주에 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase)를 형질전환하여 제조한 재조합 균주에 의해 MSG로부터 GABA를 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 락토바실러스 속 균주 또는 재조합 락토바실러스 속 균주는 MSG로부터 GABA로의 전환 생산능이 우수하므로, 상기 방법은 GABA 생산기술에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

락토바실러스 균주 또는 재조합 락토바실러스 균주를 이용한 글루탐산나트륨으로부터 감마-아미노부틸산의 제조 방법{Method for Preparing GABA by mono sodium glutamtate using Lactobacillus strain or recombinant Lactobacillus strain}

본 발명은 락토바실러스 균주 또는 재조합 락토바실러스 균주를 이용한 글루탐산나트륨으로부터 감마-아미노부틸산의 제조 방법에 관한 것이다.

최근 전세계적인 석유수급 불안과 석유자원 고갈에 대한 위기의식으로 최근에 산업 바이오 기술을 이용하여 바이오매스에서 유래한 대체 생산 방법이나 대체 화합물을 생산하기 위한 전 인류적인 노력이 바이오에너지, 바이오플라스틱, 바이오화합물 등의 다양한 분야에서 가시화되고 있다. 바이오매스를 활용하여 생산되는 바이오 플라스틱 시장의 경우 2002년 Natureworks사에 의해 상업화된 폴리유산 (Poly Lactic acid)이 연 14 만톤 규모로 생산되어 최근 시장이 급속히 확대되고 있다. PHA계 바이오플라스틱인 폴리-(3-하이드록시부틸레이트-코-3-하이드록시발레레이트{poly-(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalarate)}(P(3HB-co-3HV))도 Metabolix와 ADM의 합작회사인 Telles에 의해 5 만톤 규모의 공장이 2010년 완공되어 제품이 시판되고 있다. 또한 듀폰사가 생산하고 있는 바이오매스 기반의 1,3-프로판디올을 이용하여 PTT 고분자 제품이 현재 상용화되어 있다. 이외에도 숙신산 기반의 PBS 등도 활발히 개발되고 있다. 상기 예로 든 바이오매스 유래 고분자의 단점 중의 하나는 낮은 내열성을 들 수 있다. 높은 내열성을 보유한 고분자의 대표적인 예는 나일론이다. 나일론 6과 나일론 6,6이 나일론 시장의 대부분을 차지하고 있지만 최근 생분해성 특성과 내열성을 동시에 지닌 나일론 4에 대한 관심이 높아지고 있다. 나일론 4의 원료물질인 2-피롤리돈은 감마 부티로락톤(gamma butyrolactone)으로부터 생산될 수 있으며 4-아미노부틸산의 탈수고리반응에 의해 생산될 수 있다.

4-아미노부틸산의 경우 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)이라고도 하는데, 체내에서는 신경전달물질 억제효과에 의한 저혈압 및 진통효과가 있다고 알려져, 현재 식품 및 의약품 소재로 활용되고 있다(Erlander et al., Neurochem Res. 16: 215-226, 1991). 이러한 GABA는 글루타메이트를 원료로 글루타메이트 디카르복실라아제(Glutamate decarboxylase)에 의해 제조될 수 있는데, 현재까지 다양한 글루타메이트 디카르복실라아제가 보고되어 있으며(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8491-8495, 1990; Protein Expression and Purification 8: 430-438, 1996; Biosci. Biotechnol. Biochem. 66(12): 2600-2605, 2002), 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용하여 GABA를 생산하는 공정이 개발된바 있다. 하지만 효소반응의 경우 고가의 효소를 이용하기 때문에 GABA의 저가의 대량생산공정에는 적합하지 않을 수 있다.

이에, 본 발명자들은 바이오매스에서 생산된 글루탐산나트륨을 이용하여 GABA를 고농도로 전환하는 공정을 개발하여 나일론 4의 모노머로 이용될 수 있는 GABA의 경제적인 제조 공정 기술을 개발하기 위하여 연구한 결과, 락토바실러스 속(Lactobacillus) 균주가 세포막을 약화시키는 물질과 함께 배양할 경우 GABA 생성능이 증가하고, 미생물 유래 글루타메이트 디카르복실라아제 유전자로 형질전환된 락토바실러스 속 균주가 GABA를 생성하는 야생성 락토바실러스 속 균주에 비해 현저하게 향상된 GABA 생성능을 가지고 있음을 확인하여, 상기 균주는 GABA를 저가로 대량 생산하는데 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 락토바실러스 균주 또는 재조합 락토바실러스 균주를 이용하여 글루탐산나트륨으로부터 감마-아미노부틸산을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주를, MSG(monosodium glutamate)를 포함하고 글리신(glycine), 클로로포름(chloroform) 및 EDTA 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및

2) 단계 1)의 배양액으로부터 감마-아미노부틸산(γ-aminobutyric acid, GABA)을 수득하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 속 균주에 의한 GABA의 제조방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 미생물 유래의 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase) 유전자를 발현벡터 내로 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;

2) 단계 1)에서 제조한 재조합 벡터를 락토바실러스 속 균주에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계;

3) 단계 2)에서 제조한 형질전환체를 MSG가 첨가된 배지에서 배양하는 단계; 및

4) 단계 3)의 배양액으로부터 GABA를 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 락토바실러스 속 균주에 의한 GABA의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른, 락토바실러스 속(Lactobacillus) 균주는 세포막을 약화시키는 물질(글리신, 클로로포름 또는 EDTA)과 함께 배양할 경우, 글루탐산나트륨(monosodium glutamate, MSG)으로부터 GABA 전환 생산능이 향상되고, 미생물 유래 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase) 유전자를 형질전환시킨 재조합 락토바실러스 속 균주는 야생형에 비해 GABA 생산능이 우수하므로, 상기 락토바실러스 속 균주 또는 재조합 락토바실러스 속 균주를 이용한 GABA의 제조방법은 GABA 대량 생산을 통한 상업화 기술에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

하기 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주에 의한 감마-아미노부틸산(γ-aminobutyric acid, GABA)의 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법은,

