CN112391330B

CN112391330B - 一种提高重组大肠杆菌酸胁迫抗性的方法

Info

Publication number: CN112391330B
Application number: CN202011264652.8A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 杨谨华; 堵国成; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-11-12
Filing date: 2020-11-12
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2040-11-12
Also published as: CN112391330A

Abstract

本发明公开了一种提高重组大肠杆菌酸胁迫抗性的方法，属于微生物工程技术领域。本发明以海藻糖6‑磷酸水解酶TreC的基因为目的基因，以大肠杆菌为表达宿主，成功构建了一类可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的大肠杆菌工程菌；此大肠杆菌工程菌的衣康酸胁迫抗性得到了显著提高，较野生菌株最高提高了163.5倍；此大肠杆菌工程菌的琥珀酸胁迫抗性得到了显著提高，较野生菌株最高提高了2.3倍。

Description

一种提高重组大肠杆菌酸胁迫抗性的方法

技术领域

本发明涉及一种提高重组大肠杆菌酸胁迫抗性的方法，属于微生物工程技术领域。

背景技术

大肠杆菌是原核生物中一种重要的宿主菌。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。目前，已有多种高价值的有机酸生物发酵方法成功应用，其中也有人尝试以大肠杆菌为宿主来表达，但是常常存在酸胁迫的问题。

琥珀酸作为具有巨大潜力的前体物质，可以用来生产四氢呋喃等各种衍生物，在2010年被评估为“该化合物或技术已在文献中引起极大关注，具有强大的平台潜力、产品或技术的规模正在逐步扩大，以进行试点，演示或全面推广”，琥珀酸及其直接衍生物的市场潜力预计每年高达245×103吨，而琥珀酸衍生的聚合物的市场规模估计高达每年25×106吨。在传统的工程菌株发酵工艺中，琥珀酸是由曼海姆氏琥珀酸杆菌Mannheimiasucciniciproducens等发酵生产，产量约为68.41g·L^-1。这类菌株是自然存在的可以代谢产生琥珀酸，也已具有较高的产量，但是这类菌株的一个共性问题是他们的代谢改造相对来说较为复杂和困难，通常来说营养缺陷型的菌株在发酵时需要更多的营养添加物质，造成了无法实现大规模的工业应用，所以研究者们又将目光瞄准了大肠杆菌。

衣康酸学名为甲叉琥珀酸、亚甲基丁二酸，是不饱和二元有机酸，它含不饱和双键，具有活泼的化学性质，可进行自身间的聚合，也能与其他单体如丙烯腈等聚合，是化学合成工业的重要原料，也是化工生产的重要原料。采用大肠杆菌作为天然宿主时，由于大肠杆菌本身不具备衣康酸代谢能力，起初被报道出来的产量非常低，少于1g·L^-1，后来发展到4.3g·L^-1。直到最近，可见的报道中，衣康酸最高的产量也仅仅为47g·L^-1，其合成途径主要由乌头酸氧化途径产生，从最终的产量上来，仍然与采用曲霉菌属为宿主时的产量有一定差距，其产率为0.86g·h^-1·L^-1，虽然与传统的曲霉类生产菌属相比，在产量上存在一些不足，但以大肠杆菌作为衣康酸的生产宿主依然可以被认为是具有潜力的。

但是大肠杆菌本身存在对有机酸耐受性不高的限制发展因素，大肠杆菌适应生长环境为中性，可乳酸生产环境的pH值适宜在pH 5.5以上，但约50g·L^-1的有机酸即会使环境pH降低至pH 2.0左右，这对大肠杆菌的生长是一种考验。

对于酸胁迫，为维持大肠杆菌发酵生产目的蛋白的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在大肠杆菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(碳酸钙)来控制发酵环境的pH值。然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。

目前，提高大肠杆菌的酸胁迫抗性的方法则主要有：(1)诱变育种，该方法具有简便、类型繁多等特点，但工作量大、效率低是其主要缺点，且诱变后的菌种容易退化；(2)代谢工程策略，目前利用代谢工程策略提高大肠杆菌环境胁迫的方法主要包括构建新的代谢途径、拓展已有代谢途径和削弱已有代谢途径，但是，此方法存在成本高、成功率低的问题。

