CN112575006A - 一种生防腐霉菌中诱导HR和活性氧积累的Elicitin类基因及其表达载体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域,公开了一种生防腐霉菌中诱导HR和活性氧积累的Elicitin类基因及其表达载体和应用,本发明鉴定到分别来自寡雄腐霉(Pythium oligandrum)的Elicitin类基因POD13和缠器腐霉(Pythium periplocum)的Elicitin类基因PPOD10,所述POD13和PPOD10基因的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.1—2所示。本发明分别从寡雄腐霉和缠器腐霉中鉴定到两个Elicitin类基因,将其导入植物中,能够产生显著的HR反应,促进活性氧积累,激发植物免疫。
Description
技术领域
本发明书属于基因工程技术领域,具体涉及一种生防腐霉菌中诱导HR和活性氧积累的 Elicitin类基因及其表达载体和应用。
背景技术
在植物与病原菌的长期协同进化过程中,病原菌为了更好地侵染植物,进化出大量的攻击寄主的武器,例如效应蛋白(effector)。病原菌分泌这些效应蛋白到植物体内促进其更好地侵染寄主植物,然而,伴随着植物的共同进化,有些效应蛋白会被植物自身进化的调控抗病相关的基因识别。对病原体的识别通常会触发局部抗性反应,称为超敏反应(HR),其特征在于感染部位的快速细胞死亡。对于研究植物与病原菌互作而言,这一明显的HR反应也是作为激发植物免疫的重要信号。活性氧积累也是一个触发植物免疫反应的关键信号,也可以作为植物防御反应触发的信号标识。
寡雄腐霉(Pythium oligandrum)和缠器腐霉(Pythium periplocum)广泛存在于植物根系生态系统,在与植物接触过程中通过分泌大量激发子诱导植物对病原菌产生广泛、长期的抗性,同时对很多致病菌有很强的重寄生和拮抗作用。目前,国际上寡雄腐霉产品以卵孢子为有效成分,尚未开发出基于寡雄腐霉免疫诱抗蛋白的相关产品。我们通过大量筛选获得了两个分别来源于寡雄腐霉(Pythium oligandrum)和缠器腐霉(Pythiumperiplocum)能够触发植物过敏性反应(HR)和活性氧(ROS)积累的基因。这两个基因都包含Elicitin结构域,是典型的免疫激发子。激发HR,促进ROS积累,触发植物免疫,诱导植物产生抗病反应,有助于研究开发植物诱抗剂。这两个基因的强大功能可以作为开发植物诱抗剂的候选基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生防腐霉菌中诱导HR和活性氧积累的Elicitin类基因及其表达载体和应用。本发明鉴定到的两个免疫激发子基因可以作为开发免疫诱抗剂的理论知识补充,为防控作物病虫害提供理论指导。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
本发明鉴定到分别来自寡雄腐霉(Pythium oligandrum)的Elicitin类基因POD13和缠器腐霉(Pythium periplocum)的Elicitin类基因PPOD10,所述POD13和PPOD10基因的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.1—2所示。两个Elicitin类基因编码的蛋白质为POD13和PPOD10,其氨基酸序列依次分别为SEQ ID NO.3—4。
含有上述Elicitin类基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
含有上述Elicitin类基因的重组表达载体PBIN-PLUS:POD13和PBIN-PLUS:PPOD10。
构建所述Elicitin类基因POD13和PPOD10基因的重组表达载体PBIN-PLUS:POD13和 PBIN-PLUS:PPOD10。以植物表达载体PBIN-PLUS为出发载体,将POD13和PPOD10基因分别插入PBIN-PLUS的Sma1酶切位点获得。
所述Elicitin类基因及其表达载体可以激发植物免疫反应,为开发免疫诱抗剂提供知识基础,为防控作物病虫害提供理论指导。
一种植物免疫诱抗剂,该诱抗剂含有上述的生防腐霉免疫诱抗蛋白或上述生防腐霉免疫诱抗蛋白的发酵液。
上述的Elicitin类基因、上述的蛋白或上述的重组表达载体在诱导植物产生坏死和活性氧积累中的应用。
上述的Elicitin类基因、上述的蛋白或上述的重组表达载体在开发植物免疫诱抗剂中的应用。