1) 락토바실러스 속 균주를, MSG(monosodium glutamate)를 포함하고 글리신(glycine), 클로로포름(chloroform) 및 EDTA 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및

2) 단계 1)의 배양액으로부터 GABA를 수득하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 락토바실러스 속 균주는 모든 종류의 락토바실러스 속 균주에 적용될 수 있으나, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)인 것이 바람직하고, 락토바실러스 브레비스 KCTC3102, 락토바실러스 브레비스 IFO12005 또는 락토바실러스 브레비스 ATCC367인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 1)의 글리신, 클로로포름 및 EDTA는 락토바실러스 속 균주의 세포막을 약화시키는 물질로서, 상기 글리신은 0.1 중량%, 클로로포름은 0.1 중량%, 및 EDTA는 10 mM의 농도로 배지에 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 1)의 MSG는 글루타메이트 디카르복실라아제의 기질로서, 글루타메이트 그 자체뿐만 아니라 글루타메이트의 다양한 무기염 형태를 사용할 수도 있다. 구체적으로, 상기 기질은 글루타메이트 또는 글루타메이트의 소듐염이 이용될 수 있고, 소듐염 중에서 MSG(monosodium glutamate)가 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 MSG는 본 발명의 방법이 산업적인 스케일로 실시되는 경우에 비용 측면에서 매우 유리할 수 있다.

상기 단계 1)의 배지는 락토바실러스 속 균주의 배양에 이용되는 어떠한 배지도 사용가능하나, 바람직하게는 MRS(deMan Rogosa Sharpe) 배지, APT (All Purpose with Tween) 배지 또는 BHI (Brain Heart Infusion) 배지이며, 가장 바람직하게는 MRS 배지이나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 1)의 배지는 pH 4.0 내지 5.0인 것이 바람직하고, pH 4.6으로 일정하게 유지되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 1)의 배양은 48 내지 96시간 동안 실시될 수 있으나 이에 한정되지 않고, 배양 온도는 20-40℃인 것이 바람직하고, 37℃인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 2)의 GABA는 다양한 방법으로 수득할 수 있다. 예를 들어, 배양액을 분무 건조하여 저농도의 GABA-함유 분말을 대량으로 얻을 수 있고, 배양액을 감압 증발기를 이용하여 농축한 후 동결건조를 진행하면 고농도의 GABA 수득이 가능하다. 또한, 고순도의 GABA를 얻기 위해서는 이온교환수지를 이용한 정제방법을 사용한 후 농축 및 건조 공정을 수행할 수 있다. 상기 GABA는 온도 및 pH의 변화에 크게 영향을 받지 않고, 공정 안정성이 있기 때문에, 회수 공정상의 제한은 없다.

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 다양한 야생형 락토바실러스 속 균주를 MSG가 첨가된 MRS 배지에서 배양한 후 GABA 전환 생산능을 확인하여 GABA 생산능이 높은 균주들을 선별하였다. 그 결과, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KCTC3102, 락토바실러스 브레비스 IFO12005 및 락토바실러스 브레비스 ATCC367 균주가 높은 GABA 전환 생산능을 갖는 것을 확인하였고, 락토바실러스 브레비스 ATCC367 균주를 MRS 배지에서 배양한 후 각각 다른 세포성장 단계에서 균주를 수득한 후(OD₆₀₀ = 2 또는 8), MSG로부터 GABA로의 전환 반응을 수행한 결과, OD₆₀₀=8에서 수득한 락토바실러스 브레비스 ATCC367 균주를 아세테이트(acetate) 버퍼(pH = 4.6)에 OD₆₀₀가 80이 되도록 현탁한 후 반응할 때 53 g/ℓ의 MSG로부터 36.5 g/ℓ의 GABA가 생산되었음을 확인함으로써, 생산된 GABA 농도가 가장 높은 것으로 나타났다(표 2 참조).

본 발명자들은 균주의 세포막을 약화시킬 수 있는 물질의 첨가 효과를 확인하기 위하여, 글리신, 클로로포름 또는 EDTA를 락토바실러스 브레비스 배양시 배지에 첨가하여 생산된 GABA의 농도를 측정하였다. 그 결과, 상기 물질들을 처리한 락토바실러스 브레비스 균주는 처리하지 않은 것에 비해 GABA 생성 속도가 빠른 것을 확인하였고, 글리신 0.1%, 클로로포름 0.1%, 또는 EDTA 10 mM을 첨가했을 때 GABA 생산이 증가됨을 확인하였다(표 3 내지 5 참조).

따라서, 락토바실러스 속 균주의 세포막을 약화시킴으로써 상기 균주의 GABA 생성능이 매우 향상됨을 확인하였으므로, 상기 GABA 제조방법은 GABA의 대량 생산에 유용하게 사용할 수 있다.

아울러, 본 발명은 재조합 락토바실러스 속 균주에 의한 GABA의 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법은,

1) 미생물 유래의 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase) 유전자를 발현벡터 내로 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;

2) 단계 1)에서 제조한 재조합 벡터를 락토바실러스 속 균주에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계;

3) 단계 2)에서 제조한 형질전환체를 MSG가 첨가된 배지에서 배양하는 단계; 및

4) 단계 3)의 배양액으로부터 GABA를 수득하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 미생물은 대장균(Escherichia coli, E. coli), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 락토바실러스 브레비스 ATCC367, 락토코커스 락티스 IL1403 및 E. coli W3110으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 더욱 바람직하며, E. coli W3110인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않고, 글루타메이트 디카르복실라아제를 발현하는 미생물이라면 무엇이든 사용가능하다.

