CN107828711B

CN107828711B - 一种抗酸胁迫重组乳酸菌及其构建方法

Info

Publication number: CN107828711B
Application number: CN201711351158.3A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 陈坚; 堵国成; 朱政明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2020-01-07
Anticipated expiration: 2037-12-15
Also published as: CN107828711A

Abstract

本发明公开了一种抗酸胁迫重组乳酸菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明通过在乳酸乳球菌L.lactis NZ9000中过量表达了来源于乳酸乳球菌L.lactis NZ9000的LtrC基因，得到了一株酸胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸乳球菌L.lactis NZ9000(pNZ8148/LtrC)。pH 4.0条件下胁迫3h，重组菌株的存活率为对照的3.6倍。本发明还提供了一种提高酸胁迫抗性的方法，该方法具有良好的工业应用价值。

Description

一种抗酸胁迫重组乳酸菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种抗酸胁迫重组乳酸菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

当乳酸菌被用作工业化生产之后，在其发酵过程中，随着菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累，导致细胞面临严重的酸胁迫。为维持发酵生产的稳定性并提高生产效率，工业上通常在发酵的过程中通过添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围。例如通过添加碱性物质(氨水或NaOH)来控制发酵环境的pH值。然而碱性物质的添加往往会导致副产物的积累。而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。

在低pH的环境条件下，微生物细胞活性显著降低，从而导致发酵产物的生产效率显著下降。因此提高乳酸菌的酸胁迫耐受性对于其在发酵生产中的应用有着重要的意义。目前提高乳酸菌的酸胁迫耐受性的方法主要有：(1)诱变育种，该方法具有简便、类型繁多等特点，但工作量大、效率低是其主要缺点；(2)生化工程策略，已有报道用过外源添加天冬氨酸以提高乳酸菌的酸胁迫耐受性，但该方法的使用造成了生产成本的增加；(3)代谢工程策略，目前利用代谢工程策略提高乳酸菌环境胁迫的方法主要包括构建新的代谢途径、拓展已有代谢途径和削弱已有代谢途径。上述方法或存在成本问题，或存在成功率低的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗酸胁迫元器件以提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性。

本发明首先提供了抗酸胁迫元器件，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一株酸胁迫抗性提高的重组乳酸乳球菌，过量表达LtrC蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述LtrC的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，编码所述LtrC的核苷酸序列是如SEQ ID NO.2所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，编码所述LtrC的核苷酸序列来源于Lactococcuslactis NZ9000。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的宿主为乳酸乳球菌Lactococcuslactis NZ9000。

本发明还提供了一种所述重组菌的构建方法，是将编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基因连接到表达质粒上获得重组质粒，再分别转化到宿主菌中获得重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述表达质粒为pNZ8148。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌是Lactococcus lactis NZ9000。

在本发明的一种实施方式中，所述构建方法具体是：将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148/LtrC，再将重组质粒转化到宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中，得到重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/LtrC)。

本发明还提供一种提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性的方法，是在乳酸乳球菌中过量表达LtrC蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述LtrC蛋白的氨基酸序列是如SEQ ID NO.1所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148/LtrC，再将重组质粒转化到宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中，得到重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/LtrC)，诱导表达LtrC。

本发明还提供所述重组乳酸乳球菌在食品、饲料、精细化学品领域的应用。

本发明的有益效果：本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达LtrC转运蛋白，得到了一株酸胁迫抗性显著提高的重组乳酸菌Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/LtrC)。在酸胁迫条件下，pH4.0胁迫3h后，重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/LtrC)的存活率为对照的3.6倍。

附图说明

图1：重组质粒pNZ8148/LtrC的结构图；

图2：重组菌株和对照菌株的生长曲线；

图3：pH4.0条件下重组菌株与对照菌株的存活率对比；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做更详细的说明。

实施例1重组菌株的构建

从NCBI数据库的L.lactis NZ9000中得到如SEQ ID NO.2所示的LtrC的基因序列，并将其克隆到乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148/LtrC，再将其电转入宿主菌L.lactis NZ9000中，得到重组菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148/LtrC)。

具体如下：

根据LtrC的基因序列设计分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物lrC-F、lrC-R(表1)，以L.lactis NZ9000的基因组为模板PCR扩增，获得SEQ ID NO.2所示的基因片段。将PCR产物和载体pNZ8148分别用Nco Ⅰ和HindⅢ双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接。连接产物转化大肠杆菌MC1061(商业化菌株)感受态，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pNZ8148/LtrC(重组质粒结构如图1所示)。然后从重组MC1061中提取重组质粒，电转化L.lactis NZ9000感受态细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148/LtrC)。

电转化条件为：1μL质粒中与40μL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min。电压2000V，电容25μF，电阻200Ω。电击完毕后，立即向电转杯中加入1mL含有20mM MgCl₂和2mMCaCl₂的GM17培养基(培养基配方：M17培养基+0.5％Glucose)。然后置于30℃静置培养1.5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑取转化子验证。

