CN104593311B - 一种酸胁迫抗性提高的重组乳酸菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种酸胁迫抗性提高的重组乳酸菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酸胁迫抗性提高的重组乳酸菌及其构建方法与应用，属于生物工程技术领域。本发明通过在乳酸乳球菌L.lactis NZ9000中过量表达了来源于干酪乳杆菌L.casei Zhang的argH基因，得到了一株酸胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸乳球菌L.lactis NZ‑argH。酸胁迫条件下，重组菌株相对于对照菌株的生物量提高了24％，pH 4.1条件下4h存活率为对照的1.98倍。本发明还提供了一种提高酸胁迫抗性的方法，该方法具有良好的工业应用价值。

Description

一种酸胁迫抗性提高的重组乳酸菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种酸胁迫抗性提高的重组乳酸菌及其构建方法与应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
乳酸菌作为一类重要的工业微生物，菌体及其代谢产物广泛应用于食品、医药、饲料、精细化学品等工业领域中。在工业生产中以及作为益生菌在人体胃肠道系统中都不可避免的面临着来自外界环境的多种环境胁迫，其中酸胁迫是最重要的胁迫之一，严重限制着乳酸菌生长性能和发酵力。
因此，提供一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法尤为重要。
本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达ArgH蛋白，实现了乳酸乳球菌对于酸胁迫抗性能力的提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高乳酸乳球菌抵御酸胁迫的方法，从而提高乳酸乳球菌对于酸胁迫条件的适应能力。
本发明解决的第一个问题是提供了一种酸胁迫抗性提高的重组菌，该重组菌过量表达精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。
所述ArgH的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。
所述ArgH的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中，是SEQ ID NO.2所示的序列。
所述ArgH的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中，来源于干酪乳杆菌Lactobacillus casei Zhang。
所述重组菌，在本发明的一种实施方式中，为乳酸菌。
所述重组菌，在本发明的一种实施方式中，为乳酸乳球菌或乳杆菌。
所述重组菌，在本发明的一种实施方式中，为乳酸乳球菌Lactococcus lactisNZ9000。
本发明解决的第二个问题是提供了一种所述重组菌的构建方法，是将编码SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的argH基因连接到表达质粒上获得重组质粒，再转化到宿主菌中获得重组菌。
所述表达质粒，可以是以下任意一种：pNZ8148，pNZ8149，pNZ8150。
所述宿主菌，在本发明的一种实施方式中是Lactococcus lactis NZ9000，Lactococcus lactisNZ3900或Lactobacillus casei Zhang。
所述构建方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148-argH，再将重组质粒转化到宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中，得到重组菌株Lactococcus lactis NZ-argH。
本发明的第三个目的是提供一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是在乳酸菌中过量表达精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，ArgH的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148-argH，再将重组质粒转化到宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中，得到重组菌株Lactococcus lactis NZ-argH，诱导表达ArgH。
本发明的有益效果：通过在乳酸菌中过量表达ArgH蛋白，得到了一株酸胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸菌。在酸胁迫条件下，重组菌株相对于对照菌株的生物量提高了24％，pH 4.1条件下4h存活率为对照的1.98倍。
附图说明
图1：重组质粒pNZ8148-argH的结构图；
图2：酸胁迫条件下，重组菌株与对照菌株生长性能对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做更详细的说明。
实施例1重组菌株的构建
从NCBI数据库的L.casei Zhang中得到如SEQ ID NO.2所示的ArgH的基因序列，并将其克隆到乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148-argH，再将其电转入宿主菌L.lactis NZ9000中，得到重组菌株L.lactis NZ-argH。
具体如下：
根据argH的基因序列设计分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物ArgHF、ArgHR(表1)，以L.casei Zhang的基因组为模板PCR扩增或者采用化学合成的方法，获得SEQID NO.2所示的基因片段。将PCR产物和载体pNZ8148分别用Spe I和Sph I双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接。连接产物转化大肠杆菌MC1061(商业化菌株)感受态，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pNZ8148-argH(重组质粒结构如图1所示)。然后从重组MC1061中提取重组质粒，电转化L.lactis NZ9000感受态细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株L.lactis NZ-argH。