상기 단계 1)의 글루타메이트 디카르복실라아제 유전자는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, E. coli W3110로부터 유래한 글루타메이트 디카르복실라아제의 465번째 아미노산인 히스티딘이 알라닌으로 치환된, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 1)의 발현벡터는 유산균(lactic acid bacteria)에서 작동가능한 벡터인 것이 바람직하고, 유산균과 대장균에서 복제가능한 pMG36e인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 2)의 락토바실러스 속 균주는 모든 종류의 락토바실러스 속 균주에 적용될 수 있으나, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)인 것이 바람직하고, 락토바실러스 브레비스 KCTC3102, 락토바실러스 브레비스 IFO12005 또는 락토바실러스 브레비스 ATCC367인 것이 더욱 바람직하며, 락토바실러스 브레비스 KCTC3102인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 3)의 배지는 락토바실러스 속 균주의 배양에 이용되는 어떠한 배지도 사용가능하나, 바람직하게는 MRS(deMan Rogosa Sharpe) 배지, APT (All Purpose with Tween) 배지 또는 BHI (Brain Heart Infusion) 배지이며, 가장 바람직하게는 MRS 배지이나 이에 한정되지 않는다.

상기 제조방법에 있어서, 상기 단계 3)의 배지는 균주의 세포막을 약화시킬 수 있는 물질인, 글리신(glycine), 클로로포름(chloroform) 또는 EDTA를 추가적으로 포함될 수 있다.

상기 단계 3)의 배지는 pH 4.0 내지 5.0인 것이 바람직하고, pH 4.6으로 일정하게 유지되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 3)의 배양은 48 내지 96시간 동안 실시될 수 있으나 이에 한정되지 않고, 배양 온도는 20-40℃인 것이 바람직하고, 37℃인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 글루타메이트 디카르복실라아제를 발현하는 플라스미드를 제작하고 이를 형질전환하여 재조합 락토바실러스 균주를 제작한 다음, 상기 균주를 이용하여 MSG로부터 GABA를 생산하였다. 구체적으로, 대장균-유산균 셔틀벡터인 pMG36e 벡터에, 서열번호 1로 기재되는 E. coli W3110 유래의 글루타메이트 디카르복실라아제의 465번째 아미노산인 히스티딘이 알라닌(서열번호 2) 또는 종결코돈으로 특정부위돌연변이화(site-directed mutagenesis)된 글루타메이트 디카르복실라아제, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) IL1403 유래의 글루타메이트 디카르복실라아제(서열번호 3), 또는 락토바실러스 브레비스 ATCC367 유래의 글루타메이트 디카르복실라아제(서열번호 4)를 암호화하는 유전자를 각각 삽입하여 발현벡터(pECGadBH465A #2, pECGadBH465stop #1, PLLGadB(lactics) #1, 및 pLBGadB(367) #1)를 제조하였다. 상기 제조한 각각의 발현벡터를 락토바실러스 브레비스 KCTC3102 균주에 형질전환하여 재조합 락토바실러스 브레비스 균주를 제조하였고, 이를 MSG가 첨가된 MRS 배지에 배양하여 MSG로부터 전환된 GABA의 농도를 측정한 결과, 465번째 아미노산인 히스티딘이 알라닌으로 치환된 E. coli W3110 유래의 글루타메이트 디카르복실라아제로 형질전환된 균주(pECGadBH465A #2)의 GABA 생성능이 가장 뛰어났고(표 7 참조), MSG 30, 60 또는 100 g/ℓ로 첨가된 MRS 배지에서 배양한 결과, 야생형 락토바실러스 브레비스 KCTC3102 균주에 비해, GABA의 생산 농도가 현저히 증가됨을 확인하였다(표 8 내지 10 참조).

따라서, 상기 GABA 제조방법은 GABA 생성능이 매우 우수한 글루타메이트 디카르복실라아제 효소를 과발현하는 재조합 락토바실러스 브레비스 균주를 이용함으로써, 상기 효소의 기질인 MSG로부터 GABA의 대량 생산에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

글루탐산나트륨( Monosodium Glutamate , MSG )으로부터 GABA 생산능이 뛰어난 유산균( lactic acid bacteria )의 스크리닝

한국생명공학연구원 유전자은행(Korean Collection for Type Culture, KCTC) 또는 미국세포주은행(American Type Culture Collection, ATCC) 등에서 분양받은 유산균 균주들의 감마-아미노부틸산(γ-aminobutyric acid, GABA) 생산능을 측정하여 GABA 생산능이 뛰어난 균주들을 스크리닝하였다. 유산균 균주를 10 ㎖ MRS(deMan Rogosa Sharpe) 배지(DIFCO, USA)에 접종하여 정치배양 조건에서 16시간 동안 1차 종배양하였다. 이후, 상기 배양액 1 ㎖을 다시 100 ㎖ MRS 배지에 접종한 후, 배양액의 OD₆₀₀이 2가 되었을 때 MSG를 30 g/ℓ로 첨가한 후 140시간까지 배양하고, 각각의 시료를 수득하여 MSG 및 GABA의 농도를 측정하였다.

그 결과, 하기 표 1에 기재한 바와 같이, 다양한 유산균 중에서 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis , L. brevis)가 가장 높은 GABA 생성능을 갖는 것으로 나타났다(표 1).

균주	배양시간 (시간)	MSG (g/ℓ)	GABA (g/ℓ)
L. paracasei 13169	120	39.9
L. paracasei 3510	120	42.1
L. paracasei 3498	120	11.3	6.9
Leuconostoc fallax 3537	140	35.89
Leuconostoc citreumi 3926	140	32.39
Sporolactobacillus inulinus 5032	140	32.74
Leuconostoc mesenteroides 3535	140	29.40
L. delbrueckii 1047	140	27.91
Leuconostoc carnosum 3525	140	31.42
Lueconostoc mesenteroides 3530	140	34.08
Lactobacillus brevis 3102	140	27.93
Leuconostoc citreum 3721	140	35.35
Lueconostoc mesenteroides 3100	140	30.74
Lactobacillus brevis 3102	120	0	22.52
Lactobacillus brevis 13094	120	0	24.68
Lactobacillus brevis 12005	120	18.99	16.16
Lactobacillus brevis 3498	96	31.72	4.58
Lactobacillus brevis 367	24	3.91	22.59
Lactobacillus brevis 367	140	0	18.74
L. paracasei 13090	140	30.46
L. paracasei 3165	140	38.91
L. johnsonii 3801	140	41.92
L. johnsonii 3801	140	31.45
L. delbrueckii 13412	140	44.51	0.634

락토바실러스 브레비스 ATCC367 균주를 이용한 GABA 생산

<2-1> 락토바실러스 브레비스 ATCC365 균주의 GABA 생산능 확인

L. brevis ATCC367 균주를 MRS 배지에서 배양하여 배양액의 OD₆₀₀이 8이 되었을 때, 균주를 수득한 후 0.2M Na-acetate(pH 4.6) 버퍼에 OD₆₀₀이 각각 30, 50 및 80이 되도록 농축하여 현탁한 후, MSG를 50 g/ℓ가 되게 첨가하였다. 그 후, 37℃에서 배양하면서 GABA 생성을 확인하였다.

