CN107236694A

CN107236694A - 一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法

Info

Publication number: CN107236694A
Application number: CN201710431816.3A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 张彦位; 陈坚; 堵国成; 朱凯
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2017-06-09
Publication date: 2017-10-10
Anticipated expiration: 2037-06-09
Also published as: CN107236694B

Abstract

本发明公开了一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过在乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000中过量表达来源于乳酸乳球菌L.lactis NZ9000的DLDH蛋白，得到了一株酸胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸乳球菌L.lactis NZ9000(pNZ8148‑dldh)。在pH 5.5条件下，重组菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148‑dldh)的生物量较对照提高约9.53％；pH 4.0条件下胁迫3.5h，重组菌株的存活率为对照的7.3倍。本发明还提供了一种提高酸胁迫抗性的方法，该方法具有良好的工业应用价值。

Description

一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法

技术领域

本发明涉及一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

乳酸菌由于其独特的生理特性被广泛的应用于轻工业、食品、医药及饲料工业等许多行业中。酸胁迫作为乳酸菌生产应用中面临的最广泛存在的一种环境胁迫，严重影响了乳酸菌生理功能的发挥。因此提高乳酸菌的酸胁迫耐受性对于其在发酵生产中的应用有着重要的意义。

二氢硫辛酰胺脱氢酶是一种黄素蛋白，其作用是将二氢硫辛酰胺脱氢转化为氧化型硫辛酰胺，属于氧化还原酶类，提供一些硫族基团，供NAD⁺和NADP⁺接受，从而在生物的能量代谢中起重要作用。

国内外对二氢硫辛酰胺脱氢酶进行了大量的研究，其中研究最多的原核生物为大肠杆菌，而真核生物主要是酵母、猪以及人类。随着研究的深入，研究者不断发现二氢硫辛酰胺脱氢酶在病原体的致病性以及耐药性方面起着重要的作用，同时其还具有较强的免疫原性。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性的方法。本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达DLDH蛋白，实现了乳酸乳球菌酸胁迫抗性的提高。

本发明解决的第一个问题是提供了一株酸胁迫抗性提高的重组乳酸乳球菌，这株重组菌过量表达二氢硫辛酰胺脱氢酶DLDH。

所述DLDH的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

所述DLDH的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中，是SEQ ID NO.2所示的序列。

所述DLDH的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中，来源于乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000。

所述重组菌，在本发明的一种实施方式中，以乳酸乳球菌Lactococcus lactisNZ9000为宿主。

本发明解决的第二个问题是提供了一种所述重组菌的构建方法。是将编码SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的dldh基因连接到表达质粒上获得重组质粒，再分别转化到宿主菌中获得重组菌。

所述表达质粒为pNZ8148。

所述宿主菌，在本发明的一种实施方式中是Lactococcus lactis NZ9000。

所述构建方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148-dldh，再将重组质粒转化到宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中，得到重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148-dldh)。

本发明的第三个目的是提供一种提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性的方法，是在乳酸乳球菌中过量表达二氢硫辛酰胺脱氢酶DLDH。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，DLDH的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148-dldh，再将重组质粒转化到宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中，得到重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148-dldh)，诱导表达DLDH。

本发明的有益效果：通过在乳酸乳球菌中过量表达DLDH蛋白，得到了一株酸胁迫抗性提高的重组乳酸菌Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148-dldh)。在酸胁迫条件下，pH4.0胁迫3.5h后，重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148-dldh)的存活率为对照的7.3倍。

附图说明

图1：重组质粒pNZ8148-dldh的结构图；

图2：重组菌株和对照菌株的生长曲线；

图3：pH 4.0条件下重组菌株与对照菌株的存活率对比。

具体实施方式

实施例1重组菌株的构建

从NCBI数据库Lactococcus lactis NZ9000的基因组中得到如SEQ ID NO.2所示的dldh的基因序列，并将其克隆到乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148-dldh，再将其电转入宿主菌L.lactis NZ9000中，得到重组菌株Lactococcus lactisNZ9000(pNZ8148-dldh)。

具体如下：

根据dldh的基因序列设计分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物dldh-F、dldh-R(表1)，以Lactococcus lactis NZ9000的基因组为模板，PCR扩增或采用化学合成的方法，获得SEQ ID NO.2所示的基因片段。将PCR产物和载体pNZ8148分别用xbaI和sacI双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接。连接产物转化大肠杆菌MC1061(商业化菌株)感受态，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pNZ8148-dldh(重组质粒结构如图1所示)。然后从重组MC1061中提取重组质粒，电转化L.lactis NZ9000感受态细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148-dldh)。

电转化条件为：1μL质粒中与40μL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min。电压2000V，电容25μF，电阻200Ω。电击完毕后，立即向电转杯中加入1mL含有20mM MgCl₂和2mM CaCl₂的GM17培养基(培养基配方：M17培养基+0.5％glucose)。然后置于30℃静置培养1.5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑取转化子验证。

表1引物

引物	序列
		dldh-F	ATATATCTAGAATGGTTGTTGGTGCACAAGCAAC
dldh-R	ATATAGAGCTCTTAAACGTGAATTGGCAAGCCATC

实施例2 DLDH蛋白的诱导表达与检测

诱导重组菌Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148-dldh)表达DLDH蛋白，并用SDS-PAGE蛋白电泳检测重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148-dldh)中DLDH蛋白的表达情况，发现与DLDH蛋白大小相似的条带的量显著增加。

具体过程如下：

将菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148)(即含有pNZ8148空质粒的Lactococcus lactisNZ9000菌株)和Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148-dldh)接种于含有10μg/mL氯霉素的GM17(5mL)培养基中，30℃静置培养过夜，以4％的接种量转接至50mL含有10μg/mL氯霉素的GM17培养基中，待生长至OD₆₀₀0.4时加入10ng/mL的nisin(一种乳酸链球菌素)诱导培养8h，收集诱导后的细胞，经50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)离心洗涤两次后重悬于相同的缓冲液中。将菌悬液置于冰上超声破碎15min，离心收集上清液，进行SDS-PAGE分析。

经SDS-PAGE分析，重组菌Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148-dldh)成功地表达了DLDH蛋白。SDS-PAGE中，在分子量约为49.87kDa处的蛋白质条带显著变厚重，与目标蛋白DLDH的分子量基本一致，说明成功地在Lactococcus lactis NZ9000中表达了DLDH蛋白。

实施例3过量表达DLDH蛋白菌株的生长性能试验

对于考察菌株在过量表达DLDH蛋白时的生长情况，将菌株Lactococcus lactisNZ9000(pNZ8148-dldh)和Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148)(对照)接种于加了10μg/mL氯霉素的GM17液体培养基(1mL)中进行活化，于30℃培养箱中静置过夜培养。再以2％的接种量将种子液转接至新鲜的(含10μg/mL氯霉素，pH 5.5，乳酸调节)的GM17液体培养基中，30℃静置培养。每隔2h取样，测定600nm波长下的OD值。培养至OD₆₀₀0.4时加入10ng/mL的乳酸链球菌素(nisin)诱导表达DLDH蛋白。以时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制生长曲线。

经生长性能试验分析，重组菌株的生物量相对对照菌株有所提高，约9.53％，说明在Lactococcus lactis NZ9000中过量表达DLDH蛋白可提高菌株的酸胁迫抗性。

实施例4酸胁迫条件下耐受性试验

对于考察菌株对酸的耐受性分析试验，分别测定了重组菌株和对照菌株在pH 4.0条件下的存活率。

具体操作方式如下：将菌株诱导培养6h，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于等体积的新鲜的pH 4.0(乳酸调节)的GM17(含有10μg/mL氯霉素)中，胁迫不同时间。胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，梯度稀释，选合适的梯度点种于GM17氯霉素平板上测定活菌数并计算存活率。

经耐受性实验分析，在pH 4.0的GM17中胁迫3.5h后，重组菌株Lactococcuslactis NZ9000(pNZ8148-dldh)的存活率为对照的7.3倍，说明重组菌株对酸胁迫的耐受性显著提高。

