CN116024234B

CN116024234B - 一种杨树壳针孢菌效应蛋白SmCSEP3及其应用

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Publication number: CN116024234B
Application number: CN202211588272.9A
Authority: CN
Inventors: 熊琴; 郑新月; 张亚鑫
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2022-12-12
Filing date: 2022-12-12
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2042-12-12
Also published as: CN116024234A

Abstract

本发明公开了一种杨树壳针孢菌效应蛋白SmCSEP3及其应用。该效应因子具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。该效应因子SmCSEP3可以诱导植物防御反应，包括引起植物细胞过敏性坏死、诱导ROS迸发、胼胝质积累和植物免疫相关通路如水杨酸通路、茉莉酸通路和乙烯介导的免疫相关基因的上调表达，亚细胞定位结果也一并说明该蛋白可能是一种可以诱导植物免疫的激发子，为杨树病害的绿色防控提供参考。本发明发现了一种在侵染过程中高表达的SmCSEP3效应子，初步分析其可能在病原壳针孢菌与杨树互作中发挥重要功能，为进一步探索病原菌与植物互作提供依据。

Description

一种杨树壳针孢菌效应蛋白SmCSEP3及其应用

技术领域

本发明属于分子植物病理学技术领域，具体涉及效应蛋白SmCSEP3及其应用。

背景技术

杨树Populus spp.是世界上适应性最强、栽培范围最广泛和对碳固定贡献最大的造林树种之一，也是造纸、包装材料和胶合板等重要工业用材，具有较高的经济和社会效益。杨树因速生丰产、实用性强、无性繁殖能力强且全基因组较小、高效的遗传转化体系的建立、功能基因组研究深入等，杨树已成为多年生木本植物研究的理想模式物种。目前我国杨树资源丰富，分布范围广，人工林栽植面积已超过700万公顷。在实施以森林保护和生态建设为主要目标的国家级六大林业重点工程以来，杨树在我国栽植面积越来越大，居世界首位。由于我国对木材的巨大需求，缺口仍然巨大。但随着杨树种植面积的增加，且人工林的林分结构单一，大规模的病虫害极易暴发流行，丧失其人工林的生态、经济和社会价值，造成巨大损失，如杨树叶斑和茎溃疡病已经扩大全世界(Callan et al.,2007；Dos Santoset al.，2010；Sakalidis et al.,2016)。引起该病的壳针孢菌寄主范围广，可在美洲黑杨Populus deltoides、欧洲黑杨P.nigra、辽杨P.maximowiczii、香脂杨P.balsamifera、毛果杨P.trichocarpa等及它们的杂交种上引起叶斑病，导致过早落叶，植株光合作用效率下降；也可在引进品种及杂交种上引起茎部溃疡病(Dunnell,2016)，而溃疡病斑常深入茎干部皮层组织，易遭风折断裂，病斑环绕树干严重时导致杨树死亡，每年可造成高达63％的生物量损失(Feau et al.,2010)。迄今为止，化学防治是防控该真菌病害的主要手段，但效果均不显著(Tabima et al.,2020)。种植抗病品种是目前生产上最安全、有效的防控措施，因此，寻找新的抗病策略、发掘并利用关键基因，改良杨树品种，提高杨树对不同病害的抗性迫在眉睫。