그 결과, 하기 표 2에 기재한 바와 같이, OD₆₀₀이 80이 되도록 농축한 후 반응을 하였을 때, GABA 농도가 가장 높았으며 48시간 후에 약 36.5 g/ℓ의 GABA가 생산되었다(표 2).

시간	OD30		OD50		OD80
	MSG (g/ℓ)	GABA (g/ℓ)	MSG (g/ℓ)	GABA (g/ℓ)	MSG (g/ℓ)	GABA (g/ℓ)
0	50.8	0	53.9	0	53.3	0
2	55.4	1.5	56.2	2.6	45.7	4.6
4	50.9	2.4	51.9	4.1	42.3	7.7
6	54.4	3.2	47.8	5.1	41.4	10.1
25	26.3	4.7	24.2	9.0	16.2	23.8
48	41.8	10.2	32.4	17.3	11.1	36.5

<2-2> 세포막이 약화된 락토바실러스 브레비스 ATCC365 균주의 GABA 생산능 확인

GABA 생산성을 높이기 위하여 상기 실시예 <2-1>의 반응버퍼에 세포막을 약화시킬 수 있는 화학물질인 글리신(glycine), 클로로포름(chloroform), 또는 EDTA를 처리하여 GABA 생산을 측정하였다. 구체적으로, L. brevis ATCC367 균주를 MRS 배지에서 배양하여 배양액의 OD₆₀₀이 8이 되었을 때 세포를 수득한 후 0.2M Na-acetate(pH 4.6) 버퍼에 OD₆₀₀이 각각 80이 되도록 농축하여 현탁한 후 MSG를 50 g/ℓ가 되도록 첨가하였다. 그 후 37℃에서 배양하면서 GABA 생성을 확인하였다. 이때, 글리신, 클로로포름 또는 EDTA는 하기 표 3에 기재한 농도로 반응 버퍼에 첨가하였다.

그 결과, 하기 표 3 내지 표 5에 기재한 바와 같이, 글리신 0.1%, 클로로포름 0.1%, 또는 EDTA 10 mM을 첨가하였을 때 L. brevis ATCC365 균주로부터 생산되는 GABA 농도가 가장 높게 나타났다. 이는 상기 화학물질을 첨가하지 않았을 때의 결과와 유사하였으나, 25시간 동안 반응시킨 후 생산된 GABA 농도를 비교하였을 때, 글리신, 클로로포름 또는 EDTA를 첨가하면 더욱 짧은 시간에 반응이 빨리 진행되는 것으로 나타났다. 또한, 글리신 0.1%의 조건에서 38.3 g/ℓ의 GABA가 생성되어 글리신을 첨가하지 않았을 때보다 높은 GABA 농도를 확인하였다(표 3 내지 표 5).

시간	글리신 0.1%		글리신 0.5%		글리신 1%
	MSG (g/ℓ)	GABA (g/ℓ)	MSG (g/ℓ)	GABA (g/ℓ)	MSG (g/ℓ)	GABA (g/ℓ)
0	46.7	0	47.9	0	53.7	0
2	34.6	3.7	36.2	3.8	52.6	0
4	44.6	7.9	45.7	7.8	63.2	0.7
6	40.7	9.6	43.6	9.9	64.2	0.9
25	20.0	23.7	17.2	21.8	54.1	1.0
48	16.6	38.3	13.5	35.2	63.2	1.4

시간	클로로포름 0.1%		클로로포름 0.5%		클로로포름 1%
	MSG (g/ℓ)	GABA (g/ℓ)	MSG (g/ℓ)	GABA (g/ℓ)	MSG (g/ℓ)	GABA (g/ℓ)
0	55.0	0	58.3	0	48.5	0
2	50.2	6.1	34.0	3.1	42.2	6.9
4	41.8	9.0	50.2	6.5	41.3	12.0
6	38.7	11.3	52.9	8.2	38.1	12.6
25	35.8	14.3	40.8	10.6	14.3	29.9
48	7.8	35.1	44.1	12.9	38.5	16.8

시간	EDTA 10 mM		EDTA 20 mM		EDTA 30 mM
	MSG (g/ℓ)	GABA (g/ℓ)	MSG (g/ℓ)	GABA (g/ℓ)	MSG (g/ℓ)	GABA (g/ℓ)
0	63.8	0	64.2	0	57.7	0
2	39.0	3.8	38.0	3.8	33.6	3.5
4	41.9	6.8	38.9	7.0	40.7	7.3
6	43.0	9.1	39.2	9.3	38.7	8.9
25	24.4	22.0	22.6	20.2	22.0	20.8
48	18.5	30.4	20.9	28.1	19.9	27.9