通过实施例3和实施例4结果分析，可知在Lactococcus lactis NZ9000中过量表达DLDH蛋白后，菌株耐酸性能显著提高。说明通过Lactococcus lactis NZ9000中过量表达DLDH蛋白的方法可以提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 472

<212> PRT

<213> Lactococcus lactis NZ9000

<400> 1

Met Val Val Gly Ala Gln Ala Thr Glu Val Asp Leu Val Val Ile Gly

1 5 10 15

Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Val Ala Ala Ile Arg Ala Ala Glu Leu Gly

20 25 30

Lys Lys Val Thr Ile Ile Glu Lys Asp Asn Val Gly Gly Val Cys Leu

35 40 45

Asn Ile Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Ile Asn Ile Gly His His

50 55 60

Tyr Gln Glu Ser Leu Glu Glu Glu Lys Gly Glu Asn Pro Phe Gly Leu

65 70 75 80

Ser Val Gly Asn Val Lys Leu Asn Trp Glu Ser Ala Gln Lys Trp Lys

85 90 95

Gln Asp Lys Val Val Asn Gln Leu Thr Gly Gly Val Lys Met Leu Leu

100 105 110

Lys Lys His Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Thr Ala Glu Phe Ile Asp

115 120 125

Asn Asn Thr Ile Asn Val Glu Gln Glu Asp Gly Phe Gln Leu Leu Gln

130 135 140

Phe Asn Asp Val Ile Ile Ser Thr Gly Ser Arg Pro Ile Glu Ile Pro

145 150 155 160

Ser Phe Pro Phe Gly Gly Arg Ile Ile Asp Ser Thr Gly Ala Leu Ser

165 170 175

Leu Pro Glu Val Pro Lys His Leu Ile Ile Val Gly Gly Gly Val Ile

180 185 190

Gly Ser Glu Leu Gly Gly Ala Tyr Arg Met Leu Gly Ser Lys Ile Thr

195 200 205

Ile Val Glu Gly Leu Asp His Ile Leu Asn Gly Phe Asp Lys Glu Met

210 215 220

Ser Asp Ile Ile Ala Asn Arg Val Lys Ser Ala Gly Ser Glu Ile Phe

225 230 235 240

Thr Ser Ala Met Ala Lys Ser Ala Thr Gln Thr Asp Lys Asp Val Thr

245 250 255

Leu Thr Phe Glu Val Asp Gly Lys Glu Gln Thr Val Thr Gly Asp Tyr

260 265 270

Leu Leu Val Ser Val Gly Arg Arg Pro Asn Thr Asp Leu Ile Gly Leu

275 280 285

Asn Asn Thr Asp Val Lys Leu Thr Asp Arg Gly Leu Ile Glu Val Asp

290 295 300

Asp Ser Tyr Ala Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Val

305 310 315 320

Val Pro Gly Pro Met Leu Ala His Lys Ala Ser Phe Gln Ala Lys Val

325 330 335

Ala Ala Ala Ala Ile Ala Gly Ala Glu Asp Asp Val Asp Leu His Val

340 345 350

Ala Leu Pro Ala Val Ala Tyr Thr Thr Thr Glu Leu Ala Thr Val Gly

355 360 365

Glu Thr Pro Glu Ser Val Lys Asp Arg Lys Asp Val Lys Ile Ser Lys

370 375 380

Phe Pro Phe Ala Ala Asn Gly Arg Ala Ile Ser Met Asn Asn Thr Thr

385 390 395 400

Gly Phe Leu Arg Leu Ile Thr Glu Thr Lys Glu Gly Ala Leu Ile Gly

405 410 415

Ala Gln Ile Val Gly Pro Gly Ala Ser Asp Leu Ile Ser Gly Leu Ser

420 425 430

Leu Ala Ile Glu Asn Gly Leu Thr Ser Lys Asp Ile Ser Leu Thr Ile

435 440 445

Gln Pro His Pro Thr Leu Gly Glu Ala Ile Met Asp Thr Ala Glu Leu

450 455 460

Ala Asp Gly Leu Pro Ile His Val

465 470

<210> 2

<211> 1419

<212> DNA

<213> Lactococcus lactis NZ9000

<400> 2

atggttgttg gtgcacaagc aacagaagtt gatttggttg ttattggttc aggccctggc 60

