CN111269929A - 一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法 - Google Patents

一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111269929A
CN111269929A CN202010080994.8A CN202010080994A CN111269929A CN 111269929 A CN111269929 A CN 111269929A CN 202010080994 A CN202010080994 A CN 202010080994A CN 111269929 A CN111269929 A CN 111269929A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pdawn
lactobacillus
pnz8148
gfp
constructing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010080994.8A
Other languages
English (en)
Inventor
王汉杰
潘惠卓
孙韬
常津
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University
Original Assignee
Tianjin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University filed Critical Tianjin University
Priority to CN202010080994.8A priority Critical patent/CN111269929A/zh
Publication of CN111269929A publication Critical patent/CN111269929A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：1)包含蓝光敏感启动子(pDawn)的乳酸菌表达质粒pNZ8148‑pDawn的构建；2)含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的乳酸菌表达质粒pNZ8148‑pDawn‑GFP的构建；3)将重组质粒pNZ8148‑pDawn‑GFP转化至NZ9000乳酸菌；4)以报告基因GFP验证蓝光诱导下构建的乳酸菌的光响应能。实现蓝光诱导下乳酸菌的绿色荧光蛋白表达，20Hz 475nm蓝光照射20min后乳酸菌内GFP表达效率可达80％。

Description

一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法。
背景技术
目前，利用基因工程改造的微生物如大肠杆菌、乳酸菌等，已被广泛应用于开发“微生物药物”，治疗众多肠炎等疾病。其中，乳酸菌作为人和动物肠道内正常菌群之一，已被证明具有诸多益生功能，而且乳酸菌是被公认为安全无毒的，是一种食品级益生菌。因此，采用乳酸菌表达的外源蛋白质可免去复杂、繁琐的后提纯工艺；同时，乳酸菌可以在肠道中存活定植，其外源基因表达用于治疗或免疫作用的活性物质可以持续地在肠道中产生，成为人和动物体内功能性生物制剂的“加工车间”，从而起到相应的保护和治疗性作用。然而，现在利用乳酸菌生产活性物质均依赖于化学物质诱导或者自发表达，前者需要在乳酸菌培养基中添加外源的化学物质，对于乳酸菌的生长可能产生代谢负担；而后者不具备调控能力，在实际应用中短板明显。
发明内容
本发明为克服现有技术的不足，提供一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法。
本发明的技术方案如下：一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
1)包含蓝光敏感启动子(pDawn)的乳酸菌表达质粒pNZ8148-pDawn的构建；
2)含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的乳酸菌表达质粒pNZ8148-pDawn-GFP的构建；
3)将重组质粒pNZ8148-pDawn-GFP转化至NZ9000乳酸菌；
4)以报告基因GFP验证蓝光诱导下构建的乳酸菌的光响应能力。
所述步骤1)中质粒pNZ8148-pDawn构建的具体步骤：
(1)利用PCR技术从模板(Addgene#107742)扩增pDawn片段，引物设计如下：
Forward：CGCCAGAGGTAAAATAGTCAACACGC
Reversed：TCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTA
(2)利用T4多聚核苷酸激酶将其5’端磷酸化；
(3)利用PCR技术将载体pNZ8148线性化，并避开原有启动子区域，引物设计如下：
Forward：TCTAGAGAGCTCAAGCTTTCTTTGAAC
Reversed：TGAGATCTGGAGCTGTAATATAAAAACCTTCTTCA
(4)利用T4连接酶，将pDawn片段与线性化的pNZ8148载体连接，构建pNZ8148-pDawn 质粒。
所述步骤2)中质粒pNZ8148-pDawn-GFP构建的具体步骤：
(1)利用PCR技术将载体pNZ8148-pDawn线性化，引物设计如下：
Forward：TGAGATCTGGAGCTGTAATATAAAAACCTTCTTCA
Reversed：CCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGC
(2)利用PCR技术扩增GFP片段，并利用T4多聚核苷酸激酶将其5’端磷酸化，引物设计如下：
Forward：ATGGTGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACT
Reversed：TTATTTGTATAGTTCATCCATGCCGAGTGTAAT