因此，急需找到一种新的效果好、遗传稳定性好、操作简单、成本低并且成功率高的可提高大肠杆菌酸胁迫性的方法。

发明内容

为了解决现有技术当中缺乏一种新的效果好、遗传稳定性好、操作简单、成本低并且成功率高的可提高大肠杆菌酸胁迫性的方法的问题，本发明提供了一种酸胁迫抗性提高的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌包含重组质粒，所述重组质粒为连接有目的基因的表达载体；所述目的基因为编码海藻糖6-磷酸水解酶TreC的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为大肠杆菌E.coli K12 MG1655。

在本发明的一种实施方式中，所述海藻糖6-磷酸水解酶TreC来源于大肠杆菌E.coli K12MG1655。

在本发明的一种实施方式中，所述海藻糖6-磷酸水解酶TreC的氨基酸序列如SEQID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述海藻糖6-磷酸水解酶TreC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pTrc99a。

本发明提供了一种提高大肠杆菌酸胁迫抗性的方法，在大肠杆菌中过量表达海藻糖6-磷酸水解酶TreC。

在本发明的一种实施方式中，所述过量表达为先通过编码海藻糖6-磷酸水解酶TreC的基因与表达载体构建含有编码海藻糖6-磷酸水解酶TreC基因的重组质粒，再将重组质粒导入大肠杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述酸胁迫是衣康酸胁迫。

在本发明的一种实施方式中，所述酸胁迫是琥珀酸胁迫。

本发明还提供了上述酸胁迫抗性提高的重组大肠杆菌在发酵生产代谢产物中的应用，所述代谢产物是参与有机酸代谢的物质。

在本发明的一种实施方式中，所述代谢产物是甲酸、乙酸、乳酸。

本发明还提供了一种抗酸胁迫元器件，所述元器件为携带核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的海藻糖6-磷酸水解酶TreC基因的表达载体。

有益效果：

(1)本发明在大肠杆菌中过量表达TreC蛋白显著提高大肠杆菌的酸胁迫抗性，本发明的操作简单，可广泛的应用到工业生产中。

(2)本发明通过在大肠杆菌中过量表达TreC蛋白，得到了酸胁迫抗性显著提高的重组大肠杆菌E.coli K12 MG1655/pTrc99a-TreC；该菌株对衣康酸的抗性较对照菌株提高了163.5倍，其对琥珀酸的抗性较对照菌株提高了2.3倍。

附图说明

图1：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-TreC和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在正常条件下的生长曲线图。

图2：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-TreC和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在衣康酸胁迫(pH 4.2)胁迫耐受性试验的存活率图。

图3：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-TreC和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在琥珀酸胁迫(pH 4.3)胁迫耐受性试验的存活率图。

具体实施方式

下述实施例中涉及的E.coli K12 MG1655菌株购自北京百欧博伟生物技术有限公司，pTrc99a载体购自武汉淼灵生物科技有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB固体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g·L^-1、酵母粉(Oxoid)5g·L^-1、氯化钠10g·L^-1及琼脂粉20g·L^-1。

LB液体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g·L^-1、酵母粉(Oxoid)5g·L^-1、氯化钠10g·L^-1。

衣康酸LB液体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g·L^-1、酵母粉(Oxoid)5g·L^-1、氯化钠10g·L^-1，pH 4.2(衣康酸调节)。

琥珀酸LB液体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g·L^-1、酵母粉(Oxoid)5g·L^-1、氯化钠10g·L^-1，pH 4.3(琥珀酸调节)。

实施例1：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-TreC的构建

具体步骤如下：

(1)基于NCBI数据库中的treC基因序列(编码海藻糖6-磷酸水解酶的TreC基因，参与海藻糖6-磷酸代谢途径，调控码海藻糖系统中6-磷酸水解的过程)设计分别如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示的引物pTrc99a/TreC-F，pTrc99a/TreC-R；

(2)设计分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物环p-pTrc99a-F，环p-pTrc99a-R；