재조합 L. brevis KCTC3102 균주를 이용한 GABA 생산

<3-1> 글루타메이트 디카르복실라아제( Glutamate decarboxylase )를 발현하는 재조합 발현벡터의 제작

pMG36e 벡터는 유산균(Lactic acid bacteria)와 대장균(E. coli)에서 복제(replication)가 일어나며, 유산균에서 작동하는 프로모터를 가지고 있는 발현벡터이다. 유전자의 클로닝 및 발현을 용이하게 하기 위하여 pMG36e 벡터의 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)를 우선적으로 바꾸었고 그 벡터 이름을 pMG36e-2라 명명하였다. 구체적으로, pMG36e에 존재하는 프로모터, MCS, 전사 종결자(transcription terminator) 부분을 제거하고 원하는 발현 모듈을 삽입하기 위해서 프로모터 앞 부분의 EcoRⅠ 부위, 전사 종결자 뒷부분의 PvuⅡ 부위를 이용하였다. 우선, pMG36e에 존재하는 프로모터 부분을 하기 표 6의 프라이머 1, 2 및 3을 사용하여 PCR을 실시하여 증폭하였다. 또한, 상기와 같이 증폭하여 수득한 유전자조각을 주형으로 하여 다시 프라이머 1 및 3을 사용하여 PCR을 수행하여 유전자조각을 수득하였다. 이렇게 수득한 유전자 조각은 pMG36e에 존재하는 프로모터와 인위적으로 제작된 MCS를 보유하게 되며, 5' 부분에 MfeⅠ, 3' 부분에 HindⅢ 인식 부위를 갖게 제작되었다. 상기 유전자조각을 MfeⅠ 및 HindⅢ로 처리한 후, EcoRⅠ 및 HindⅢ로 자른 pMG36e 벡터에 삽입하여, pMG36e-2 벡터를 제작하였다. 그런 다음, 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase) 유전자를 L. brevis ATCC367 (프라이머 4 및 5 사용)(서열번호 4), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) IL1403 (프라이머 6 및 7 사용)(서열번호 3), E. coli W3110 (프라이머 8 및 9)(서열번호 1)으로부터 PCR을 통해 증폭하여, pMG36e-2 벡터에 삽입하여 글루타메이트 디카르복실라아제 발현벡터를 제작하였다. 이때, E. coli gadB의 경우, 465번째 아미노산인 히스티딘을 변화시켰을 때 높은 pH에서도 글루타메이트 디카르복실라아제의 활성을 유지하는 것으로 알려져 있으므로, 465번째 아미노산 히스티딘은 종결코돈 또는 알라닌(서열번호 2)으로 특정부위돌연변이화(site-directed mutagenesis)를 유도하였다. 프라이머 8 및 10번을 이용하여 PCR을 한 후 히스티딘이 변화된 유전자를 시퀀싱을 통하여 선별하였다.

프라이머	서열(5'-3')	서열번호
1	caattgagattaatagttttagctatt	5
2	cgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcattcctccgaatatttttttacc	6
3	aagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccg	7
4	gagctcgcatgaataaaaacgatcaggaaac	8
5	cctgcaggttaacttcgaacggtggtcttg	9
6	gaattcatgttatacggaaaagaaaatc	10
7	ggtaccttagtgagtaaatccatatg	11
8	gagctcatggataagaagcaagtaac	12
9	ggatcctcaggtRtgtttaaagctgt	13
10	ggatcctcaggtNgNtttaaagctgttctgttgggc	14

<3-2> 재조합 L. brevis KCTC3102 균주를 이용한 GABA 생산

상기 실시예 <3-1>에서 제조한 각각의 발현벡터를 L. brevis KCTC3102 균주에 형질전환하여 재조합 L. brevis KCTC3102 균주를 제조하였고, 이를 10 ㎖ MRS 배지(DIFCO, USA)에 접종하여 정치배양 조건에서 16시간 동안 1차 종배양하였다. 이후, 상기 배양액 1 ㎖을 다시 100 ㎖의 MRS 배지에 접종한 후, 배양액의 OD₆₀₀이 2가 되었을 때, MSG를 15 g/ℓ로 첨가한 후 96시간까지 배양하고, 시료을 수득하여 MSG 및 GABA의 농도를 측정한 결과, 하기 표 7에 기재한 바와 같이, pECGadBH465A 플라스미드를 함유하고 있는 재조합 L. brevis의 GABA 생성능이 가장 뛰어난 것으로 확인되었다(표 7). 이에, 상기 재조합 L. brevis를 이용하여 더 높은 농도의 MSG 전환 실험을 수행하였다. 구체적으로, 상기와 같은 방법으로 재조합 L. brevis를 배양하여 배양액의 OD₆₀₀이 2가 되었을 때, MSG를 30, 60 및 100 g/ℓ로 각각 첨가한 후 72시간까지 배양하였고, 각각의 시표를 수득하여 MSG 및 GABA의 농도를 측정하였다.

그 결과, 하기 도 8 내지 도 10에 기재한 바와 같이, pECGadBH465A 플라스미드를 함유하고 재조합 L. brevis KCTC3102 균주는 MSG가 30, 60 및 100 g/L로 각각 첨가된 MRS 배지에서 배양함에 따라, 야생형 L. brevis KCTC3102 균주에 비해 GABA 생산 농도가 현저히 증가된 것으로 확인되었다(표 8 내지 10).

시간	3102			pMG-2			pECGadBH465A #2
	OD	MSG	GABA	OD	MSG	GABA	OD	MSG	GABA
0	2.00	21.72	0.00	2.00	21.73	0.00	2.00	22.31	0.00
24	5.82	5.09	13.80	2.72	22.07	2.35	5.19	8.16	11.56
48	5.18	0.00	14.10	5.76	0.00	14.70	4.50	0.00	16.43
96	3.91	0.00	16.65	4.50	0.00	14.71	3.70	0.00	16.02
시간	pECGadBH465stop #1			pLLGadB ( lactics ) #1			pLBGadB (367) #1
	OD	MSG	GABA	OD	MSG	GABA	OD	MSG	GABA
0	2.00	22.45	0.00	2.00	23.75	0.00	2.00	21.67	0.00
24	2.53	20.43	0.00	2.24	26.15	0.00	2.61	20.92	0.00
48	4.20	10.29	8.81	2.66	23.03	2.38	5.70	0.00	13.73
96	4.14	0.00	14.64	4.53	0.00	15.02	4.35	0.00	15.61

시간	3102			pMG -2			pECGadBH465A #2
	OD	MSG	GABA	OD	MSG	GABA	OD	MSG	GABA
0	2.26	20.77	0	2.06	23.61	0.00	2.24	34.81	0.00
72	5.84	0	22.87	6.32	0	26.68	4.87	0	24.83

MSG 30 g/ℓ를 처리한 경우.