表1引物

实施例2过量表达LtrC菌株的生长性能试验

对于考察菌株在过量表达LtrC时的生长情况，将菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148/LtrC)和L.lactis NZ9000(pNZ8148)(对照)接种于加了10μg/mL氯霉素的GM17液体培养基(1mL)中进行活化，放在30℃培养箱中静置培养过夜。再以2％的接种量将种子液转接至新鲜的氯霉素(10μg/mL)GM17液体培养基中，30℃静置培养。每隔2小时取样，测定600nm波长下的OD值。培养至OD₆₀₀0.4时加入10ng/mL的nisin诱导表达LtrC蛋白。以时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制生长曲线。

结果如图2所示。经生长性能试验分析，重组菌株的生物量和对照菌株无明显差异，说明在L.lactis NZ9000中过量表达LtrC蛋白对菌株的生长性能没有影响。

实施例3酸胁迫条件下耐受性试验

对于考察菌株对酸的耐受性分析试验，分别测定了重组菌株和对照菌株在pH4.0条件下的存活率。

具体操作方式如下：将菌株诱导培养6h，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于等体积的新鲜的pH4.0(乳酸调节)的GM17(含有10μg/mL氯霉素)中，胁迫不同时间。胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点种于GM17氯霉素平板上测定活菌数和存活率。

经耐受性实验分析，在pH4.0的GM17中胁迫3h后，重组菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148/LtrC)的存活率为对照的3.6倍，说明重组菌株对酸胁迫的耐受性显著提高。说明通过在L.lactis NZ9000中过量表达LtrC的方法可以提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种抗酸胁迫重组乳酸菌及其构建方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 550

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Thr Thr Gln Ser Pro Glu Val Glu Pro Leu Phe His Gly Ser Asp