上述的Elicitin类基因在培育抗病作物品种中的应用。
一种激发植物免疫的方法,将上述的Elicitin类基因或重组表达载体导入植株中,便能够激发植物免疫反应,提高植物抗性。也是一种构建抗病品种的方法,将上述的基因或重组表达载体导入作物植株中,经过抗性筛选得到阳性转化植株,获得抗病作物品种。
本发明的有益效果:
本发明分别从寡雄腐霉和缠器腐霉中鉴定到两个Elicitin类基因,将其插入表达载体 PBIN-PLUS。将所述载体导入植物中,能够产生显著的HR反应,促进活性氧积累,激发植物免疫。所述POD13和PPOD10基因可以作为开发植物免疫诱抗剂的潜在候选者,为防控植物病害理论支撑。
附图说明
图1为POD13和PPOD10基因诱导植物HR和促进植物ROS积累的效果表型图。
其中,A为诱导植物HR显著效果的表型图,左一位阴性对照GFP基因处理,左二为阳性对照INF1基因处理,右边两个分别是POD13和PPOD10两个基因处理;能够明显看出两个基因POD13和PPOD10激发HR反应。B为促进植物ROS积累的显著表型图,与A 相对应的编号,能够清楚的看到两个基因促进ROS积累程度与阳性对照程度相似,显著高于阴性对照。
图2为POD13和PPOD10基因诱导植物HR程度定量标定柱形图。能够清楚的看到两个基因激发HR程度与阳性对照程度相似,显著高于阴性对照。(Student’s t test:****p<0.0001)
图3为POD13和PPOD10基因促进植物活性氧迸发强度定量统计图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例,本领域技术人员可以确定本发明的基本特征,并且在不偏离本发明精神和范围的情况下,可以对本发明做出各种改变和修改,以使其适用各种用途和条件。
实施例1 2个Elicitin类基因的扩增和测序
1.实验菌株
供试菌株寡雄腐霉(Pythium oligandrum)1和缠器腐霉(Pythium periplocum)2由南京农业大学植病系植物与疫霉互作实验室保存菌株保存于10%V8固体培养基,保存温度为 10℃。
2.供试本氏烟草幼苗的准备
本氏烟草(Nicotiana benthamiana)播种于装有蛭石(2-4mm)的塑料花盆(d=10cm) 里,放到14h光照(强光照射)/10h黑暗的温室中生长。使其生长7天,生长出两片真叶后,将其移栽至蛭石黑土提及体积比例为5:1的培养土里生长30天,取相同3,4,5叶位的叶片用作表达实验基因,然后持续观察7天叶片表型是否有明显HR。
3.提取寡雄腐霉(Pythium oligandrum)和缠器腐霉(Pythium periplocum)RNA,并获得目的基因的cDNA
收集寡雄腐霉和缠器腐霉菌丝,然后液氮速冻后放入研钵冷却研磨。参照天根公司总 RNA抽提纯化试剂盒推荐方法进行寡雄腐霉和缠器腐霉总RNA提取和纯化。参照诺唯赞公司RNA反转录试剂盒提供的方法,以Oligo(dT)为引物反转录合成c D N A。以上述c DN A为模板,用相应上下游引物进行PCR扩增(引物序列见表1)。
表1引物序列
name | sequence |
PBIN-PLUS-Sma1-POD13-F | CGATAGGGTACCCCCATGAAGTTCCTCGCCGTC |
PBIN-PLUS-Sma1-POD13-R | GGATCCGTCGACCCCGCACGCTGGCTTGGCCGT |
PBIN-PLUS-Sma1-PPOD10-F | CGATAGGGTACCCCCATGAAGTTCCTCGCCATC |
PBIN-PLUS-Sma1-PPOD10-R | GGATCCGTCGACCCCGCACGCTGGCTTGGCCGT |
PCR反应体系为:2.5μL 10×PCR反应缓冲液;1.5μL 1.5mM MgCl2;0.5μL 2.5mMdNTPs;0.25μL Taq DNA聚合酶(5.0U/μL);0.5μL引物;0.5μL模板;无菌水补足至 25μL。
反应程序为:94℃5min预变性;94℃变性15s,58℃退火15s,72℃延伸1:30min,35个循环;72℃延伸10min;4℃保存。