(3)利用T4连接酶，将GFP片段与线性化的pNZ8148-pDawn载体连接，构建pNZ8148-pDawn 质粒。
(4)将构建的pNZ8148-pDawn质粒转化至大肠杆菌TG1感受态，筛选的阳性克隆测序并提取质粒。
所述步骤3)中将重组阳性质粒pNZ8148-pDawn-GFP电转入乳酸菌NZ9000的具体步骤：
(1)将NZ9000乳酸菌制备感受态，-80℃保存备用；
(2)将重组阳性质粒10μl加入50μl感受态中，混匀后加入电击杯，设置电转化程序2.5kV， 1pluse。转化后的菌液涂布含氯霉素抗性的M17固体培养基。
(3)将单菌落活化备用。
所述步骤4)中以报告基因GFP验证蓝光诱导下构建的乳酸菌的光响应能力的具体步骤： (1)将含pNZ8148-pDawn-GFP质粒的蓝光响应的乳酸菌工程菌株按照1:100的比例接入M17 培养基，培养至对数期时(OD600＝0.5)，给予脉冲式蓝光诱导。
(2)分别在诱导10分钟，20分钟，30分钟，1小时及2小时时取样1mL,利用4％多聚甲醛室温固定15min，用PBS在12000rpm，5min离心条件下清洗两次，并用500μl PBS重悬，流式上机分析荧光强度。
为了乳酸菌其更方便地用于生产及临床，我们设计了一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株，并以绿色荧光蛋白(GFP)为例，探索光诱导下乳酸菌中GFP的表达效率。
本发明的方法能够实现蓝光诱导下乳酸菌的绿色荧光蛋白表达，20Hz 475nm蓝光照射 20min后乳酸菌内GFP表达效率可达80％。
有益效果
1.本发明的一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法，能够实现蓝光诱导下乳酸菌的绿色荧光蛋白表达，20Hz 475nm蓝光照射20min后乳酸菌内GFP表达效率可达80％。
2.本发明的一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法，在生物医学工程如合成生物学及发酵工程等领域具有较高的科研应用前景。
附图说明
图1是蓝光诱导下乳酸菌内绿色荧光蛋白表达的示意图。
图2是不同时间蓝光诱导下乳酸菌内绿色荧光蛋白的表达流式图。
图3是不同时间蓝光诱导下乳酸菌内绿色荧光蛋白的表达荧光图。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了更好地使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。
实施例1
一种蓝光诱导表达红色荧光蛋白的重组乳酸菌的构建
以重组阳性质粒pNZ8148-pDawn-GFP为模板，将绿色荧光蛋白GFP替换为红色荧光蛋白mCherry，构建pNZ8148-pDawn-mCherry，将其转化至TG1感受态菌株，将阳性克隆提取质粒，转化到乳酸菌中，具体步骤如下：NZ9000乳酸菌制备感受态，按照重组阳性质粒10 μl，感受态50μl的比例加入电击杯，设置电转化程序2.5kV，1pluse。转化后的菌液涂布含氯霉素抗性的M17固体培养基，挑取单菌落测序。
实施例2
一种蓝光诱导表达绿色荧光蛋白的重组大肠杆菌的构建
以重组阳性质粒pNZ8148-pDawn-GFP为模板，将光感启动子pDawnn及绿色荧光蛋白GFP克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T，构建pGEX-4T-pDawn-GFP，转化到BL21(DE3) 大肠杆菌菌株中，转化后的菌液涂布含卡那霉素抗性的LB固体培养基，挑取单菌落测序。蓝光诱导下可表达绿色荧光蛋白GFP(图1-图3)。
实施例3
一种蓝光诱导表达红色荧光蛋白的重组大肠杆菌的构建
以重组阳性质粒pNZ8148-pDawn-GFP为模板，将红色荧光蛋白RFP克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T，构建pGEX-4T-pDawn-RFP，转化到BL21(DE3)大肠杆菌菌株中，转化后的菌液涂布含卡那霉素抗性的LB固体培养基，挑取单菌落测序。蓝光诱导下可表达红色荧光蛋白RFP。
应当理解的是，这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> synthetic
<400> 1
cgccagaggt aaaatagtca acacgc 26
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> synthetic
<400> 2
tcccggtgcc taatgagtga gcta 24
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> synthetic
<400> 3
tctagagagc tcaagctttc tttgaac 27
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> synthetic
<400> 4
tgagatctgg agctgtaata taaaaacctt cttca 35
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> synthetic
<400> 5
atggtgagta aaggagaaga acttttcact 30
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> synthetic
<400> 6
ttatttgtat agttcatcca tgccgagtgt aat 33
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> synthetic
<400> 7
tgagatctgg agctgtaata taaaaacctt cttca 35
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> synthetic
<400> 8
ccttcttaaa gttaaacaaa attatttcta gagc 34

Claims (7)