电转化条件为：1μL质粒中与40μL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min。电压2000V，电容25μF，电阻200Ω。电击完毕后，立即向电转杯中加入1mL含有20mM MgCl2和2mM CaCl2的GM17培养基(GM17培养基配方：M17培养基+0.5％glucose)。然后置于30℃静置培养1.5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑取转化子验证。
表1引物
引物 序列
ArgHF ACATGCATGCATATGACTGATAAGTTATGGGGC
ArgHR GGACTAGTCTAGTGAGAAGCAATCATTTCCTC
实施例2 ArgH蛋白的诱导表达与检测
诱导重组菌L.lactis NZ-argH表达ArgH蛋白，并用SDS-PAGE蛋白电泳检测重组菌株L.lactisNZ-argH中ArgH蛋白的表达情况，发现与ArgH蛋白大小相似的条带的量显著增加。
具体过程如下：
将菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148)(即含有pNZ8148空质粒的L.lactis NZ9000菌株)和L.lactisNZ-argH接种于含有10μg/mL氯霉素的GM17(5mL)培养基中，30℃静置培养过夜，以4％的接种量转接至50mL含有10μg/mL氯霉素的GM17培养基中，待生长至OD6000.4时加入10ng/mL的nisin(一种乳酸链球菌素)诱导培养8h，收集诱导后的细胞，经50mMTris-HCl缓冲液(pH 7.4)离心洗涤两次后重悬于相同的缓冲液中。将菌悬液置于冰上超声破碎15min，离心收集上清液，进行SDS-PAGE分析。
经SDS-PAGE分析，重组菌L.lactis NZ-argH成功的表达了ArgH蛋白。SDS-PAGE中，在分子量约为52kDa处的蛋白质条带显著变厚重，与目标蛋白ArgH的分子量基本一致，说明成功地在L.lactis NZ9000中表达了ArgH蛋白。
实施例3酸胁迫下生长性能试验
对于考察菌株在胁迫条件下的生长情况，将菌株L.lactis NZ9000(pNZ8148)和L.lactis NZ-argH接种于含有10μg/mL氯霉素的GM17(5mL)培养基中，30℃静置培养过夜，以4％的接种量转接至50mL含有10μg/mL氯霉素的GM17培养基中，待生长至OD6000.4时加入10ng/mL的nisin，诱导培养至OD 2.0。将诱导后的培养液以4％的接种量转接至新鲜的GM17(含10μg/mL氯霉素，10ng/mL nisin，pH 5.0，乳酸调节)培养基中。分别测定L.lactisNZ9000(pNZ8148)和L.lactisNZ-argH在胁迫条件下的生长性能。
结果如图2所示。经生长性能试验分析，L.lactis NZ-argH菌株相对于L.lactisNZ9000(pNZ8148)生物量显著提高，约24％，说明在L.lactis NZ9000中表达了ArgH蛋白后，菌株耐酸性显著提高。
实施例4酸胁迫条件下耐受性试验
对于考察菌株对酸的耐受性分析试验，分别测定了重组菌株和对照菌株在pH 4.1条件下的存活率。
具体操作方式如下：将菌株诱导培养至OD 2.0，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于等体积的新鲜的pH 4.1(乳酸调节)的GM17中，胁迫不同时间。胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点种于GM17平板上测定活菌数和存活率。
经耐受性实验分析，在pH 4.1的GM17中胁迫4h后，重组菌株的存活率是对照菌株的1.98倍，说明重组菌株对酸胁迫的耐受性显著提高。
结合实施例3、4分析，可知在L.lactis NZ9000中表达了ArgH蛋白后，菌株耐酸性显著提高。说明通过在L.lactis NZ9000中表达ArgH蛋白的方法可以提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种酸胁迫抗性提高的重组乳酸菌，其特征在于，所述重组乳酸菌过量表达精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH；所述ArgH的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列；所述重组乳酸菌以pNZ8148为表达载体，以Lactococcus lactis NZ9000为宿主。
2.根据权利要求1所述的重组乳酸菌，其特征在于，所述ArgH的核苷酸序列是SEQ IDNO.2所示的序列。
3.一种权利要求1或2所述重组乳酸菌的构建方法，其特征在于，所述方法是将编码SEQID NO.1所示氨基酸序列的argH基因连接到表达质粒上获得重组质粒，再转化到宿主菌中获得重组菌。
4.权利要求1或2所述重组乳酸菌在食品、饲料、精细化学品领域的应用。
5.一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是在乳酸菌中过量表达精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH；所述ArgH的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌为乳酸乳球菌或乳杆菌。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148-argH，再将重组质粒转化到宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中，得到重组菌株Lactococcus lactis NZ-argH，诱导表达ArgH。
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