与病原菌长期协同进化中，植物形成完备的免疫反应机制以抵制病原菌入侵，首先，植物细胞表面的模式识别受体(Pattern Recognition Receptors，PRRs)识别病原体相关分子模式(Pathogen associated Molecular Patterns，PAMPs)，从而激发防卫反应，阻碍病原菌的进一步扩展，即病原体相关分子模式触发的免疫反应(PAMP-TriggeredImmunity，PTI)(Chisholm et al.,2006；Grant and lamb,2006；Jones and Dangl,2006；Abhilash et al.,2012)，这类能诱导植物免疫反应的因子俗称为植物免疫激发子。目前，越来越多的研究正在利用植物免疫理论鉴定病原菌分泌的新型植物免疫激发子，以用于防治农作物病虫害，但在林木森林保护领域的应用相对较少。国内外尚未从壳针孢菌中分离鉴定能够引起植物免疫反应的植物免疫激发子。从分子植物病理学角度研究增强杨树对壳针孢菌的抗病性少有人研究。因此，从壳针孢菌中寻找能够引起植物细胞坏死的效应蛋白，不仅对揭示该病原菌和杨树互作机制提供理论依据，还能够为开发提高植物免疫抗性的“植物疫苗”提供有效的资源，对杨树病害的抗病育种提供新策略，对杨树病害的环境友好型的绿色防控具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种可以诱发植物自身免疫的的杨树壳针孢菌效应蛋白SmCSEP3，可作为杨树抗病育种的候选材料，可作为诱导植物抗性的植物免疫激发子，为后期开发植物免疫诱导剂提供理论依据，为防控杨树病虫害提供理论指导。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明提供一种效应因子，该效应因子具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。该蛋白是引起杨树叶斑和茎溃疡病的壳针孢菌(Sphaerulina musiva)分泌的一种效应因子蛋白SmCSEP3。

本发明还提供一种效应因子基因，该效应因子基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。该基因是效应因子蛋白SmCSEP3的编码基因。

其中，SEQ ID NO.1由990个核苷酸组成，第1-990位为ORF，编码序列表中SEQIDNo.2所示的蛋白质，SEQ ID NO.2由329个氨基酸组成，其中第1-22位氨基酸为信号肽序列。

本发明还提供一种具有分泌活性信号肽，SEQ ID NO.2的第1-22位氨基酸为信号肽序列。该信号肽具有如SEQ ID NO.35所示的氨基酸序列。

一种具有分泌活性信号肽的编码基因，该信号肽的编码基因具有如SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列。

含有上述效应因子基因的生物材料也属于本发明的保护范围，该生物材料为表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。

本发明在杨树壳针孢菌S.musiva SO2202全基因组测序基础上，通过生物信息学预测出杨树壳针孢菌142个效应蛋白，并结合壳针孢菌侵染阶段转录组分析，筛选到28个候选效应蛋白SmCSEP1-SmCSEP28；最终筛选出了能在植物叶片上诱导细胞死亡的SmCSEP3蛋白。

用于克隆SmCSEP3效应因子基因的引物对包括PVX-SmCSEP3引物对、pSUC2-SmCSEP3引物对、pENTR-SmCSEP3引物对、pEG101-SmCSEP3引物对中的至少一种；

所述PVX-SmCSEP3引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

所述PVX-SmCSEP3引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；

所述pSUC2-SmCSEP3引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；

所述pSUC2-SmCSEP3引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；

所述pENTR-SmCSEP3引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；

所述pENTR-SmCSEP3引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；

所述pEG101-SmCSEP3引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；

所述pEG101-SmCSEP3引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。

上述的效应因子基因，上述的效应因子，上述的具有分泌活性信号肽，上述的具有分泌活性信号肽的编码基因，或上述的生物材料在下述(1)～(8)中至少一种中的应用：

(1)引起植物细胞过敏性坏死；

(2)诱导植物ROS迸发；

(3)诱导植物胼胝质沉积；

(4)上调植物免疫相关通路标志基因的表达；

(5)诱发植物自身免疫；

(6)提高植物对病原菌的抗病性；

(7)制备提高植物对病原菌抗病性的产品；

(8)植物抗病育种。

所述的植物是烟草或/和毛果杨。所述的病原菌为壳针孢菌或/和辣椒疫霉。例如，提高烟草对辣椒疫霉的抗病性，或毛果杨对壳针孢菌的抗病性。

一种提高植物对病原菌抗病性的方法，在目标植物中瞬时表达或过表达上述的效应因子基因。

本发明对壳针孢菌侵染阶段进行转录组分析，筛选出28个候选效应蛋白在壳针孢菌侵染3个不同杨树品种过程中均高表达。

在烟草叶片的瞬时表达，通过Western bot对SmCSEP3蛋白在烟草细胞中瞬时表达的情况进行了验证，Western blot结果显示该蛋白在烟草中成功瞬时表达。研究发现：只有SmCSEP3蛋白在本氏烟草叶片上诱导细胞死亡。利用酵母信号肽分泌实验验证所述的SmCSEP3蛋白N端信号肽具有分泌活性。通过亚细胞定位观察发现所述的SmCSEP3蛋白定位于细胞膜外。