	3102			pMG -2			pECGadBH465A #2
	OD	MSG	GABA	OD	MSG	GABA	OD	MSG	GABA
0h	2.30	42.26	0	2.08	86.20	0	2.63	77.53	0
72h	5.17	0	35.59	6.12	20.32	33.9	5.04	0	46.88

MSG 60 g/ℓ를 처리한 경우.

	3102			pMG-2			pECGadBH465A #2
	OD	MSG	GABA	OD	MSG	GABA	OD	MSG	GABA
0	2.20	89.4	0	2.02	91.1	0	2.24	109.38	0
72	5.41	49.1	29.9	4.86	73.1	24.5	3.95	64.49	31.9

MSG 100 g/ℓ를 처리한 경우.

<110> Korea Research Institute of Chemical Technology <120> Method for Preparing GABA by mono sodium glutamtate using Lactobacillus strain or recombinant Lactobacillus strain <130> 10p-11-62 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 466 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Asp Lys Lys Gln Val Thr Asp Leu Arg Ser Glu Leu Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Phe Gly Ala Lys Ser Ile Ser Thr Ile Ala Glu Ser Lys Arg Phe 20 25 30 Pro Leu His Glu Met Arg Asp Asp Val Ala Phe Gln Ile Ile Asn Asp 35 40 45 Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Ala Arg Gln Asn Leu Ala Thr Phe Cys 50 55 60 Gln Thr Trp Asp Asp Glu Asn Val His Lys Leu Met Asp Leu Ser Ile 65 70 75 80 Asn Lys Asn Trp Ile Asp Lys Glu Glu Tyr Pro Gln Ser Ala Ala Ile 85 90 95 Asp Leu Arg Cys Val Asn Met Val Ala Asp Leu Trp His Ala Pro Ala 100 105 110 Pro Lys Asn Gly Gln Ala Val Gly Thr Asn Thr Ile Gly Ser Ser Glu 115 120 125 Ala Cys Met Leu Gly Gly Met Ala Met Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg 130 135 140 Met Glu Ala Ala Gly Lys Pro Thr Asp Lys Pro Asn Leu Val Cys Gly 145 150 155 160 Pro Val Gln Ile Cys Trp His Lys Phe Ala Arg Tyr Trp Asp Val Glu 165 170 175 Leu Arg Glu Ile Pro Met Arg Pro Gly Gln Leu Phe Met Asp Pro Lys 180 185 190 Arg Met Ile Glu Ala Cys Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val Val Pro Thr 195 200 205 Phe Gly Val Thr Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Pro Gln Pro Leu His 210 215 220 Asp Ala Leu Asp Lys Phe Gln Ala Asp Thr Gly Ile Asp Ile Asp Met 225 230 235 240 His Ile Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Leu Ala Pro Phe Val Ala Pro 245 250 255 Asp Ile Val Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser Ile Ser Ala 260 265 270 Ser Gly His Lys Phe Gly Leu Ala Pro Leu Gly Cys Gly Trp Val Ile 275 280 285 Trp Arg Asp Glu Glu Ala Leu Pro Gln Glu Leu Val Phe Asn Val Asp 290 295 300 Tyr Leu Gly Gly Gln Ile Gly Thr Phe Ala Ile Asn Phe Ser Arg Pro 305 310 315 320 Ala Gly Gln Val Ile Ala Gln Tyr Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Gly Arg 325 330 335 Glu Gly Tyr Thr Lys Val Gln Asn Ala Ser Tyr Gln Val Ala Ala Tyr 340 345 350 Leu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Leu Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Cys Thr 355 360 365 Gly Arg Pro Asp Glu Gly Ile Pro Ala Val Cys Phe Lys Leu Lys Asp 370 375 380 Gly Glu Asp Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Glu Arg Leu Arg 385 390 395 400 Leu Arg Gly Trp Gln Val Pro Ala Phe Thr Leu Gly Gly Glu Ala Thr 405 410 415 Asp Ile Val Val Met Arg Ile Met Cys Arg Arg Gly Phe Glu Met Asp 420 425 430 Phe Ala Glu Leu Leu Leu Glu Asp Tyr Lys Ala Ser Leu Lys Tyr Leu 435 440 445 Ser Asp His Pro Lys Leu Gln Gly Ile Ala Gln Gln Asn Ser Phe Lys 450 455 460 His Thr 465 <210> 2 <211> 466 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Asp Lys Lys Gln Val Thr Asp Leu Arg Ser Glu Leu Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Phe Gly Ala Lys Ser Ile Ser Thr Ile Ala Glu Ser Lys Arg Phe 20 25 30 Pro Leu His Glu Met Arg Asp Asp Val Ala Phe Gln Ile Ile Asn Asp 35 40 45 Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Ala Arg Gln Asn Leu Ala Thr Phe Cys 50 55 60 Gln Thr Trp Asp Asp Glu Asn Val His Lys Leu Met Asp Leu Ser Ile 65 70 75 80 Asn Lys Asn Trp Ile Asp Lys Glu Glu Tyr Pro Gln Ser Ala Ala Ile 85 90 95 Asp Leu Arg Cys Val Asn Met Val Ala Asp Leu Trp His Ala Pro Ala 100 105 110 Pro Lys Asn Gly Gln Ala Val Gly Thr Asn Thr Ile Gly Ser Ser Glu 115 120 125 Ala Cys Met Leu Gly Gly Met Ala Met Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg 130 135 140 Met Glu Ala Ala Gly Lys Pro Thr Asp Lys Pro Asn Leu Val Cys Gly 145 150 155 160 Pro Val Gln Ile Cys Trp His Lys Phe Ala Arg Tyr Trp Asp Val Glu 165 170 175 Leu Arg Glu Ile Pro Met Arg Pro Gly Gln Leu Phe Met Asp Pro Lys 180 185 190 Arg Met Ile Glu Ala Cys Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val Val Pro Thr 195 200 205 Phe Gly Val Thr Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Pro Gln Pro Leu His 210 215 220 Asp Ala Leu Asp Lys Phe Gln Ala Asp Thr Gly Ile Asp Ile Asp Met 225 230 235 240 His Ile Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Leu Ala Pro Phe Val Ala Pro 245 250 255 Asp Ile Val Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser Ile Ser Ala 260 265 270 Ser Gly His Lys Phe Gly Leu Ala Pro Leu Gly Cys Gly Trp Val Ile 275 280 285 Trp Arg Asp Glu Glu Ala Leu Pro Gln Glu Leu Val Phe Asn Val Asp 290 295 300 Tyr Leu Gly Gly Gln Ile Gly Thr Phe Ala Ile Asn Phe Ser Arg Pro 305 310 315 320 Ala Gly Gln Val Ile Ala Gln Tyr Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Gly Arg 325 330 335 Glu Gly Tyr Thr Lys Val Gln Asn Ala Ser Tyr Gln Val Ala Ala Tyr 340 345 350 Leu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Leu Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Cys Thr 355 360 365 Gly Arg Pro Asp Glu Gly Ile Pro Ala Val Cys Phe Lys Leu Lys Asp 370 375 380 Gly Glu Asp Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Glu Arg Leu Arg 385 390 395 400 Leu Arg Gly Trp Gln Val Pro Ala Phe Thr Leu Gly Gly Glu Ala Thr 405 410 415 Asp Ile Val Val Met Arg Ile Met Cys Arg Arg Gly Phe Glu Met Asp 420 425 430 Phe Ala Glu Leu Leu Leu Glu Asp Tyr Lys Ala Ser Leu Lys Tyr Leu 435 440 445 Ser Asp His Pro Lys Leu Gln Gly Ile Ala Gln Gln Asn Ser Phe Lys 450 455 460 Ala Thr 465 <210> 3 <211> 466 <212> PRT <213> Lactobacillus lactis <400> 3 Met Leu Tyr Gly Lys Glu Asn Arg Asp Glu Ala Glu Phe