CN108949664A

CN108949664A - 一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用

Info

Publication number: CN108949664A
Application number: CN201810964772.5A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 陈坚; 堵国成; 杨谨华; 朱政明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-08-23
Filing date: 2018-08-23
Publication date: 2018-12-07
Anticipated expiration: 2038-08-23
Also published as: CN108949664B

Abstract

本发明公开了一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明以编码硫胺素转运蛋白ThiT的基因为目的基因，以乳酸菌为表达宿主，成功构建了一种可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的乳酸菌工程菌；此乳酸菌工程菌的酸胁迫抗性和氨基酸胁迫抗性都得到了显著提高，分别较野生菌株最高提高了12.2倍和8.4倍。

Description

一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。

但是，在乳酸菌的工业化发酵生产过程中，常常存在酸胁迫和氨基酸胁迫的问题。

酸胁迫是由乳酸菌代谢产物乳酸、乙酸等酸性物质造成的，随着菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累，这些积累的乳酸、乙酸等酸性物质通过被动扩散进入细胞质，由于胞内的pH通常较胞外的pH高0.5-1.0，进入胞内的乳酸、乙酸等迅速解离，导致胞内pH的快速降低，使得细胞面临严重的酸胁迫，严重影响了细胞的生理活性，大大降低了乳酸菌食品微生物制造的效率。

氨基酸胁迫乳酸菌代谢产物氨基酸造成的，例如，丝氨酸，在利用乳酸菌发酵生产丝氨酸的过程中，高浓度的丝氨酸抑制支链氨基酸的合成，弱化细胞壁的生成，也导致副产物如羟基丙酮酸和丙烯酸酯的积累，使得细胞面临严重的产酸抑制，大大限制了乳酸菌菌体的生长。

对于酸胁迫，为维持乳酸菌发酵生产的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在乳酸菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(氨水或NaOH)来控制发酵环境的pH值。

然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。

目前，提高乳酸菌的乳酸、乙酸等酸胁迫抗性的方法则主要有：(1)诱变育种，该方法具有简便、类型繁多等特点，但工作量大、效率低是其主要缺点；(2)生化工程策略，已有报道用过外源添加天冬氨酸以提高乳酸菌的酸胁迫耐受性，但该方法的使用造成了生产成本的增加；(3)代谢工程策略，目前利用代谢工程策略提高乳酸菌环境胁迫的方法主要包括构建新的代谢途径、拓展已有代谢途径和削弱已有代谢途径，但是，此方法存在成本高、成功率低的问题，

对于氨基酸酸胁迫，目前的增强菌株对丝氨酸等氨基酸胁迫抗性的方法主要有：(1)适应性进化，该方法操作简便，但工作量大、耗时较长；(2)及时分离产物，增强丝氨酸由胞内转运到胞外的途径，避免丝氨酸在胞内的积累，该操作目的直接，但方法单一。

因此，急需找到一种新的效果优异、成本低、成功率高、操作简单、工作量少、效率高的可提高乳酸菌酸胁迫以及氨基酸胁迫抗性的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用。本发明以编码硫胺素转运蛋白ThiT的基因为目的基因，以乳酸菌为表达宿主，成功构建了一种可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的乳酸菌工程菌；此乳酸菌工程菌的酸胁迫抗性和氨基酸胁迫抗性都得到了显著提高，分别较野生菌株最高提高了12.2倍和8.4倍。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为编码硫胺素转运蛋白ThiT的基因；所述表达宿主为乳酸菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌Lactococcus lactisNZ9000。

在本发明的一种实施方式中，所述硫胺素转运蛋白ThiT来源于乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000。

在本发明的一种实施方式中，编码所述硫胺素转运蛋白ThiT的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述硫胺素转运蛋白ThiT的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148。

本发明提供了一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，所述方法为在乳酸菌中过量表达硫胺素转运蛋白ThiT。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述硫胺素转运蛋白ThiT来源于乳酸乳球菌Lactococcus lactisNZ9000。

在本发明的一种实施方式中，所述编码硫胺素转运蛋白ThiT的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述过量表达为先通过编码硫胺素转运蛋白ThiT的基因与表达载体构建含有编码硫胺素转运蛋白ThiT的基因重组质粒，再将重组质粒导入乳酸菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148。

本发明提供了利用上述一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法制备得到的酸胁迫抗性提高的乳酸菌。

在本发明的一种实施方式中，所述酸胁迫抗性提高的乳酸菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为编码硫胺素转运蛋白ThiT的基因；所述表达宿主为乳酸菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148。

本发明提供了上述一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法在提高乳酸菌酸胁迫抗性方面的应用。

本发明提供了上述一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌或上述一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法在制备食品、药品、饲料以及化学品方面的应用。

有益效果：

(1)本发明首次发现在乳酸菌中过量表达ThiT蛋白可显著提高乳酸菌的酸胁迫抗性和氨基酸胁迫抗性；

(2)本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达ThiT蛋白，得到了酸胁迫抗性和氨基酸胁迫抗性都显著提高的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/ThiT)；

(3)利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148/ThiT)对酸胁迫和氨基酸胁迫的抗性都较野生型有了明显的提高，其对乳酸的抗性较野生型提高了2.4倍，对琥珀酸的抗性较野生型提高了12.2倍，对丝氨酸的抗性较野生型提高了8.4倍，对缬氨酸的抗性较野生型提高了1.37倍。

附图说明

图1：重组质粒pNZ8148-ThiT的结构图；

图2：重组菌株和对照菌株的生长曲线；

图3：pH 4.0(乳酸调节)条件下重组菌株与对照菌株的存活率对比；

图4：20.0g/L琥珀酸(pH 3.6)胁迫条件下重组菌株与对照菌株的存活率对比；

图5：100.0g/L L-丝氨酸胁迫条件下重组菌株与对照菌株的生长曲线；

图6：100.0g/L L-丝氨酸胁迫条件下重组菌株与对照菌株的比生长速率；

图7：250.0g/L L-丝氨酸胁迫条件下重组菌株与对照菌株的存活率对比；

图8：40.0g/L L-缬氨酸胁迫条件下重组菌株与对照菌株的生长曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000来源于荷兰NIZO研究所。

下述实施例中涉及的培养基如下：

氯霉素平板：蛋白胨(英国Oxoid公司)1％(m/v)、酵母粉(Oxoid)0.5％(m/v)、氯化钠1％(m/v)及2％(m/v)琼脂条，灭菌后添加终浓度10μg/mL氯霉素。

GM17液体培养基：在M17培养基(Oxoid)中补充5‰(m/v)的葡萄糖(Glucose)。

GM17氯霉素平板：在M17培养基(Oxoid)中补充5‰(m/v)的葡萄糖(Glucose)及2％(m/v)琼脂条，灭菌后添加终浓度10μg/mL氯霉素。

实施例1：重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/ThiT)的构建

具体步骤如下：

(1)从NCBI数据库的中得到如SEQ ID NO.1所示的thiT基因序列，根据的基因序列设计分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物RS01735-F，RS01735-R；

(2)以L.lactis NZ9000的基因组为模板，以RS01735-F，RS01735-R为引物通过PCR扩增获得SEQ ID NO.1所示的基因片段；

(3)将PCR产物和载体pNZ8148分别用NcoI和XbaI双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接；

(4)将连接产物转化大肠杆菌MC1061(商业化菌株)感受态，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pNZ8148/ThiT(结构如图1所示)；

(5)从重组E.coli MC1061中提取重组质粒，电转化感受态L.lactis NZ9000细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株L lactisNZ9000(pNZ8148/ThiT)。

其中，电转化条件为：1μL质粒中与40μ的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min；调节电压2000V，电容25μf，电阻200Ω进行电击；电击完毕后，立即向电转杯中加入含有20mM MgCl₂和2mM CaCl₂的GM17培养基(培养基配方：M17broth培养基+0.5％glucose)；然后置于30℃静置培养1.5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑取转化子验证。

实施例2：重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/ThiT)的生长性能试验

具体步骤如下：

(1)将菌株L lactisNZ9000(pNZ8148)(对照)和实施例1得到的菌株L lactisNZ9000(pNZ8148/ThiT)分别接种于加了10μg/mL氯霉素的GM17液体培养基中进行活化，放在30℃培养箱中静置培养过夜；

(2)分别以2％的接种量将上述得到的种子液转接至新鲜的氯霉素(10μg/mL)GM17液体培养基中，30℃静置培养；

(3)在培养过程中，每隔2小时取样，测定600nm波长下的OD值；

(4)培养至OD₆₀₀0.4时加入10ng/mL的nisin诱导表达硫胺素转运蛋白，以时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制生长曲线(绘制得到的生长曲线如2)。