通过在烟草中过表达壳针孢菌效应因子SmCSEP3发现：所述的SmCSEP3蛋白能够诱导植物ROS迸发、胼胝质沉积和上调植物免疫相关通路标志基因的表达。所述的SmCSEP3蛋白诱导烟草对辣椒疫霉的抗性，提高植物对病原菌的抗病性。

本发明的有益效果：

本发明在杨树壳针孢菌S.musiva SO2202全基因组测序基础上，通过生物信息学预测出杨树壳针孢菌142个效应蛋白，并结合壳针孢菌侵染阶段转录组分析，筛选到28个候选效应蛋白SmCSEP1-SmCSEP28。通过烟草叶片的瞬时表达，发现只有SmCSEP3可以在本氏烟草叶片上诱导细胞死亡，并通过Western bot对SmCSEP3蛋白在烟草细胞中瞬时表达的情况进行了验证。SmCSEP3 N端的信号肽具有分泌活性，SmCSEP3可以在烟草细胞上诱导细胞坏死，诱导ROS迸发、胼胝质积累和植物免疫相关通路如水杨酸通路、茉莉酸通路和乙烯介导的免疫相关基因的上调表达。除此之外，SmCSEP3增强了植物对辣椒疫霉的抗病性。

相比现有技术，本发明的优点为：

通过从壳针孢菌众多的效应子中挖掘出能有效诱导植物细胞死亡的壳针孢效应蛋白SmCSEP3，利用其诱导植物细胞死亡的功能促进解析杨树壳针孢病菌与杨树互作的分子机理，为开发提高植物免疫抗性的“植物疫苗”提供有效的资源，对建立杨树病害的抗病育种和绿色防控具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1.本发明的28个候选效应蛋白在壳针孢菌侵染三种不同杨树品种过程中的转录表达情况图；

从壳针孢菌S.musiva SO2202全基因组中预测出142个效应蛋白，用S.musivaMN14菌株接种侵染3种不同的杨树品种后，分别测定了这142个候选效应子在不同侵染阶段(0h、24h、72h)的转录水平，选出在侵染阶段高表达的28个候选效应子。

图2.本发明的效应蛋白SmCSEP3重组农杆菌在烟草叶片进行渗透注射的瞬时表达图；

将重组农杆菌在烟草叶片背面渗透注射，每个注射点做好标记(A)。4d后拍照记录并用酒精脱色以更直观观察坏死效果(B)。侵染48h后每个注射点采样，烟草提取总蛋白，进行Western blot实验，验证蛋白表达情况(C)。

图3.本发明的效应蛋白SmCSEP3运用酵母信号肽分泌功能验证信号肽活性的实验结果图；

利用用酵母信号肽分泌功能验证方法，对SmCSEP3蛋白的信号肽分泌功能进行验证，以大豆疫霉中的Avr1b的信号肽为阳性对照；空载pSUC2和酵母YTK12菌株作为阴性对照，结果显示SmCSEP3的信号肽具有分泌活性。

图4.本发明的效应蛋白SmCSEP3亚细胞定位的实验结果图；

利用烟草瞬时表达系统，将重组农杆菌在烟草叶片背面渗透注射，每个注射点做好标记。48h后进行共聚焦显微镜观察其亚细胞定位(A)。为了更好的验证效应蛋白SmCSEP3是否定位于膜外，对叶片进行质壁分离处理。叶片制片观察时，以1M NaCl溶液为媒介，10min后共聚焦观察质壁分离后的荧光定位(B)。

图5.本发明的效应蛋白SmCSEP3诱发烟草叶片ROS迸发的实验结果图。

利用烟草瞬时表达系统，将重组农杆菌在烟草叶片背面渗透注射，每个注射点做好标记。48h后采集烟草叶盘(1cm²)于96孔板中，用200μl无菌水保持过夜以消除物理损伤引起的ROS。叶子用含有37.5μg/ml鲁米诺和25μg/ml辣根过氧化物酶处理，在562nm下使用多扫描光谱测试荧光。