上述PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、回收,经测序确认无误后,获得的序列为所述2 个Elicitin类基因的核苷酸序列。该Elicitin类基因包括分别来自寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)的Elicitin类基因POD13和缠器腐霉(Pythium periplocum)的Elicitin类基因 PPOD10,所述POD13和PPOD10基因的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.1—2所示。两个Elicitin类基因编码的蛋白质,其氨基酸序列依次分别如SEQ ID NO.3—4所示。后续研究发现其具有诱导植物产生坏死和活性氧积累的强大功能。
实施例2构建PBIN-PLUS:POD13和PBIN-PLUS:PPOD10表达载体
将PBIN-PLUS(BIOVECTOR中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)空载体质粒用SmaI进行酶切。利用诺唯赞公司的同源重组酶将cDNA和载体连接。
反应体系如下:2μL 10×CEⅡ反应缓冲液;2μL上述PCR回收产物;2μL上述酶切后的空载体;1μL同源重组酶;无菌水补足至10μL。
反应程序为:37℃条件下反应30min。将连接产物转化大肠杆菌DH5α,在Kan抗性培养基上筛选转化子,挑取阳性克隆提取质粒进行菌落PCR鉴定。将鉴定到的阳性克隆测序,正确即获得了PBIN-PLUS:POD13和PBIN-PLUS:PPOD10表达载体。
实施例3表达载体转化农杆菌及功能验证
1、获得农杆菌感受态细胞
在LB固体培养基平板上划线培养农杆菌GV3101菌株,28℃条件下倒置培养18-20h;将单菌落置于LB液体培养基(含有100mg/L Rif),28℃条件下振荡培养18-20h;100倍体积的不含抗生素的菌液加入菌液中,28℃条件下振荡培养OD600至0.3-0.5;冰上冷却后,4℃条件下4000r/min离心5min,弃上清;加入20mmol/L的CaCl2溶液使沉淀悬浮,4℃条件下4000r/min离心5min,弃上清;加入20mmol/L的CaCl2溶液再次使菌体沉淀悬浮备用。
2、PBIN-PLUS:POD13和PBIN-PLUS:PPOD10表达载体转化农杆菌
利用电转法将PBIN-PLUS:POD13和PBIN-PLUS:PPOD10载体转化农杆菌细胞;利用70%酒精冲洗电击杯三次,然后完全风干酒精。将100ng表达载体加入农杆菌感受态,冰上放置30min。将农杆菌感受态细胞转移至电击杯中,利用2.5kV的电压进行电击转化。电击完成后将农杆菌感受态细胞加入到400μL LB液体培养基中,28℃振荡培养2h。吸取20μ L菌液,均匀涂抹在含有50mm卡那霉素和25mm的利福平固体LB培养基平板上,28℃倒置培养48h。挑取单菌落进行菌落PCR,获取阳性克隆。
3、在本氏烟草中瞬时表达PBIN-PLUS:POD13和PBIN-PLUS:PPOD10蛋白
将上述阳性克隆放置于LB液体培养基中,28℃震荡培养30h。将菌液收集,用8000rpm离心2min,利用10mM MgCl2清洗三次。最后用10mM的MgCl2稀释菌液至OD600 值0.3。将菌液与含有沉默抑制子P19的菌液1:1混合。用1mL注射器在本式烟叶片上分别注射所有基因,每个最少5个重复,实验重复三次。
4、活性氧(ROS)积累检测3
注射所有处理基因36h后,用1mg/ml DAB溶液于黑暗中染色8h,然后用95%乙醇脱色处理,最后用相机拍照记录表型,结果如图1~3所示。
参考文献
1.Benhamou,N.et al.Pythium oligandrum:an example of opportunisticsuccess. Microbiology 158,2679-2694,doi:10.1099/mic.0.061457-0(2012).
2.Paul,B.&Masih,I.ITS1 region of the nuclear ribosomal DNA of themycoparasite Pythium periplocum,its taxonomy,and its comparison with relatedspecies.FEMS Microbiology Letters(2000).
3.Jambunathan,N.Determination and detection of reactive oxygenspecies(ROS), lipid peroxidation,and electrolyte leakage in plants.MethodsMol Biol 639,292-298, doi:10.1007/978-1-60761-702-0_18(2010).
POD13基因
ATGAAGTTCCTCGCCGTCGCCTTCGCCGCCACCATCGCCGTCGCCACTGCCGATGACTG CTCCATCGACGCCCTCAGTGCGCTCTTGAAGAACACCAACCTCCAGAAGTGTGGCACC GAAGCGAGCTACAGCTTCGTGCCTCCAACCAAGCCAACGGAGGCTCAGCTCAAGGGTA TGTGCGCCAGTGCGGCCTGCAATGCGTTGTTGGCGGATGTGCAGAAGCTCAACCTTGC CGAGTGCACGGTGCCATTGGGCGACAAGATCAAGTTGCGTGCGGATTTGATTGACTACGCTGCGAACTACTGCAAGAGCTCTGGTCCTGCTCCAACTCCAGGTCCGGGTCCATTGCC GACGCCATCGACGTCTGGCACGACGCCTGGTGTCACGCCTTCGGTGACGACGGCCAAG CCAGCGTGCTAA
PPOD10基因
ATGAAGTTCCTCGCCGTCGCCTTCGCCGCCACCATCGCCGTCGCTACTGCCGATGACTG CTCCATCGACGCCCTCAGCGCGCTCTTGAAGAACACCAACCTCCAGAAGTGTGGCACC GAAGCGAGCTATAGCTTCGTGCCTCCAACCAAGCCAACGGAGGCTCAGCTCAAGGGTA TGTGCGCCAGCGCGGCCTGTAATGCGTTGTTGGCGGATGTGCAGAAGCTCAACCTTCCC GAGTGCACGGTGCCATTGGGTGACAAGATCAAGTTGCGTGCGGATTTGATTGACTACGCTGCGAACTACTGCAAGAGCTCTGGTCCTGCTCCAACTCCAGGTCCGGGTCCATCGCCG ACTCCATCGACATCTGGCACGACGCCTGGTGTCACGCCTTCGGTGACGACGGCCAAGC CAGCGTGCTAA
POD13蛋白
MKFLAVAFAATIAVATADDCSIDALSALLKNTNLQKCGTEASYSFVPPTKPTEAQLKGMC ASAACNALLADVQKLNLAECTVPLGDKIKLRADLIDYAANYCKSSGPAPTPGPGPLPTPST SGTTPGVTPSVTTAKPAC*
PPOD10蛋白
MKFLAIAFAATIAVATADDCSIDALSALLKNTNLQKCGTEASYSFVPPTKPTEAQLKGMCAS AACNALLADVQKLNLPECTVPLGDKIKLRADLIDYAANYCKSSGPAPTPGPGPSPTPSTSGT TPGVTPSVTTAKPAC*。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种生防腐霉菌中诱导HR和活性氧积累的Elicitin类基因及其表达载体和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 420
<212> DNA
<213> 寡雄腐霉(Pythium oligandrum)
<400> 1
atgaagttcc tcgccgtcgc cttcgccgcc accatcgccg tcgccactgc cgatgactgc 60
tccatcgacg ccctcagtgc gctcttgaag aacaccaacc tccagaagtg tggcaccgaa 120
gcgagctaca gcttcgtgcc tccaaccaag ccaacggagg ctcagctcaa gggtatgtgc 180
gccagtgcgg cctgcaatgc gttgttggcg gatgtgcaga agctcaacct tgccgagtgc 240
acggtgccat tgggcgacaa gatcaagttg cgtgcggatt tgattgacta cgctgcgaac 300
tactgcaaga gctctggtcc tgctccaact ccaggtccgg gtccattgcc gacgccatcg 360
acgtctggca cgacgcctgg tgtcacgcct tcggtgacga cggccaagcc agcgtgctaa 420
<210> 2
<211> 420
<212> DNA
<213> 缠器腐霉(Pythium periplocum)
<400> 2
atgaagttcc tcgccgtcgc cttcgccgcc accatcgccg tcgctactgc cgatgactgc 60
tccatcgacg ccctcagcgc gctcttgaag aacaccaacc tccagaagtg tggcaccgaa 120
gcgagctata gcttcgtgcc tccaaccaag ccaacggagg ctcagctcaa gggtatgtgc 180
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acggtgccat tgggtgacaa gatcaagttg cgtgcggatt tgattgacta cgctgcgaac 300
tactgcaaga gctctggtcc tgctccaact ccaggtccgg gtccatcgcc gactccatcg 360
acatctggca cgacgcctgg tgtcacgcct tcggtgacga cggccaagcc agcgtgctaa 420
<210> 3
<211> 139
<212> PRT
<213> 寡雄腐霉(Pythium oligandrum)
<400> 3
Met Lys Phe Leu Ala Val Ala Phe Ala Ala Thr Ile Ala Val Ala Thr
1 5 10 15
Ala Asp Asp Cys Ser Ile Asp Ala Leu Ser Ala Leu Leu Lys Asn Thr
20 25 30
Asn Leu Gln Lys Cys Gly Thr Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Val Pro Pro
35 40 45
Thr Lys Pro Thr Glu Ala Gln Leu Lys Gly Met Cys Ala Ser Ala Ala
50 55 60
Cys Asn Ala Leu Leu Ala Asp Val Gln Lys Leu Asn Leu Ala Glu Cys
65 70 75 80
Thr Val Pro Leu Gly Asp Lys Ile Lys Leu Arg Ala Asp Leu Ile Asp
85 90 95
Tyr Ala Ala Asn Tyr Cys Lys Ser Ser Gly Pro Ala Pro Thr Pro Gly
100 105 110
Pro Gly Pro Leu Pro Thr Pro Ser Thr Ser Gly Thr Thr Pro Gly Val
115 120 125
Thr Pro Ser Val Thr Thr Ala Lys Pro Ala Cys
130 135
<210> 4
<211> 139
<212> PRT
<213> 缠器腐霉(Pythium periplocum)
<400> 4
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1 5 10 15
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20 25 30
Asn Leu Gln Lys Cys Gly Thr Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Val Pro Pro
35 40 45
Thr Lys Pro Thr Glu Ala Gln Leu Lys Gly Met Cys Ala Ser Ala Ala
50 55 60
Cys Asn Ala Leu Leu Ala Asp Val Gln Lys Leu Asn Leu Pro Glu Cys
65 70 75 80
Thr Val Pro Leu Gly Asp Lys Ile Lys Leu Arg Ala Asp Leu Ile Asp
85 90 95
Tyr Ala Ala Asn Tyr Cys Lys Ser Ser Gly Pro Ala Pro Thr Pro Gly
100 105 110
Pro Gly Pro Ser Pro Thr Pro Ser Thr Ser Gly Thr Thr Pro Gly Val
115 120 125
Thr Pro Ser Val Thr Thr Ala Lys Pro Ala Cys
130 135
Claims (10)
1.一种生防腐霉菌中诱导HR和活性氧积累的Elicitin类基因,该基因为POD13和PPOD10中的至少一种,所述POD13和PPOD10的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.1~2所示。
2.权利要求1所述Elicitin类基因编码的生防腐霉免疫诱抗蛋白,该蛋白的氨基酸序列依次分别如SEQ ID NO 3~4所示。
3.含有权利要求1所述Elicitin类基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体,其特征在于,该重组表达载体的出发载体为表达载体PBIN-PLUS。
5.一种植物免疫诱抗剂,其特征在于,该诱抗剂含有权利要求2所述的生防腐霉免疫诱抗蛋白或权利要求2所述生防腐霉免疫诱抗蛋白的发酵液。
6.权利要求1中所述的Elicitin类基因、权利要求2中所述的蛋白或权利要求3或4中所述的重组表达载体在诱导植物产生坏死和活性氧积累中的应用。
7.权利要求1中所述的Elicitin类基因、权利要求2中所述的蛋白或权利要求3或4中所述的重组表达载体在开发植物免疫诱抗剂中的应用。
8.权利要求1所述的Elicitin类基因在培育抗病作物品种中的应用。
9.一种激发植物免疫的方法,其特征在于,将权利要求1所述的Elicitin类基因或权利要求3或4中所述的重组表达载体导入植株中,激发植物免疫反应,提高植物抗性。
10.一种培育抗病作物品种的方法,其特征在于,将权利要求1所述的Elicitin类基因或权利要求3或4中所述的重组表达载体导入植株中,经过抗性筛选得到阳性转化植株,获得抗病作物品种。
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