结果如图2所示，经生长性能试验分析，重组菌株的生物量和对照菌株没有太大差距，说明在L lactisNZ9000中过量表达ThiT蛋白对菌株的生长性能没有影响。

实施例3：重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/ThiT)在乳酸胁迫条件下的耐受性试验

具体步骤如下：

将菌株L lactis NZ9000(pNZ8148)(对照)和实施例1得到的菌株L lactisNZ9000(pNZ8148/ThiT)分别诱导培养6h，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于等体积的新鲜的pH 4.0(乳酸调节)的GM17(含有氯霉素10μg/mL)中，胁迫不同时间；将胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点种于GM17氯霉素平板上测定活菌数和存活率(结果如图3所示)。

如图3，经耐受性实验分析，在pH 4.0的GM17中胁迫3h后，重组菌株L lactisNZ9000(pNZ8148-ThiT)的存活率为对照的2.4倍，说明重组菌株对酸胁迫的耐受性显著提高。

实施例4：重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/ThiT)在琥珀酸胁迫条件下的耐受性试验

具体步骤如下：

将菌株L lactis NZ9000(pNZ8148)(对照)和实施例1得到的菌株L lactisNZ9000(pNZ8148/ThiT)分别诱导培养6h，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于等体积的新鲜的20.0g/L琥珀酸的GM17(含有氯霉素10μg/mL)中，胁迫不同时间；胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点种于GM17氯霉素平板上测定活菌数和存活率(结果如图4所示)。

如图4，经耐受性实验分析，在20.0g/L琥珀酸的GM17中胁迫2h后，重组菌株Llactis NZ9000(pNZ8148-ThiT)的存活率为对照的12.2倍，说明重组菌株对琥珀酸胁迫的耐受性显著提高。

实施例5：重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/ThiT)在丝氨酸胁迫条件下的生长性能试验

具体步骤如下：

(1)将菌株L lactis NZ9000(pNZ8148)(对照)和实施例1得到的菌株L lactisNZ9000(pNZ8148/ThiT)分别接种于加了10μg/mL氯霉素的GM17液体培养基中进行活化，放在30℃培养箱中静置培养过夜；

(2)再以2％的接种量将上述得到的种子液转接至新鲜的氯霉素(10μg/mL)GM17液体培养基中，30℃静置培养；

(3)培养至OD₆₀₀0.4时加入10ng/mL的nisin诱导表达硫胺素转运蛋白，于30℃培养箱中静置培养至稳定前期；

(4)以2％的接种量将上述得到的稳定前期的菌液转接至新鲜的100.0g/L L-Serine GM17(含氯霉素10μg/mL)中，每隔2小时取样，测定600nm波长下的OD值，以时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制生长曲线(生长曲线如图5、6所示)。

如图5、6，所示经生长性能试验分析，重组菌株的生物量略高于对照菌株，在100.0g/L L-Serine胁迫下，对照菌株13h达到对数生长中期，16h到达稳定期，到达稳定期时在波长600nm下测得的OD_max值为1.03；重组菌株7h达到对数生长中期，10h到达稳定期，到达稳定期时在波长600nm下测得的OD_max值为1.21，为对照株的1.17倍，说明在L.lactisNZ9000中过量表达ThiT蛋白对菌株适应高浓度丝氨酸的环境有有益作用。

实施例6：重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/ThiT)在丝氨酸胁迫条件下的耐受性试验

具体步骤如下：

将菌株L lactis NZ9000(pNZ8148)(对照)和实施例1得到的菌株L lactisNZ9000(pNZ8148/ThiT)分别诱导培养6h，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于等体积的新鲜的加了250.0g/L的GM17(含有氯霉素10μg/mL)中，胁迫不同时间；胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点种于GM17氯霉素平板上测定活菌数和存活率(结果如图7所示)。

如图7所示，如图7所示，经耐受性实验分析，在含250.0g/L丝氨酸的GM17中胁迫12h后，重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148-ThiT)的存活率为对照的8.4倍，说明重组菌株对氨基酸胁迫的耐受性显著提高。

实施例7：重组菌株L lactis NZ9000(pNZ8148/ThiT)在缬氨酸胁迫条件下的耐受性试验

具体步骤如下：

(2)以2％的接种量将上述得到的种子液转接至新鲜的氯霉素(10μg/mL)GM17液体培养基中，30℃静置培养；

(4)以2％的接种量将上述得到的稳定前期的菌液转接至新鲜的100.0g/L L-Valine GM17(含氯霉素10μg/mL)中，每隔2小时取样，测定600nm波长下的OD值，以时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制生长曲线(绘制得到的生长曲线如8)。