1 5 10 15

Arg Ser Phe Asp Lys Phe Glu Leu Gln Lys Asp Pro Thr Asn Gly Val

20 25 30

Gly Leu Gly Phe Gly Ile Tyr Leu Thr Asn His Glu Glu Ile Ala Lys

35 40 45

Arg Tyr Ala Pro Asp Gly Gly Thr Ile Tyr Lys Val Asp Pro Ser Ile

50 55 60

Ile Glu Gly Lys Ala Val Ser Ala Val Ser Leu Thr Leu Ser His Glu

65 70 75 80

Thr Val Thr Arg Met Ile Ser Ser Ile Ala Lys Asp Glu Ile Glu Glu

85 90 95

Glu Asp Tyr Pro Tyr Ile Leu Ser Glu Gly Gly Asp Glu Pro His Glu

100 105 110

Asp Trp Asp Asn Tyr Asn Ala Ser Ile Ala Ser Lys Met Ala Ala Ser

115 120 125

Phe Leu Glu Tyr Glu Asp Asn Asp Val Asp Val Ile Asn Gln Ile Tyr

130 135 140

Gln Val Ile Gly Arg Glu Pro Glu Val Ala Pro Arg Leu Leu Lys Ala

145 150 155 160

Leu Lys Asp Glu Asp Ile Thr His Ala Ser Arg Thr Ile Ala Gly Gly

165 170 175

Asp Ser Ser Gln Pro Ser Leu Glu Tyr Ile Val Phe Asn Pro Glu Asn

180 185 190

Ile Lys Ile Leu Ser Lys Glu Thr Asn Lys Val Gln Ala Asp His Asp

195 200 205

Leu Gln Ser Ile Ile Lys Asn Lys Asp Tyr Ala Ala Leu Ser Glu His

210 215 220

Leu Lys Ser Gly Val Lys Asp Tyr Leu Lys Ser Asp Val Phe Lys Lys

225 230 235 240

Phe Leu Asn Phe Ile Ser Asn Phe His Gln Tyr Ser Gln Lys Asn Val

245 250 255

Arg Leu Ile Leu Ala Gln Asn Leu Glu Ala Lys Tyr Val Ala Ser Tyr

260 265 270

Lys Lys Trp Ser Asp Glu Leu Asp Asn Pro Val Lys Lys Gly Gly Lys

275 280 285

Ala Thr Tyr Ile Tyr Ala Pro Asn Pro Val Ile Lys Arg Asp Glu Gln

290 295 300

Arg Arg Pro Ile Val Asp Glu Asn Gly Glu Val Val Lys Val Ile His

305 310 315 320

Tyr Lys Leu Val Pro Val Phe Ala Asp Asn Gln Thr Ile Asn Pro Glu

325 330 335

Asn Leu Pro Gln Pro Val Tyr Asp Leu Ser Lys Asp Leu Asp Asp Pro

340 345 350

Lys Ala Phe Ile Gln Leu Tyr Arg Ser Leu Glu Ala Ile Ala Pro Val

355 360 365

Pro Ile Glu Leu Met Glu Met Asn Asp Pro Asp Ile Lys Gly Tyr Phe

370 375 380

Ser Pro Lys Asp Gln Ile Ile Val Leu Gln Pro Gly Leu Gly Glu Val

385 390 395 400

Met Thr Leu Arg Thr Met Ile His Glu Met Thr His Ala Met Leu His

405 410 415

Thr Asp Ser Lys Ala Arg Phe Gly Asp Ser Thr Tyr Arg Arg Gln Glu

420 425 430

Phe Glu Ala Glu Ser Val Ala Tyr Ile Val Ser Lys His Leu Gly Ile

435 440 445

Asp Thr Ser Glu Tyr Ser Phe Gly Tyr Leu Ser Ser Trp Thr Gln Gly

450 455 460

Gly Asn Ser Ile Glu Ser Phe Glu Lys Ser Leu Glu Thr Ile Ser Val

465 470 475 480

Gln Ala Gln Thr Leu Ile Asn Arg Leu Glu Gln Ser Leu Thr Lys Val

485 490 495

Tyr Thr Leu Asp Ala Pro Glu Asn Lys Phe Glu Lys Arg Leu Gln Glu

500 505 510

Ala Arg Asp Lys Gly Lys Thr Gln Arg Ala Glu Pro Val Ile Thr Pro

515 520 525

Gln Pro Val Ala Glu Lys Thr Glu Gln Glu Glu Ser Pro Lys Ala Asn

530 535 540

Arg Leu Gln Arg Asn Leu

545 550

<210> 2

<211> 1653

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaccactc aatcaccaga agttgaaccc ttgtttcatg gttcagaccg ctcatttgac 60

aagtttgaac tacaaaaaga ccctacaaat ggtgtagggc ttggctttgg aatttacctc 120

acaaatcatg aagagatagc taaacgctat gctccagatg gaggaacaat ttataaagtt 180

gatccttcaa taattgaagg aaaagctgta agtgcggttt ctttaaccct ctcacacgaa 240

acggtcacgc ggatgatctc atctattgcg aaagatgaaa ttgaagaaga ggattatcct 300

tatattcttt ctgaaggagg agatgaacct catgaagatt gggataatta taacgcctca 360

attgcctcta aaatggctgc tagttttctg gaatatgagg acaatgacgt tgatgtgatc 420

aatcaaattt atcaagtaat cggacgagaa ccagaagttg cgcctcgatt attaaaggcg 480

cttaaagatg aggatattac tcatgctagt cgaacaattg caggtgggga ctcttctcag 540

ccatcccttg aatatatcgt ttttaatcct gaaaatatca aaatactttc aaaagaaacg 600

aacaaagtcc aagctgatca tgaccttcag tcaatcatta aaaataaaga ttatgccgca 660

ttatccgaac atctcaaaag tggagtaaaa gattatttaa aaagtgatgt cttcaaaaaa 720

ttcctcaatt tcatttctaa ttttcaccaa tactcacaaa aaaatgttcg gcttatttta 780

gctcaaaacc ttgaagcaaa atatgtcgcc tcttataaaa aatggagtga tgagcttgac 840

aatcctgtca agaaaggggg gaaagccact tatatttacg cccccaatcc tgttattaaa 900

agagacgagc aacgtcggcc gattgttgat gaaaacggag aagtcgtcaa ggtcatacac 960

tataaacttg ttccagtctt tgcggacaat caaaccatta atccagaaaa cctccctcaa 1020

cctgtttatg acctgtctaa agatttggat gaccctaaag cattcattca actttatcgt 1080

tcgctagaag caattgctcc agttccaatt gaattgatgg aaatgaatga ccctgatatc 1140

aaaggatatt tcagtcctaa agatcaaata attgttctcc aaccaggctt aggagaagtg 1200

atgactttgc gaacaatgat tcatgaaatg acacatgcca tgttgcatac tgactctaaa 1260

gcaaggtttg gagattcaac gtatcgcaga caagagtttg aagcagaatc tgtcgcttat 1320

atcgtttcta aacatctagg aattgatacc agcgagtaca gttttggcta tctttcttca 1380

tggacacaag gcggaaatag tattgagtcc tttgaaaaat ctcttgaaac aatcagtgtt 1440

caagcacaaa cactcatcaa ccgtttagaa caaagtctca caaaagttta taccttagat 1500

gcgcctgaaa ataaatttga aaagcgcctc caggaagcga gagataaagg taaaactcaa 1560

agggctgaac ctgttattac ccctcaacct gtggcagaaa aaacggagca agaagaatcc 1620

ccaaaagcga accgtctcca acgcaatctt taa 1653

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catgccatgg ggatgaccac tcaatcacca gaagttg 37

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccaagctttt aaagattgcg ttggagacgg 30

Claims

1.一种重组乳酸菌，其特征在于，过量表达LtrC蛋白，所述LtrC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种重组乳酸菌，其特征在于，宿主为乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000，表达载体为pNZ8148。

3.权利要求1或2所述重组乳酸菌在食品、饲料、精细化学品领域的应用。

4.一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是在乳酸菌中过量表达LtrC蛋白，所述LtrC蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。