CN107227285B

CN107227285B - 一种抗酸胁迫元器件及其应用

Info

Publication number: CN107227285B
Application number: CN201710422593.4A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 陈坚; 堵国成; 吉晓梅; 朱政明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-06-07
Filing date: 2017-06-07
Publication date: 2019-11-08
Anticipated expiration: 2037-06-07
Also published as: CN107227285A

Abstract

本发明公开了一种抗酸胁迫元器件及其应用，属于生物工程技术领域。本发明通过在乳酸乳球菌L.lactis NZ9000中分别过量表达了来源于乳酸乳球菌L.lactis A76和大肠杆菌E.coli MG1655的recT基因，得到了两株酸胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸乳球菌L.lactis NZ9000(pNZ8148/RecT‑A76)和L.lactis NZ9000(pNZ8148/RecT‑MG1655)。pH 4.0条件下胁迫3h，两重组菌株的存活率分别为对照的10.5和1.4倍；20％(v/v)乙醇条件下胁迫6h，两重组菌株的存活率分别为对照的3.7和2.1倍。本发明还提供了一种提高酸胁迫抗性的方法，该方法具有良好的工业应用价值。

Description

一种抗酸胁迫元器件及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗酸胁迫元器件及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

当乳酸菌被用作工业化生产之后，在其发酵过程中，随着菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累，导致细胞面临严重的酸胁迫。为维持发酵生产的稳定性并提高生产效率，工业上通常在发酵的过程中通过添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围。例如通过添加碱性物质(氨水或NaOH)来控制发酵环境的pH值。然而碱性物质的添加往往会导致副产物的积累。而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。

在低pH的环境条件下，微生物细胞活性显著降低，从而导致发酵产物的生产效率显著下降。因此提高乳酸菌的酸胁迫耐受性对于其在发酵生产中的应用有着重要的意义。目前提高乳酸菌的酸胁迫耐受性的方法主要有：(1)诱变育种，该方法具有简便、类型繁多等特点，但工作量大、效率低是其主要缺点；(2)生化工程策略，已有报道用过外源添加天冬氨酸以提高乳酸菌的酸胁迫耐受性，但该方法的使用造成了生产成本的增加；(3)代谢工程策略，目前利用代谢工程策略提高乳酸菌环境胁迫的方法主要包括构建新的代谢途径、拓展已有代谢途径和削弱已有代谢途径。上述方法或存在成本问题，或存在成功率低的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗酸胁迫元器件以提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性。

本发明首先提供了抗酸胁迫元器件，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了两株酸胁迫抗性提高的重组乳酸乳球菌，这两株重组菌分别过量表达同源重组蛋白RecT-A76和同源重组蛋白RecT-MG1655。

所述RecT-A76的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

所述RecT-MG1655的氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列。

编码所述RecT-A76的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中，是SEQ ID NO.3所示的序列。

编码所述RecT-MG1655的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中，是SEQ IDNO.4所示的序列。

编码所述RecT-A76的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中，来源于Lactococcus lactis A76。

编码所述RecT-MG1655的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中，来源于Escherichia coli MG1655。

所述重组菌，在本发明的一种实施方式中，宿主为乳酸乳球菌Lactococcuslactis NZ9000。

本发明解决还提供了一种所述重组菌的构建方法，是将编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的recT-A76基因和编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的recT-MG1655基因分别连接到表达质粒上获得重组质粒，再分别转化到宿主菌中获得重组菌。

所述表达质粒为pNZ8148。

所述宿主菌，在本发明的一种实施方式中是Lactococcus lactis NZ9000。

所述构建方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148/RecT-A76，再将重组质粒转化到宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中，得到重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/RecT-A76)；将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148/RecT-MG1655，再将重组质粒转化到宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中，得到重组菌株Lactococcus lactisNZ9000(pNZ8148/RecT-MG1655)。

本发明还提供一种提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性的方法，是在乳酸乳球菌中过量表达DNA同源重组蛋白RecT。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，RecT的氨基酸序列是SEQ ID NO.1或SEQID NO.2所示的序列。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：将SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148/RecT-A76，再将重组质粒转化到宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中，得到重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/RecT-A76)；将SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148/RecT-MG1655，再将重组质粒转化到宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中，得到重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/RecT-MG1655)，诱导表达RecT。

本发明还提供一种提高乳酸乳球菌乙醇胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是在乳酸乳球菌中过量表达DNA同源重组蛋白RecT。

现有研究发现RecT蛋白可显著提高DNA的同源重组效率。本发明则通过在乳酸乳球菌中过量表达RecT蛋白，得到了两株酸胁迫抗性和乙醇胁迫抗性都显著提高的重组乳酸菌Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/RecT-A76)和Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/RecT-MG1655)。在酸胁迫条件下，pH 4.0胁迫3h后，重组菌株Lactococcuslactis NZ9000(pNZ8148/RecT-A76)和Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/RecT-MG1655)的存活率分别为对照的10.5和1.4倍。在乙醇胁迫条件下，20％(v/v)乙醇胁迫6h后，重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/RecT-A76)和Lactococcus lactisNZ9000(pNZ8148/RecT-MG1655)的存活率分别为对照的3.7和2.1倍。

附图说明

图1：重组质粒pNZ8148/RecT(A76/MG1655)的结构图；

图2：重组菌株和对照菌株的生长曲线；

图3：pH 4.0条件下重组菌株与对照菌株的存活率对比；

图4：20％(v/v)乙醇胁迫条件下重组菌株与对照菌株的存活率对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做更详细的说明。

实施例1重组菌株的构建

从NCBI数据库的L.lactis A76中得到如SEQ ID NO.3所示的recT-A76的基因序列，并将其克隆到乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148/RecT-A76，再将其电转入宿主菌L.lactis NZ9000中，得到重组菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148/RecT-A76)；从NCBI数据库的E.coli MG1655中得到如SEQ ID NO.4所示的recT-MG1655的基因序列克隆到表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148/RecT-MG1655，再将其电转入宿主菌L.lactis NZ9000中，得到重组菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148/RecT-MG1655)。

具体如下：

根据recT的基因序列设计分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQID NO.8所示的引物recT-A76-BF、recT-A76-BR、recT-MG1655-BF、recT-MG1655-BR(表1)，以L.lactis A76和E.coli MG1655的基因组为模板PCR扩增或采用化学合成的方法，获得SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的基因片段。将PCR产物和载体pNZ8148分别用NcoⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接。连接产物转化大肠杆菌MC1061(商业化菌株)感受态，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pNZ8148/RecT-A76和pNZ8148/RecT-MG1655(重组质粒结构如图1所示)。然后从重组MC1061中提取重组质粒，电转化L.lactis NZ9000感受态细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148/RecT-A76)和L.lactis NZ9000(pNZ8148/RecT-MG1655)。

电转化条件为：1μL质粒中与40μL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min。电压2000V，电容25μF，电阻200Ω。电击完毕后，立即向电转杯中加入1mL含有20mM MgCl₂和2mM CaCl₂的GM17培养基(培养基配方：M17培养基+0.5％glucose)。然后置于30℃静置培养1.5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑取转化子验证。

表1引物

引物	序列
		recT-A76-BF	CATGCCATGGCAAATGAATTAGGAATCTTTAG
recT-A76-BR	CCAAGCTTTTAGAATCCCTCCAAAGGCTCTT
		recT-MG1655-BF	CATGCCATGGGGATGACTAAGCAACCACCAATCG
recT-MG1655-BR	CCAAGCTTTTATTCCTCTGAATTATCGATTACACT

实施例2过量表达RecT蛋白菌株的生长性能试验

对于考察菌株在过量表达RecT蛋白时的生长情况，将菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148/RecT-A76)、L.lactis NZ9000(pNZ8148/RecT-MG1655)和L.lactis NZ9000(pNZ8148)(对照)接种于加了10μg/mL氯霉素的GM17液体培养基(1mL)中进行活化，放在30℃培养箱中静置培养过夜。再以2％的接种量将种子液转接至新鲜的氯霉素(10μg/mL)GM17液体培养基中，30℃静置培养。每隔2小时取样，测定600nm波长下的OD值。培养至OD₆₀₀0.4时加入10ng/mL的nisin诱导表达RecT蛋白。以时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制生长曲线。

结果如图2所示。经生长性能试验分析，重组菌株的生物量和对照菌株没有太大差距，说明在L.lactis NZ9000中过量表达RecT蛋白对菌株的生长性能没有影响。

实施例3酸胁迫条件下耐受性试验

对于考察菌株对酸的耐受性分析试验，分别测定了重组菌株和对照菌株在pH 4.0条件下的存活率。

具体操作方式如下：将菌株诱导培养6h，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于等体积的新鲜的pH 4.0(乳酸调节)的GM17(含有10μg/mL氯霉素)中，胁迫不同时间。胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点种于GM17氯霉素平板上测定活菌数和存活率。

经耐受性实验分析，在pH 4.0的GM17中胁迫3h后，重组菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148/RecT-A76)和L.lactis NZ9000(pNZ8148/RecT-MG1655)的存活率分别为对照的10.5和1.4倍，说明重组菌株对酸胁迫的耐受性显著提高。

实施例4乙醇胁迫条件下耐受性实验

对于考察菌株对乙醇的耐受性分析实验，分别测定了重组菌株和对照菌株在20％(v/v)乙醇条件下的存活率。

具体操作方式如下：将菌株诱导培养6h，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于等体积的新鲜的加了20％(v/v)无水乙醇的GM17(含有10μg/mL氯霉素)中，胁迫不同时间。胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点种于GM17氯霉素平板上测定活菌数和存活率。

通过实施例3和实施例4结果分析，可知在L.lactis NZ9000中过量表达RecT蛋白后，菌株耐酸性能和耐乙醇性能都显著提高，在乙醇胁迫条件下，20％(v/v)乙醇胁迫6h后，重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/RecT-A76)和Lactococcus lactisNZ9000(pNZ8148/RecT-MG1655)的存活率分别为对照的3.7和2.1倍。说明通过在L.lactisNZ9000中过量表达RecT蛋白的方法可以提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性和乙醇胁迫抗性。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种抗酸胁迫元器件及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 245

<212> PRT

<213> Lactococcus lactis A76

<400> 1

Met Ala Asn Glu Leu Gly Ile Phe Ser Val Asp Asn Leu Asn Met Thr

1 5 10 15

Thr Ile Lys Gln Tyr Leu Asp Gly Gly Gly Lys Ala Ser Asp Glu Glu

20 25 30

Leu Val Leu Leu Ile Asn Leu Cys Lys Gln Asn Asn Met Asn Pro Phe

35 40 45

Met Lys Glu Val Tyr Phe Ile Lys Tyr Gly Asn Gln Pro Ala Gln Ile

50 55 60

Val Val Ser Arg Asp Phe Tyr Arg Lys Arg Ala Phe Gln Asn Pro Asn

65 70 75 80

Phe Val Gly Ile Glu Val Gly Val Ile Val Leu Asn Lys Asp Gly Val

85 90 95

Leu Glu His Asn Glu Gly Thr Phe Lys Thr His Glu Gln Glu Leu Val

100 105 110

Gly Ala Trp Ala Arg Val His Leu Lys Asn Thr Glu Ile Pro Val Tyr

115 120 125

Val Ala Val Ser Tyr Asp Glu Tyr Val Gln Met Lys Asp Gly His Pro

130 135 140

Asn Lys Met Trp Thr Asn Lys Pro Cys Thr Met Leu Gly Lys Val Ala

145 150 155 160

Glu Ser Gln Ala Leu Arg Met Ala Phe His Ala Glu Phe Ser Gly Thr

165 170 175

Tyr Gly Glu Glu Glu Tyr Pro Glu Pro Glu Lys Glu Pro Arg Glu Val

180 185 190

Asn Gly Val Lys Glu Pro Asp Arg Ala Gln Ile Glu Ser Phe Asp Lys

195 200 205

Glu Asp Tyr Ala Ala Arg Lys Ile Glu Glu Leu Lys Glu Lys Ala Gln

210 215 220

Pro Gln Lys Glu Val Val Glu Glu Thr Gly Glu Val Ile Asp Glu Glu

225 230 235 240

Pro Leu Glu Gly Phe

245

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> Escherichia coli MG1655

<400> 2

Met Thr Lys Gln Pro Pro Ile Ala Lys Ala Asp Leu Gln Lys Thr Gln

1 5 10 15

Gly Asn Arg Ala Pro Ala Ala Val Lys Asn Ser Asp Val Ile Ser Phe

20 25 30

Ile Asn Gln Pro Ser Met Lys Glu Gln Leu Ala Ala Ala Leu Pro Arg

35 40 45

His Met Thr Ala Glu Arg Met Ile Arg Ile Ala Thr Thr Glu Ile Arg

50 55 60

Lys Val Pro Ala Leu Gly Asn Cys Asp Thr Met Ser Phe Val Ser Ala

65 70 75 80

Ile Val Gln Cys Ser Gln Leu Gly Leu Glu Pro Gly Ser Ala Leu Gly

85 90 95

His Ala Tyr Leu Leu Pro Phe Gly Asn Lys Asn Glu Lys Ser Gly Lys

100 105 110

Lys Asn Val Gln Leu Ile Ile Gly Tyr Arg Gly Met Ile Asp Leu Ala

115 120 125

Arg Arg Ser Gly Gln Ile Ala Ser Leu Ser Ala Arg Val Val Arg Glu

130 135 140

Gly Asp Glu Phe Ser Phe Glu Phe Gly Leu Asp Glu Lys Leu Ile His

145 150 155 160

Arg Pro Gly Glu Asn Glu Asp Ala Pro Val Thr His Val Tyr Ala Val

165 170 175

Ala Arg Leu Lys Asp Gly Gly Thr Gln Phe Glu Val Met Thr Arg Lys

180 185 190

Gln Ile Glu Leu Val Arg Ser Leu Ser Lys Ala Gly Asn Asn Gly Pro

195 200 205

Trp Val Thr His Trp Glu Glu Met Ala Lys Lys Thr Ala Ile Arg Arg

210 215 220

Leu Phe Lys Tyr Leu Pro Val Ser Ile Glu Ile Gln Arg Ala Val Ser

225 230 235 240

Met Asp Glu Lys Glu Pro Leu Thr Ile Asp Pro Ala Asp Ser Ser Val

245 250 255

Leu Thr Gly Glu Tyr Ser Val Ile Asp Asn Ser Glu Glu

260 265

<210> 3

<211> 738

<212> DNA

<213> Lactococcus lactis A76

<400> 3

atggcaaatg aattaggaat ctttagtgtt gataatttaa atatgaccac aattaagcaa 60

tatttagatg gtggtggcaa agcaagtgat gaggaacttg ttttacttat taatctttgc 120

aaacaaaaca acatgaatcc atttatgaaa gaagtttatt tcatcaaata tggtaatcaa 180

ccagctcaaa tcgttgtatc tcgtgacttt tatcgaaaac gtgcatttca aaatcctaat 240

tttgtgggta ttgaagttgg agtgattgta cttaacaaag atggagttct tgaacacaac 300

gaaggaacat tcaaaactca tgaacaagaa ttagttggtg catgggctag agttcattta 360

aaaaacacag aaatcccagt atatgttgcg gtatcttatg atgaatacgt tcaaatgaaa 420

gatggacacc ctaataagat gtggactaat aaaccatgta caatgcttgg aaaagtagct 480

gaaagccaag cactgagaat ggcatttcat gctgagtttt ctggaactta cggagaagaa 540

gagtatcctg agccagaaaa agaacctcgc gaagtgaacg gagtcaaaga acctgaccgt 600

gctcaaatcg aatcatttga taaagaggat tacgcagcaa gaaaaattga agagttgaaa 660

gaaaaagctc aacctcaaaa agaagttgtt gaagaaactg gcgaagttat tgatgaagag 720

cctttggagg gattctaa 738

<210> 4

<211> 810

<212> DNA

<213> Escherichia coli MG1655

<400> 4

atgactaagc aaccaccaat cgcaaaagcc gatctgcaaa aaactcaggg aaaccgtgca 60

ccagcagcag ttaaaaatag cgacgtgatt agttttatta accagccatc aatgaaagag 120

caactggcag cagctcttcc acgccatatg acggctgaac gtatgatccg tatcgccacc 180

acagaaattc gtaaagttcc ggcgttagga aactgtgaca ctatgagttt tgtcagtgcg 240

atcgtacagt gttcacagct cggacttgag ccaggtagcg ccctcggtca tgcatattta 300

ctgccttttg gtaataaaaa cgaaaagagc ggtaaaaaga acgttcagct aatcattggc 360

tatcgcggca tgattgatct ggctcgccgt tctggtcaaa tcgccagcct gtcagcccgt 420

gttgtccgtg aaggtgacga gtttagcttc gaatttggcc ttgatgaaaa gttaatacac 480

cgcccgggag aaaacgaaga tgccccggtt acccacgtct atgctgtcgc aagactgaaa 540

gacggaggta ctcagtttga agttatgacg cgcaaacaga ttgagctggt gcgcagcctg 600

agtaaagctg gtaataacgg gccgtgggta actcactggg aagaaatggc aaagaaaacg 660

gctattcgtc gcctgttcaa atatttgccc gtatcaattg agatccagcg tgcagtatca 720

atggatgaaa aggaaccact gacaatcgat cctgcagatt cctctgtatt aaccggggaa 780

tacagtgtaa tcgataattc agaggaataa 810

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工设计，用于PCR

<400> 5

catgccatgg caaatgaatt aggaatcttt ag 32

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工设计，用于PCR

<400> 6

ccaagctttt agaatccctc caaaggctct t 31

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工设计，用于PCR

<400> 7

catgccatgg ggatgactaa gcaaccacca atcg 34

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工设计，用于PCR

<400> 8

ccaagctttt attcctctga attatcgatt acact 35

Claims

1.一种重组乳酸菌，其特征在于，过量表达DNA同源重组蛋白RecT；所述DNA同源重组蛋白RecT的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种重组乳酸菌，其特征在于，宿主为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000，表达载体为pNZ8148。

3.权利要求1或2所述重组乳酸菌在食品、饲料、精细化学品领域的应用。

4.一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是在乳酸菌中过量表达DNA同源重组蛋白RecT；所述DNA同源重组蛋白RecT的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2。

5.一种提高乳酸菌乙醇胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是在乳酸菌中过量表达DNA同源重组蛋白RecT；所述DNA同源重组蛋白RecT的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQID NO.2。