(3)以E.coli K12 MG1655的基因组为模板，以p-pTrc99a/TreC-F，p-pTrc99a/TreC-R为引物通过PCR扩增获得SEQ ID NO.1所示的基因片段，得到PCR产物；

(4)以载体pTrc99a为模板，以环p-pTrc99a-F，环p-pTrc99a-R为引物通过PCR扩增获得载体线性化的长片段，得到PCR产物；

(5)将步骤(3)和(4)中获得的PCR产物进行连接，得到连接产物，然后将连接产物转化大肠杆菌E.coli K12 MG1655感受态，得到转化产物，将转化产物接种至含有氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证片段大小正确后，再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pTrc99a-TreC的重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-TreC。

(6)对照菌E.coli K12 MG1655/pTrc99a-TreB和E.coli K12 MG1655/pTrc99a的构建。

基于以上相同的方法，区别在于将TreC蛋白基因替换为核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示的TreB(trehalose-specific PTS enzyme IIBC component)蛋白基因，TreB蛋白与TreC蛋白具有相同代谢途径，构建得到重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-TreB和E.coli K12MG1655/pTrc99a作为对照菌株。

实施例2：重组菌株和对照菌株在正常条件下的生长情况

具体步骤如下：

(1)分别将实施例1中得到的菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-TreC、E.coliK12MG1655/pTrc99a-TreB和对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a接种于LB液体培养基中进行活化，放在37℃摇床中220rpm培养12h，得到种子液；

(2)分别以2％(v/v)的接种量将上述步骤(1)中得到的种子液转接至LB液体培养基中，放在37℃摇床中220rpm培养；每隔2小时取样，测定600nm波长下的OD值，绘制生长曲线(绘制得到的生长曲线如图1)。

结果如图1所示，经生长性能试验分析，培养12h后，过表达基因TreC的重组菌株的生长情况较对照菌株的生长周期略有滞后，但最终的菌体量能保持相近，说明在E.coliK12MG1655中过量表达TreC蛋白对菌株的生长性能没有影响，但是在E.coli K12 MG1655中过量表达TreB蛋白，重组菌株的生长迟滞期明显增长，使菌株的生长受到了抑制。

可见在E.coli K12 MG1655中过量表达其他TreC相同代谢途径的基因，重组菌株的生长得到了抑制。

实施例3：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-TreC在衣康酸胁迫(pH 4.2)耐受性试验

具体步骤如下：

(1)将实施例1中得到的对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a和重组菌株E.coliK12MG1655/pTrc99a-TreC分别接种于LB液体培养基中进行活化，放在37℃摇床中220rpm培养12h，得到种子液；

(2)分别以2％(v/v)的接种量将上述(1)中得到的种子液转接至新鲜的LB液体培养基中，37℃摇床中220rpm培养4.5h，培养至对数生长中期，此时的OD600为1.4-1.5，得到培养液；

(3)将步骤(2)中得到的培养液在6000rpm条件下离心5min，收集菌体，将得到的菌体经0.85％的PBS缓冲液洗涤两次后，重悬于等体积的新鲜的衣康酸LB液体培养基(pH4.2)中，胁迫不同时间；

分别将胁迫0h，1h，2h，3h，4h后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点，并接种于LB固体培养基上测定活菌数和存活率。

存活率＝(N/N₀)×100％；

其中，N₀是未经酸胁迫处理的菌悬液在平板上的活菌落数；N是胁迫后平板上长出的活菌落数。

结果如图2和表1所示，经耐受性实验分析，胁迫4h后，菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-TreC存活率为对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a的163.5倍，可见，E.coliK12 MG1655中过量表达TreC蛋白，重组菌株对衣康酸胁迫的耐受性提高。

表1驯化菌株和对照菌株在衣康酸胁迫(pH 4.2)耐受性试验的存活率

实施例4：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-TreC在琥珀酸胁迫(pH 4.3)胁迫耐受性试验

具体步骤如下：

(1)将实施例1中得到的对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a和重组菌株E.coliK12 MG1655/pTrc99a-TreC分别接种于LB液体培养基中进行活化，放在37℃摇床中220rpm培养12h，得到种子液；

(3)将步骤(2)中得到的培养液在6000rpm条件下离心5min，收集菌体，将得到的菌体经0.85％的PBS缓冲液洗涤两次后，重悬于等体积的新鲜的琥珀酸LB液体培养基(pH4.3)中，胁迫不同时间；

存活率＝(N/N₀)×100％；

结果如图3和表2所示，经耐受性实验分析，胁迫4h后，菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-TreC存活率为对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a的2.3倍，可见，E.coli K12MG1655中过量表达TreC蛋白，重组菌株对琥珀酸胁迫的耐受性提高。

表2驯化菌株和对照菌株在琥珀酸胁迫(pH 4.3)耐受性试验的存活率

实施例5：重组菌株的耐酸性稳定性试验

具体步骤如下：

1、将重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-TreC在LB液体培养基中连续传代30次，细胞生长性能无明显变化，证明本发明提供的技术方案得到的菌株具有传代稳定性。

2、具体实施方式同实施例3-4，区别在于，调整重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-TreC为步骤1得到的连续传代30次的菌株，对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a处理方式为：LB液体培养基中连续传代30次；结果为：

经衣康酸胁迫后，经耐受性实验分析，胁迫4h后，连续传代30次的菌株E.coliK12MG1655/pTrc99a-TreC存活率为0.100616，同传代之前的菌株的存活率基本一致，是连续传代30次的对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a存活率0.000541825的185.7倍；

经琥珀酸胁迫后，经耐受性实验分析，胁迫4h后，连续传代30次的菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a-TreC存活率为0.00037119，同传代之前的菌株的存活率基本一致，是连续传代30次的对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a存活率0.00021835的1.7倍。

上述实施例证明了在E.coli K12 MG1655中过量表达TreC蛋白，重组菌株对有机酸胁迫的耐受性提高，并且具有传代稳定性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高重组大肠杆菌酸胁迫抗性的方法

<130> BAA200782A

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1656

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgactcatc ttccccactg gtggcaaaac ggcgttatct accagattta tccaaagagt 60

tttcaggaca ccacgggtag cggtaccggc gatttacgtg gcgttatcca acacctggac 120

tatctgcata aactgggcgt tgatgccatc tggctaaccc ccttttatgt ctctccccag 180

gtcgataacg gttacgacgt agcgaactat acggcgattg atcccaccta cggcacgctg 240

gacgattttg acgaactggt gacgcaggca aaatcgcgcg ggattcgtat cattctcgat 300

atggtgttta accatacctc tacccaacat gcctggtttc gcgaggcgct gaacaaagaa 360

agcccttacc gccagtttta tatctggcgc gatggagaac cagaaacgcc accgaacaac 420

tggcgttcaa aatttggcgg tagtgcgtgg cgctggcatg cggaaagcga acagtactat 480

ttgcatctct ttgcaccaga acaggcggat ctcaactggg agaatccagc ggtacgcgca 540

gagctgaaaa aagtctgtga gttctgggcc gatcgtgggg tcgacgggtt gcgcctggat 600

gtggtgaatc tgatctccaa agacccgcgt ttccctgaag acctggacgg cgacgggcgt 660

cgcttctaca ccgacgggcc acgagcacac gagtttttgc acgagatgaa ccgcgatgtg 720

tttacgccac gcgggttaat gaccgtaggt gaaatgtcct ccaccagcct tgagcattgc 780

cagcgatacg cggctctgac aggcagtgaa ttgtcgatga cctttaattt tcatcacctg 840

aaggtcgatt atcccggtgg tgaaaaatgg acgctggcta aacctgactt tgtggcgttg 900

aaaacattgt tccgccactg gcaacaagga atgcacaacg tagcatggaa tgccttgttc 960

tggtgtaacc acgatcagcc gcgcattgtt tctcgctttg gtgatgaagg tgaataccgc 1020

gtgcctgcgg caaaaatgct ggcgatggtg ctgcatggca tgcagggaac gccgtatatc 1080

taccagggcg aagagattgg catgaccaac ccgcatttca cgcgcattac tgactatcgc 1140

gacgtagaga gcctcaatat gtttgccgag ctgcgcaacg atgggcgtga tgccgacgag 1200

ttattggcaa tcctcgccag taaatcccgt gacaacagtc gcacgcccat gcaatggagc 1260

aacggcgata atgccgggtt tacggctggc gaaccgtgga ttggcctggg cgataactat 1320

caacaaatca acgtagaagc cgcgctggcc gatgattcct cggtgtttta cacctaccaa 1380

aagttaatcg cactgcgtaa gcaggaagcc atcctgacat ggggcaatta ccaggatctg 1440

ctgccaaaca gccctgtatt gtggtgctat cgccgtgaat ggaaggggca aaccttgctg 1500

gtcattgcca accttagccg tgagatccaa ccctggcagg cagggcaaat gcgcggcaac 1560

tggcagcttg tgatgcataa ctacgaagaa gcctcaccac aaccctgtgc catgaattta 1620

cggccttttg aggctgtctg gtggttacag aagtaa 1656

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gaaacagacc atggaattca tgactcatct tccccactgg tg 42

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcgactcta gaggatcctt acttctgtaa ccaccagaca gcc 43

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggatcctcta gagtcgac 18

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaattccatg gtctgt 16

<210> 6

<211> 551

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Thr His Leu Pro His Trp Trp Gln Asn Gly Val Ile Tyr Gln Ile

1 5 10 15

Tyr Pro Lys Ser Phe Gln Asp Thr Thr Gly Ser Gly Thr Gly Asp Leu

20 25 30

Arg Gly Val Ile Gln His Leu Asp Tyr Leu His Lys Leu Gly Val Asp

35 40 45

Ala Ile Trp Leu Thr Pro Phe Tyr Val Ser Pro Gln Val Asp Asn Gly

50 55 60

Tyr Asp Val Ala Asn Tyr Thr Ala Ile Asp Pro Thr Tyr Gly Thr Leu

65 70 75 80

Asp Asp Phe Asp Glu Leu Val Thr Gln Ala Lys Ser Arg Gly Ile Arg

85 90 95

Ile Ile Leu Asp Met Val Phe Asn His Thr Ser Thr Gln His Ala Trp

100 105 110

Phe Arg Glu Ala Leu Asn Lys Glu Ser Pro Tyr Arg Gln Phe Tyr Ile

115 120 125

Trp Arg Asp Gly Glu Pro Glu Thr Pro Pro Asn Asn Trp Arg Ser Lys

130 135 140

Phe Gly Gly Ser Ala Trp Arg Trp His Ala Glu Ser Glu Gln Tyr Tyr

145 150 155 160

Leu His Leu Phe Ala Pro Glu Gln Ala Asp Leu Asn Trp Glu Asn Pro

165 170 175

Ala Val Arg Ala Glu Leu Lys Lys Val Cys Glu Phe Trp Ala Asp Arg

180 185 190

Gly Val Asp Gly Leu Arg Leu Asp Val Val Asn Leu Ile Ser Lys Asp

195 200 205

Pro Arg Phe Pro Glu Asp Leu Asp Gly Asp Gly Arg Arg Phe Tyr Thr

210 215 220

Asp Gly Pro Arg Ala His Glu Phe Leu His Glu Met Asn Arg Asp Val

225 230 235 240

Phe Thr Pro Arg Gly Leu Met Thr Val Gly Glu Met Ser Ser Thr Ser

245 250 255

Leu Glu His Cys Gln Arg Tyr Ala Ala Leu Thr Gly Ser Glu Leu Ser

260 265 270

Met Thr Phe Asn Phe His His Leu Lys Val Asp Tyr Pro Gly Gly Glu

275 280 285

Lys Trp Thr Leu Ala Lys Pro Asp Phe Val Ala Leu Lys Thr Leu Phe

290 295 300

Arg His Trp Gln Gln Gly Met His Asn Val Ala Trp Asn Ala Leu Phe

305 310 315 320

Trp Cys Asn His Asp Gln Pro Arg Ile Val Ser Arg Phe Gly Asp Glu

325 330 335

Gly Glu Tyr Arg Val Pro Ala Ala Lys Met Leu Ala Met Val Leu His

340 345 350

Gly Met Gln Gly Thr Pro Tyr Ile Tyr Gln Gly Glu Glu Ile Gly Met

355 360 365

Thr Asn Pro His Phe Thr Arg Ile Thr Asp Tyr Arg Asp Val Glu Ser

370 375 380

Leu Asn Met Phe Ala Glu Leu Arg Asn Asp Gly Arg Asp Ala Asp Glu

385 390 395 400

Leu Leu Ala Ile Leu Ala Ser Lys Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro

405 410 415

Met Gln Trp Ser Asn Gly Asp Asn Ala Gly Phe Thr Ala Gly Glu Pro

420 425 430

Trp Ile Gly Leu Gly Asp Asn Tyr Gln Gln Ile Asn Val Glu Ala Ala

435 440 445

Leu Ala Asp Asp Ser Ser Val Phe Tyr Thr Tyr Gln Lys Leu Ile Ala

450 455 460

Leu Arg Lys Gln Glu Ala Ile Leu Thr Trp Gly Asn Tyr Gln Asp Leu

465 470 475 480

Leu Pro Asn Ser Pro Val Leu Trp Cys Tyr Arg Arg Glu Trp Lys Gly

485 490 495

Gln Thr Leu Leu Val Ile Ala Asn Leu Ser Arg Glu Ile Gln Pro Trp

500 505 510

Gln Ala Gly Gln Met Arg Gly Asn Trp Gln Leu Val Met His Asn Tyr

515 520 525

Glu Glu Ala Ser Pro Gln Pro Cys Ala Met Asn Leu Arg Pro Phe Glu

530 535 540

Ala Val Trp Trp Leu Gln Lys

545 550

<210> 7

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

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ggcaatattg cgacggtgag ccactgtatt actcgcctac gctttgtcct caaccaaccg 120

gccaatgcca gaccgaaaga aattgagcaa ctccctatgg tgaaaggctg tttcaccaat 180

gccgggcaat ttcaggtggt gattggcacc aacgtgggtg attactatca agcactgatt 240

gcgtcaaccg gacaggcgca ggttgataaa gagcaggtaa aaaaagccgc ccggcataat 300

atgaaatggc atgagcagtt gatctctcat ttcgcggtga tcttcttccc gttgctgccc 360

gcgttgatta gcggcggttt gatcctcggt tttcgcaatg tgatcggcga tttgcccatg 420

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tggttgatcg gtgaagcgat cttcttctac ctgccggtcg gtatttgctg gtcagcggtg 540

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ttcagcatcg ccaaagtagg ctatcaggcg caggtgatcc cggcactgtt agccggactg 720

gcgctgggcg ttattgaaac tcgccttaaa cgcatcgtgc cggattacct ctatctggtg 780

gtggtacccg tctgttcgct gatcctcgcg gtgttcctcg cccatgcgct gattggtccg 840

tttggtcgca tgattggcga tggcgttgcc tttgcggtac gtcacctgat gaccggcagc 900

tttgctccga ttggcgcagc attgtttggc ttcctgtacg ccccgctggt gatcaccggt 960

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gtgtggccgc tgattgcgct gtcgaatatc gctcagggct ccgccgtgat aggcattatc 1080

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tatcagcgga aataccgcct gggcacgctg gacattgttt aa 1422

Claims

1.一种提高大肠杆菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，在大肠杆菌中过量表达来源于大肠杆菌E. coli K12 MG1655的海藻糖6-磷酸水解酶TreC；所述酸胁迫是衣康酸胁迫或琥珀酸胁迫。

2.如权利要求1所述的一种提高大肠杆菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述海藻糖6-磷酸水解酶TreC的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.如权利要求1或2所述的一种提高大肠杆菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述过量表达为先将编码海藻糖6-磷酸水解酶TreC的基因与表达载体连接，构建含有编码海藻糖6-磷酸水解酶TreC基因的重组质粒，再将重组质粒导入大肠杆菌中。