结果如图8所示，经生长性能试验分析，重组菌株的生物量略高于对照菌株，在40.0g/L L-Valine胁迫下，对照菌株13h达到对数生长中期，16h到达稳定期，到达稳定期时在波长600nm下测得的OD_max值为1.03，重组菌株7h达到对数生长中期，10h到达稳定期，到达稳定期时在波长600nm下测得的OD_max值为1.21，为对照株的1.17倍，说明在L.lactisNZ9000中过量表达ThiT蛋白对菌株适应高浓度缬氨酸的环境有有益作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtctaatt ctaagttcaa tgtccgttta ttaacggaaa ttgccttcat ggcggcactc 60

gccttcatca tcagcctcat tccaaatact gtttatggtt ggattatcgt tgaaatcgcc 120

tgtatcccta tccttcttct cagcttacga cgaggtttaa ccgctggtct cgttggagga 180

ttaatctggg gaattctttc aatgattact ggacatgctt atatcttaag cctatcccaa 240

gctttccttg aatatcttgt ggctcctgtt tcactcggaa tagctggcct tttccgccaa 300

aaaacagccc ctctaaaact agcacctgta cttttgggaa cttttgttgc tgttcttctt 360

aaatactttt tccatttcat tgccggaatt attttctgga gccaatatgc ttggaaaggt 420

tggggcgctg ttgcttattc tcttgctgtt aatggaatca gcggtatttt gacggccatt 480

gctgcctttg ttatcttaat aatttttgtc aaaaaattcc ctaaactttt tatccatagt 540

aattactaa 549

<210> 2

<211> 182

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Asn Ser Lys Phe Asn Val Arg Leu Leu Thr Glu Ile Ala Phe

1 5 10 15

Met Ala Ala Leu Ala Phe Ile Ile Ser Leu Ile Pro Asn Thr Val Tyr

20 25 30

Gly Trp Ile Ile Val Glu Ile Ala Cys Ile Pro Ile Leu Leu Leu Ser

35 40 45

Leu Arg Arg Gly Leu Thr Ala Gly Leu Val Gly Gly Leu Ile Trp Gly

50 55 60

Ile Leu Ser Met Ile Thr Gly His Ala Tyr Ile Leu Ser Leu Ser Gln

65 70 75 80

Ala Phe Leu Glu Tyr Leu Val Ala Pro Val Ser Leu Gly Ile Ala Gly

85 90 95

Leu Phe Arg Gln Lys Thr Ala Pro Leu Lys Leu Ala Pro Val Leu Leu

100 105 110

Gly Thr Phe Val Ala Val Leu Leu Lys Tyr Phe Phe His Phe Ile Ala

115 120 125

Gly Ile Ile Phe Trp Ser Gln Tyr Ala Trp Lys Gly Trp Gly Ala Val

130 135 140

Ala Tyr Ser Leu Ala Val Asn Gly Ile Ser Gly Ile Leu Thr Ala Ile

145 150 155 160

Ala Ala Phe Val Ile Leu Ile Ile Phe Val Lys Lys Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Phe Ile His Ser Asn Tyr

180

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catgccatgg ggatgtctaa ttctaagttc aatgtccg 38

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctctagatt agtaattact atggataaaa agtttaggg 39

Claims

1.一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为编码硫胺素转运蛋白ThiT的基因；所述表达宿主为乳酸菌。

2.如权利要求1所述的一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，其特征在于，所述硫胺素转运蛋白ThiT来源于乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000。

3.如权利要求1或2所述的一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，其特征在于，编码所述硫胺素转运蛋白ThiT的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求1-3任一所述的一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，其特征在于，所述表达载体为pNZ8148。

5.一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法为在乳酸菌中过量表达硫胺素转运蛋白ThiT。

6.如权利要求5所述的一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述硫胺素转运蛋白ThiT来源于乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000。

7.如权利要求5或6所述的一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述过量表达为先通过编码硫胺素转运蛋白ThiT的基因与表达载体构建含有编码硫胺素转运蛋白ThiT的基因重组质粒，再将重组质粒导入乳酸菌中。

8.利用权利要求5-7任一所述的一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法制备得到的酸胁迫抗性提高的乳酸菌。

9.权利要求5-7任一所述的一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法在提高乳酸菌酸胁迫抗性方面的应用。

10.权利要求1-4任一所述的一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌或权利要求5-7任一所述的一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法在制备食品、药品、饲料以及化学品方面的应用。