Leu Glu Pro 1 5 10 15 Ile Phe Gly Ser Glu Ser Glu Gln Val Asp Leu Pro Lys Tyr Lys Leu 20 25 30 Ala Gln Gln Ser Ile Glu Pro Arg Val Ala Tyr Gln Leu Val Gln Asp 35 40 45 Glu Met Leu Asp Glu Gly Asn Ala Arg Leu Asn Leu Ala Thr Phe Cys 50 55 60 Gln Thr Tyr Met Glu Pro Glu Ala Val Lys Leu Met Ser Gln Thr Leu 65 70 75 80 Glu Lys Asn Ala Ile Asp Lys Ser Glu Tyr Pro Arg Thr Thr Glu Ile 85 90 95 Glu Asn Arg Cys Val Asn Met Ile Ala Asp Leu Trp Asn Ala Ser Glu 100 105 110 Lys Glu Lys Phe Met Gly Thr Ser Thr Ile Gly Ser Ser Glu Ala Cys 115 120 125 Met Leu Gly Gly Met Ala Met Lys Phe Ser Trp Arg Lys Arg Ala Glu 130 135 140 Lys Leu Gly Leu Asp Ile Asn Ala Lys Lys Pro Asn Leu Val Ile Ser 145 150 155 160 Ser Gly Tyr Gln Val Cys Trp Glu Lys Phe Cys Ile Tyr Trp Asp Ile 165 170 175 Glu Met Arg Glu Val Pro Met Asp Lys Glu His Met Ser Ile Asn Leu 180 185 190 Asp Lys Val Met Asp Tyr Val Asp Glu Tyr Thr Ile Gly Val Val Gly 195 200 205 Ile Met Gly Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Tyr Asp Asp Ile Lys Ala Leu 210 215 220 Asp Asn Leu Ile Glu Glu Tyr Asn Lys Gln Thr Asp Tyr Lys Val Tyr 225 230 235 240 Ile His Val Asp Ala Ala Ser Gly Gly Leu Tyr Ala Pro Phe Val Glu 245 250 255 Pro Glu Leu Glu Trp Asp Phe Arg Leu Lys Asn Val Ile Ser Ile Asn 260 265 270 Thr Ser Gly His Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Pro Gly Val Gly Trp Val 275 280 285 Leu Trp Arg Asp Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Glu Leu Ile Phe Lys Val 290 295 300 Ser Tyr Leu Gly Gly Glu Leu Pro Thr Met Ala Ile Asn Phe Ser His 305 310 315 320 Ser Ala Ser Gln Leu Ile Gly Gln Tyr Tyr Asn Phe Val Arg Tyr Gly 325 330 335 Phe Asp Gly Tyr Lys Ala Ile His Glu Arg Thr His Lys Val Ala Met 340 345 350 Phe Leu Ala Lys Glu Ile Glu Lys Thr Gly Met Phe Glu Ile Met Asn 355 360 365 Asp Gly Ser Gln Leu Pro Ile Val Cys Tyr Lys Leu Lys Glu Asp Ser 370 375 380 Asn Arg Gly Trp Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Met Lys 385 390 395 400 Gly Trp Gln Val Pro Ala Tyr Pro Leu Pro Lys Asn Leu Glu Asn Glu 405 410 415 Ile Ile Gln Arg Leu Val Ile Arg Ala Asp Phe Gly Met Asn Met Ala 420 425 430 Phe Asn Tyr Val Gln Asp Met Gln Glu Ala Ile Glu Ala Leu Asn Lys 435 440 445 Ala His Ile Leu Tyr His Glu Glu Pro Glu Asn Lys Thr Tyr Gly Phe 450 455 460 Thr His 465 <210> 4 <211> 479 <212> PRT <213> Lactobacillus brevis <400> 4 Met Asn Lys Asn Asp Gln Glu Thr Gln Gln Met Ile Asn Asn Val Asp 1 5 10 15 Leu Glu Lys Thr Phe Leu Gly Ser Val Glu Ala Gly Gln Ser Leu Pro 20 25 30 Thr Asn Thr Leu Pro Asp Asp Pro Met Ala Pro Asp Val Ala Ala Gln 35 40 45 Leu Val Glu His Tyr Arg Leu Asn Glu Ala Lys Ala Asn Gln Asn Leu 50 55 60 Ala Thr Phe Cys Thr Thr Gln Met Glu Pro Gln Ala Asp Glu Leu Met 65 70 75 80 Lys Asn Ala Leu Asn Thr Asn Ala Ile Asp Lys Ser Glu Tyr Pro Lys 85 90 95 Thr Ala Ala Met Glu Asn Tyr Cys Val Ser Met Ile Ala His Leu Trp 100 105 110 Gly Ile Pro Asp Asn Glu Lys Ile Tyr Asp Asp Phe Ile Gly Thr Ser 115 120 125 Thr Val Gly Ser Ser Glu Gly Cys Met Leu Gly Gly Leu Ala Leu Leu 130 135 140 His Ser Trp Lys His Arg Ala Lys Ala Ala Gly Phe Asp Ile Glu Asp 145 150 155 160 Leu His Ser His Lys Pro Asn Leu Val Ile Met Ser Gly Tyr Gln Val 165 170 175 Val Trp Glu Lys Phe Cys Thr Tyr Trp Asn Val Glu Met Arg Gln Val 180 185 190 Pro Ile Asn Gly Asp Gln Val Ser Leu Asp Met Asp His Val Met Asp 195 200 205 Tyr Val Asp Glu Asn Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ile Glu Gly Ile Thr 210 215 220 Tyr Thr Gly Ser Val Asp Asp Ile Gln Thr Leu Asp Asn Leu Val Thr 225 230 235 240 Glu Tyr Asn Lys Thr Ala Thr Met Pro Val Arg Ile His Val Asp Ala 245 250 255 Ala Phe Gly Gly Leu Phe Ala Pro Phe Val Asp Gly Phe Asn Pro Trp 260 265 270 Asp Phe Arg Leu Lys Asn Val Val Ser Ile Asn Val Ser Gly His Lys 275 280 285 Tyr Gly Met Val Tyr Pro Gly Leu Gly Trp Ile Val Trp Arg His Asn 290 295 300 Thr Ala Asp Ile Leu Pro Ala Glu Met Arg Phe Gln Val Pro Tyr Leu 305 310 315 320 Gly Lys Thr Val Asp Ser Ile Ala Ile Asn Phe Ser His Ser Gly Ala 325 330 335 His Ile Ser Ala Gln Tyr Tyr Asn Phe Ile Arg Phe Gly Leu Ser Gly 340 345 350 Tyr Lys Thr Ile Met Gln Asn Val Arg Lys Val Ser Leu Lys Leu Thr 355 360 365 Ala Ala Leu Lys Thr Tyr Gly Ile Phe Asp Ile Leu Val Asp Gly Ser 370 375 380 Gln Leu Pro Ile Asn Cys Trp Lys Leu Ala Asp Asp Ala Pro Val Gly 385 390 395 400 Trp Thr Leu Tyr Asp Leu Glu Ser Glu Leu Ala Lys Tyr Gly Trp Gln 405 410 415 Val Pro Ala Tyr Pro Leu Pro Lys Asn Arg Asp Asp Val Thr Ile Ser 420 425 430 Arg Ile Val Val Arg Pro Ser Met Thr Met Thr Ile Ala Asp Asp Phe 435 440 445 Leu Asp Asp Leu Lys Leu Ala Ile Asp Gly Leu Asn His Thr Phe Gly 450 455 460 Val Thr Thr Thr Val Asp Gln Asp Asn Lys Thr Thr Val Arg Ser 465 470 475 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 5 caattgagat taatagtttt agctatt 27 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 6 cgactctaga ggatccccgg gtaccgagct cgaattcatt cctccgaata tttttttacc 60 60 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 7 aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatccccg 39 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 8 gagctcgcat gaataaaaac gatcaggaaa c 31 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 9 cctgcaggtt aacttcgaac ggtggtcttg 30 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 10 gaattcatgt tatacggaaa agaaaatc 28 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 <400> 11 ggtaccttag tgagtaaatc catatg 26 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 <400> 12 gagctcatgg ataagaagca agtaac 26 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 9 <220> <221> variation <222> (13) <223> n is a A or G <400> 13 ggatcctcag gtntgtttaa agctgt 26 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 10 <220> <221> variation <222> (13) <223> n is a A, C, G, or T. <220> <221> variation <222> (15) <223> n is a A, C, G, or T. <400> 14 ggatcctcag gtngntttaa agctgttctg ttgggc 36

Claims (11)

1) 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주를, MSG(monosodium glutamate)를 포함하고 글리신(glycine), 클로로포름(chloroform) 및 EDTA 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
2) 단계 1)의 배양액으로부터 감마-아미노부틸산(γ-aminobutyric acid, GABA)을 수득하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 속 균주에 의한 GABA의 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)인 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 글리신, 클로로포름 및 EDTA의 농도는 각각 0.1 중량%, 0.1 중량% 및 10 mM인 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 배양은 48 내지 96시간 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.

1) 미생물 유래의 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase) 유전자를 발현벡터 내로 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조한 재조합 벡터를 락토바실러스 속 균주에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조한 형질전환체를 MSG가 첨가된 배지에서 배양하는 단계; 및
4) 단계 3)의 배양액으로부터 GABA를 수득하는 단계를 포함하는, 재조합 락토바실러스 속 균주에 의한 GABA의 제조방법.

제 5항에 있어서, 상기 단계 1)의 미생물은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 및 대장균(Escherichia coli, E. coli)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.

제 5항에 있어서, 상기 글루타메이트 디카르복실라아제는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 기재되는 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.

제 5항에 있어서, 상기 단계 1)의 발현벡터는 pMG36e인 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.

제 5항에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)인 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.

제 5항에 있어서, 상기 단계 3)의 배지는 글리신, 클로로포름 및 EDTA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.

제 5항에 있어서, 상기 단계 3)의 배양은 48 내지 96시간 동안 실시되는 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.