1.一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)包含蓝光敏感启动子(pDawn)的乳酸菌表达质粒pNZ8148-pDawn的构建；
2)含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的乳酸菌表达质粒pNZ8148-pDawn-GFP的构建；
3)将重组质粒pNZ8148-pDawn-GFP转化至NZ9000乳酸菌；
4)以报告基因GFP验证蓝光诱导下构建的乳酸菌的光响应能力。
2.根据权利要求1所述的一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中质粒pNZ8148-pDawn的骨架为商品化乳酸菌表达载体pNZ8148。
3.根据权利要求1所述的一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中质粒pNZ8148-pDawn的构建步骤的包括：
1)利用PCR技术从模板扩增pDawn片段，并利用T4多聚核苷酸激酶将其5’端磷酸化；
2)利用PCR技术将载体pNZ8148线性化，并避开原有启动子区域；
3)利用T4连接酶，将pDawn片段与pNZ8148载体连接，构建pNZ8148-pDawn质粒。
4.根据权利要求3所述的一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中构建pNZ8148-pDawn质粒首先转化TG1感受态菌株，测序获得获得重组阳性质粒后，转化至乳酸菌菌株。
5.根据权利要求1所述的一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中所用的乳酸菌为食品级乳酸菌株NZ9000。
6.根据权利要求1所述的一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中所用的质粒为重组阳性质粒。
7.采用权利要求1所述的一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中构建的菌株，在475nm蓝光的光照下，可实现GFP的表达，照射20min可实现～80％的表达量，黑暗情况下绿色荧光蛋白不表达。
CN202010080994.8A 2020-02-05 2020-02-05 一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法 Pending CN111269929A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010080994.8A CN111269929A (zh) 2020-02-05 2020-02-05 一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010080994.8A CN111269929A (zh) 2020-02-05 2020-02-05 一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111269929A true CN111269929A (zh) 2020-06-12

Family

ID=70995051

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010080994.8A Pending CN111269929A (zh) 2020-02-05 2020-02-05 一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111269929A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104593311A (zh) * 2015-01-16 2015-05-06 江南大学 一种酸胁迫抗性提高的重组乳酸菌及其构建方法与应用
CN110051698A (zh) * 2019-03-18 2019-07-26 天津大学 基于微囊化处理的肠道原生菌基因改造的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104593311A (zh) * 2015-01-16 2015-05-06 江南大学 一种酸胁迫抗性提高的重组乳酸菌及其构建方法与应用
CN110051698A (zh) * 2019-03-18 2019-07-26 天津大学 基于微囊化处理的肠道原生菌基因改造的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUIZHUO PAN等: "Light-Sensitive Lactococcus lactis for Microbe-Gut-Brain Axis Regulating via Upconversion Optogenetic Micro-Nana System", 《ACS NANO》 *
吕常江: "生理工程策略提升乳酸菌γ-氨基丁酸合成效率的研究", 《中国博硕士学位论文全文数据库（博士） 工程科技I辑》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2586081C (en) Use of a bacterial vector comprising a saccharide inducible promoter as an expression system
WO2020124830A1 (zh) 基于人工串联启动子的枯草芽孢杆菌高效诱导表达系统
CN113512550B (zh) 茶树CsHAC1基因和蛋白及其应用
CN111718885B (zh) 一种枯草芽孢杆菌高效稳定的双质粒系统
CN113699128A (zh) 一种发酵生产尼克酰胺磷酸核糖转移酶的方法
CN115948440A (zh) 一种分泌表达人胰岛素原的大肠杆菌益生菌构建方法
CN112391396B (zh) 构建于大肠杆菌中的粪肠球菌群体感应基因开关系统及其表达载体、工程菌和应用
CN103772507B (zh) 一种融合型抗菌肽及其制备方法和应用
CN111269929A (zh) 一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法
CN109266676B (zh) 一种电击转化暹罗芽孢杆菌的方法
CN113005069A (zh) 一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其制备方法和应用
CN101864372A (zh) 一种抗菌肽基因工程菌株的制备方法
CN104131021A (zh) 抗菌肽共表达载体及其构建和表达方法
CN110129228B (zh) 诺卡氏菌感受态细胞的制备方法与诺卡氏菌基因编辑方法
CN116240231A (zh) 一种纳米酶级联反应系统及其制备方法和应用
CN112575006A (zh) 一种生防腐霉菌中诱导HR和活性氧积累的Elicitin类基因及其表达载体和应用
CN113462627A (zh) 构建乳链菌肽细胞分子传感器筛选乳链菌肽高产菌的方法
CN106119270A (zh) 抗菌肽HirJM79的基因工程菌的构建方法及其应用
CN107058432B (zh) 一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法
CN105296489A (zh) 一种受渗透压调控的启动子PmccPDI、其重组表达载体及应用
CN110951760A (zh) 一种蛋白延时表达开关及其在葡萄糖二酸生产中应用
CN115747126B (zh) 生产微菌素j25的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株、构建方法及应用
CN114525235B (zh) 一种提高人表皮生长因子分泌生产效率的方法
CN108771028A (zh) 一种动物饲料添加剂及其制备方法与应用
CN110106197B (zh) 一种芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200612

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication