CN104774863B - 一种提高乳酸乳球菌微囊藻毒素胁迫抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高乳酸乳球菌微囊藻毒素胁迫抗性的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过在乳酸乳球菌L.lactis NZ9000中过量表达了来源于干酪乳杆菌L.casei ATCC334的GroEL基因，得到了一株MCs胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸乳球菌L.lactis NZ‑GroEL。MCs胁迫条件下，培养22h后重组菌株相对于对照菌株的生物量提高了15.2％。在MCs浓度分别为50μg/mL和100μg/mL的GM17中胁迫12h后，重组菌对MCs的耐受性分别比对照菌提高了10.6％和20.1％。本发明提供的方法具有良好的工业应用价值。

Description

一种提高乳酸乳球菌微囊藻毒素胁迫抗性的方法

技术领域

本发明涉及一种提高乳酸乳球菌微囊藻毒素胁迫抗性的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

食品安全是关系到人类健康和国计民生的重大问题。在众多威胁食品安全的污染源中，微囊藻毒素(MCs)由于毒性强、在食物链中波及范围广，日益成为危害人类健康的重要杀手。MCs是一类单环七肽物质，其化学性质稳定，自然降解缓慢。由于微生物具有使用成本低、运行周期短等特点，在生物防治MCs中具有较大的应用潜力和研究价值。其中，益生菌对MCs的干预作用因其公认的安全性(GRAS)成为真正能够实现在清除MCs过程中与水源、食品“零距离”接触的生物防治剂。

然而，益生菌对MCs的干预作用的机理并不明确。一方面，益生菌自身的性能决定了其对MCs的干预能力以及特有的干预作用机制，这取决于其基因型，以及由此表现出的对MCs的代谢转化性能，或是对MCs进行结合、吸附的结构或形态特征。另一方面，微生物的内在、外在环境又影响并改变着它对MCs的干预过程和干预效果，如所处胃肠道的不同生理环境、MCs的胁迫条件等。这些改变可能涉及到益生菌的转录组、蛋白组、代谢组的变化及整个代谢网络的调整，从而实现了对MCs的转化。因此，益生菌清除MCs技术的建立不仅建立在对益生菌性能及其去毒机制的解析之上，也建立在对益生菌干预过程的理解之上，这样才能最终实现益生菌对MCs的高效干预与控制。

在利用乳杆菌对MCs进行清除的研究中发现，由于菌株受到MCs的胁迫作用，导致菌株的活性受到影响，进而影响其清除效果。但是MCs对菌株的胁迫机理也不明确。发明人研究了MCs胁迫条件下Lactobacillus casei ATCC334的蛋白质组学，研究发现，其分子伴侣GroEL蛋白表达受到MCs胁迫的影响。

发明内容

本发明提供了一种提高乳酸乳球菌抵御MCs胁迫的方法，从而提高乳酸乳球菌对于MCs胁迫条件的适应能力。

本发明的第一个目的是提供一种提高乳酸菌微囊藻毒素胁迫抗性的方法，所述方法是在乳酸菌中过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的分子伴侣蛋白GroEL。

所述乳酸菌，在本发明的一种实施方式中，为乳酸乳球菌或者干酪乳杆菌。

所述分子伴侣蛋白，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述分子伴侣蛋白，在本发明的一种实施方式中，来源于干酪乳杆菌L.caseiATCC334。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，是以L.lactis NZ9000为宿主，以表达质粒pNZ8148、pNZ8048、pNZ5319中的一种为载体，过表达分子伴侣蛋白。

本发明的第二个目的是提供一种微囊藻毒素胁迫抗性提高的乳酸菌，所述乳酸菌过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的分子伴侣蛋白。

所述乳酸菌，在本发明的一种实施方式中，为乳酸乳球菌或者干酪乳杆菌。

所述乳酸菌，在本发明的一种实施方式中，是以乳酸乳球菌L.lactis NZ9000为宿主，以表达质粒pNZ8148为载体，过表达分子伴侣蛋白的重组乳酸菌。

一种构建所述乳酸菌的方法，在本发明的一种实施方式中，所述方法包括：(1)使用引物mutRF、mutRR对表达质粒pNZ8148上的NcoI位点进行定点突变，得到pNZ8148/NcoI；(2)将序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到pNZ8148/NcoI上，得到重组质粒pNZ8148/NcoI/GroEL；(3)将pNZ8148/NcoI/GroEL转化到L.lactis NZ9000中，即得到重组菌株L.lactis NZ-GroEL。

所述乳酸菌在清除微囊藻毒素方面、制备生物防治剂方面的应用也属于本发明要求保护的范围。

本发明的有益效果：本发明通过在乳酸乳球菌L.lactis NZ9000中过量表达GroEL蛋白，得到了一株MCs胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸乳球菌L.lactis NZ-GroEL。生长性能试验表明，MCs胁迫条件下培养22h后，L.lactis NZ-GroEL菌株相比对照生物量提高了约15.2％；在MCs浓度分别为50μg/mL和100μg/mL的GM17中胁迫12h后的重组菌对MCs的耐受性分别比对照菌提高了10.6％和20.1％。

附图说明

图1：重组质粒pNZ8148/NcoI/GroEL的构建流程图；

图2：重组菌株L.lactis NZ-GroEL蛋白表达SDS-PAGE电泳图；其中，M代表marker，泳道1为对照菌株NZ-Vector，泳道2为重组菌NZ-GroEL；

图3：MCs胁迫条件下，重组菌株与对照菌株生长性能对比图，其中实心三角形代表NZ-Veotor，空心三角形代表NZ-GroEL。

图4：MCs胁迫条件下，重组菌株与对照菌株存活率对比图；其中A为50μg/mL MCs胁迫，B为100μg/mL MCs胁迫，其中实心三角形代表NZ-Veotor，空心三角形代表NZ-GroEL。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做更详细的说明。

实施例1重组菌株的构建

重组菌Lactococcus lactis NZ-GroEL包括：

(1)为避免移码突变，对表达质粒pNZ8148上的NcoI位点进行定点突变，使用序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的突变引物(见表1的mutRF、mutRR)，将ATGG突变为ATCG，得到表达质粒命名为pNZ8148/NcoI；

(2)以L.caseiATCC334的基因组为模板，根据GroEL的序列(氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)设计序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6的引物(见表1的G-RF、G-RR)，PCR扩增获得目的基因片段。将PCR产物和载体pNZ8148/NcoI分别用Spe I和Sac I双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接。连接产物转化大肠杆菌MC1061感受态，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pNZ8148/NcoI/GroEL。

(3)然后从重组MC1061中提取重组质粒，电转化L.lactis NZ9000感受态细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株L.lactis NZ-GroEL。质粒构建流程图见图1。

其中电转化条件为：1μL质粒中与40μL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min。电压2000V，电容25μF，电阻200Ω。电击完毕后，立即向电转杯中加入1mLGM17培养基(含20mM MgCl₂，2mM CaCl₂)。然后置于30℃静置培养1.5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑取转化子验证。

表1引物

名称	序列(5’-3’)
		G-RF	CGGACTAGTATGGCAAAAGAAATTAAATTCTCTGAAGACGC
G-RR	CGAGCTCTTACATCATACCGCCCATGCCTGCT
		mutRF	ATCGGTACTGCAGGCATGCG
mutRR	GGTGAGTGCCTCCTTATAATTTATTTTG

实施例2重组菌株的诱导表达

用SDS-PAGE蛋白电泳检测重组菌株L.lactis NZ-GroEL中GroEL蛋白的表达情况，以pNZ8148/NcoI电转入L.lactis NZ9000中得到的重组菌株L.lactis NZ-Vector为对照。

将菌株L.lactis NZ-Vector和L.lactis NZ-GroEL接种于含有10μg/mL氯霉素的GM17(5mL)培养基中，30℃静置培养过夜，以4％的接种量转接至50mL含有10μg/mL氯霉素的GM17培养基中，待生长至OD₆₀₀0.4时加入10ng/mL的nisin诱导培养8h，收集诱导后的细胞，经50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)离心洗涤两次后重悬于相同的缓冲液中。将菌悬液置于冰上超声破碎15min，离心收集上清液，进行SDS-PAGE分析。

经SDS-PAGE分析，重组菌L.lactis NZ-GroEL成功地表达了GroEL蛋白，结果见图2。如图2所示，在分子量约为57kDa处的蛋白质条带明显增多，与目标蛋白GroEL的分子量基本一致，说明利用NICE系统成功地在L.lactisNZ9000中表达了GroEL蛋白。

实施例3酸胁迫下的生长性能比较

本发明考察了菌株在胁迫条件下的生长情况。

将菌株L.lactis NZ-Vector和L.lactis NZ-GroEL接种于含有10μg/mL氯霉素的GM17(5mL)培养基中，30℃静置培养过夜，以4％的接种量转接至50mL含有10μg/mL氯霉素的GM17培养基中，待生长至OD₆₀₀0.4时加入10ng/mL的nisin，诱导培养至OD 2.0。将诱导后的培养液以4％的接种量转接至新鲜的GM17(含10μg/mL氯霉素，10ng/mL nisin，MCs浓度为1μg/mL)培养基中。分别测定L.lactis NZ-Vector和L.lactis NZ-GroEL在胁迫条件下的生长性能。结果如图3所示。

由图3所示生长曲线可知，培养22h后重组菌生物量明显高于对照，L.lactis NZ-GroEL菌株相对于L.lactis NZ-Vector生物量提高了约15.2％，说明在L.lactis NZ9000中过表达了GroEL蛋白后，菌株的MCs耐受性显著提高。

实施例4MCs胁迫耐受性能比较

本发明考察了菌株对MCs的耐受性，分别测定了重组菌株和对照菌株在MCs浓度分别为50μg/mL和100μg/mL条件下的存活率。

具体操作方式如下：将菌株诱导培养至OD 2.0，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于等体积的MCs浓度分别为50μg/mL和100μg/mL的GM17中，胁迫不同时间。胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点种于GM17平板上测定存活率。

耐受性实验结果如图4所示。结果表明，在MCs浓度分别为50μg/mL和100μg/mL的GM17中胁迫，发现细胞仍然进一步生长，推测MCs对L.lactis NZ9000虽有一定的抑制作用，却并无致死作用。在MCs浓度为50μg/mL的培养基中，胁迫6h时，重组菌的耐受性提高最大，达到21％，胁迫12h后重组菌的耐受性也能提高10.6％。在MCs浓度为100μg/mL的培养基中，胁迫10-12h后，重组菌对MCs的耐受性可比对照菌提高20.1％。

结论：经MCs胁迫下的生长性能试验和耐受性实验分析，在L.lactis NZ9000中表达了GroEL蛋白后，菌株对MCs的耐受性显著提高。说明通过在L.lactis NZ9000中表达GroEL蛋白的方法可以提高乳酸乳球菌MCs胁迫抗性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种提高乳酸菌微囊藻毒素胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是在乳酸乳球菌中过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的分子伴侣蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子伴侣蛋白的核苷酸序列是SEQ IDNO.2所示的序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子伴侣来源于干酪乳杆菌L. caseiATCC334。

4.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，所述方法是以乳酸乳球菌Lactococcuslactis NZ9000为宿主，以表达质粒pNZ8148为出发载体，过表达分子伴侣蛋白。

5.一种微囊藻毒素胁迫抗性提高的乳酸菌，其特征在于，所述乳酸菌过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的分子伴侣蛋白；所述乳酸菌为乳酸乳球菌。