ggttatgttg cggccatccg tgcggctgaa cttggtaaaa aagttacgat tattgaaaaa 120

gataatgtcg gtggggtttg tttaaatatt ggatgtatcc catcaaaagc attgattaat 180

attggtcatc attatcaaga atctttggaa gaagaaaagg gtgaaaatcc ttttggactt 240

tctgtcggaa atgttaaatt aaattgggaa tctgcccaaa aatggaaaca agataaagtt 300

gtcaaccagt tgacaggtgg cgttaaaatg ctacttaaaa aacacaaagt tgatgtaatt 360

caaggaacag ctgagtttat tgataacaat acaatcaatg ttgaacaaga agatggtttc 420

caacttttgc agttcaacga tgtaattatc tcaactggtt cacgtcctat tgaaatccca 480

tctttcccat ttggtggtcg tattattgac tcaacaggtg ctttgtcact tccagaagtg 540

cctaaacatt tgattattgt tgggggtggc gttattggtt ctgagcttgg tggagcttac 600

cgcatgctcg gttctaagat tacaattgtt gaaggcttgg accacatttt aaacggtttt 660

gataaagaaa tgtctgatat cattgcgaat cgtgtgaaat ctgctggttc tgaaatcttt 720

acatcggcga tggctaaatc agctactcaa accgataaag atgtgacttt aacttttgaa 780

gttgacggaa aagaacaaac agtaactggt gattacttac tcgtttctgt tggacgtcgt 840

ccaaatactg atttgattgg cttgaacaat actgatgtca aattgactga ccgtggtttg 900

attgaagttg atgattctta tgcaacgaat gttcctcata tttacgcgat tggtgatgtg 960

gttcctggac caatgctcgc acacaaagct tctttccaag ctaaagttgc tgcagcggcc 1020

attgctggag ctgaagacga cgtggacttg cacgttgctt tgccagccgt tgcttataca 1080

acaactgaac tagcaacagt tggagaaacg cctgaatcag ttaaagaccg taaagatgtc 1140

aagatctcta agttcccatt tgctgcaaat ggtcgtgcca tttcaatgaa taataccact 1200

ggtttcttac gtttgattac cgaaactaaa gaaggtgcct taattggtgc tcaaatcgtt 1260

ggtcctggcg catctgacct gatctctggt ttatcactag cgattgaaaa tggtttgact 1320

tctaaagata tctcattgac tatccaacct cacccaacac ttggtgaagc gattatggat 1380

acagctgaat tggctgatgg cttgccaatt cacgtttaa 1419

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工设计用于PCR

<400> 3

atatatctag aatggttgtt ggtgcacaag caac 34

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工设计用作PCR

<400> 4

atatagagct cttaaacgtg aattggcaag ccatc 35

Claims

1.一种重组乳酸菌，其特征在于，所述乳酸菌中过量表达糖酵解代谢途径中的二氢硫辛酰胺脱氢酶DLDH。

2.根据权利要求1所述的重组乳酸菌，其特征在于，所述二氢硫辛酰胺脱氢酶DLDH的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

3.根据权利要求1所述的重组乳酸菌，其特征在于，编码所述二氢硫辛酰胺脱氢酶DLDH的核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列。

4.根据权利要求1所述的重组乳酸菌，其特征在于，所述重组乳酸菌以乳酸乳球菌为宿主。

5.一种权利要求1-4任一所述重组乳酸菌的构建方法，其特征在于，将编码SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的dldH基因连接到表达质粒上获得重组质粒，再转化到宿主菌中获得重组菌。

6.权利要求1-4任一所述重组乳酸菌在食品、饲料、精细化学品领域的应用。

7.一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，是在乳酸菌中过量表达二氢硫辛酰胺脱氢酶DLDH。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述DLDH的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

10.根据权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：将SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列克隆到表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148-dldh，再将重组质粒转化到宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中，得到重组菌株Lactococcus lactis NZ9000(pNZ8148-dldh)，诱导表达DLDH。