图6.本发明的效应蛋白SmCSEP3诱发烟草叶片胼胝质沉积的实验结果图。

利用烟草瞬时表达系统，将重组农杆菌在烟草叶片背面渗透注射，每个注射点做好标记。48h后采集烟草叶盘(1cm²)，将其用酒精脱色后在pH 9.5的含0.1％(W/V)苯胺蓝的150mM磷酸缓冲液中暗处理2h。染色结束后在荧光显微镜下拍照观察胼胝质的沉积情况。

图7.本发明的效应蛋白SmCSEP3提高烟草防御反应相关基因表达水平的实验结果图。

利用烟草瞬时表达系统，将重组农杆菌在烟草叶片背面渗透注射，每个注射点做好标记。48h后收集烟草叶片，提取总RNA，反转录后进行qRT-PCR，检测烟草相关防卫基因(超敏反应相关基因NbHIN1、NbHSR203J；水杨酸(SA)—、茉莉酸(JA)—或乙烯介导的免疫相关基因NbPR1a、NbPR2、NbPR4和NbERF1；PTI反应相关基因NbCYP71D20、NbPTI5、NbAcre31、NbWRKY7和NbWRKY8)的表达情况。

图8.本发明的效应蛋白SmCSEP3诱导烟草对辣椒疫霉的抗病性的实验结果图。

利用烟草瞬时表达系统，将重组农杆菌在烟草叶片背面渗透注射，每个注射点做好标记。注射24h后叶片接种辣椒疫霉。在接种2d和3d进行发病症状观察，照相记录结果。与阴性对照相比，过表达SmCSEP3的烟草在接种辣椒疫霉后出现病斑显著性减小，这些结果证实了过表达SmCSEP3提高烟草对辣椒疫霉的抗病性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

本发明提供了壳针孢菌效应子SmCSEP3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

本发明提供了壳针孢菌效应子SmCSEP3基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；SEQ ID NO.2的第1-22位氨基酸为信号肽序列。

本发明还提供了具有分泌活性信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示的氨基酸序列。具有分泌活性信号肽的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示。

本发明涉及到的材料与方法如下所示：

1.材料与方法

1.1实验材料

供试真菌菌株：S.musiva MN-14；辣椒疫霉，由南京农业大学王源超教授赠与，25℃恒温黑暗培养；酵母YTK12菌株，由南京农业大学窦道龙教授赠予，30℃恒温培养。

供试植物：3种杨树抗感病品种：BESC347、BESC367、GW9827；本氏烟草，本实验室提供，光照培养箱中培养(25℃光照16h，22℃黑暗8h)。

供试细菌菌株：大肠杆菌DH5α菌株，从北京擎科生物科技有限公司购买，37℃恒温培养；农杆菌GV3101(pJIC SA_Rep)菌株，由南京农业大学王源超教授赠予。

供试载体：载体pEG101、pEG104，本实验室提供；载体pSUC2、pSUC2-Avr1b SP由南京农业大学窦道龙教授赠予；载体PVX、PVX-INF1、PVX-GFP由南京农业大学王源超教授赠与。

本发明实验过程中所涉及的生物材料和试剂，除特殊说明外，均为现有技术中已公开的或可从商业途径获得的生物材料和试剂。

1.2实验方法

1.2.1壳针孢菌侵染阶段转录组分析。

1.2.2目的基因的克隆与载体构建。

用PVX-SmCSEP3引物对、pSUC2-SmCSEP3引物对、pENTR-SmCSEP3引物对、pEG101-SmCSEP3引物对进行PCR扩增。

所述pEG101-SmCSEP3引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；

目的片段扩增后构建入pENTR载体并转入DH5α感受态，测序验证后通过Gateway技术构建pEG101重组载体。选取pGR107载体SmaΙ酶切位点，保留了HA标签，运用同源重组的方法进行PVX载体构建并转入DH5α感受态，测序验证。设计引物扩增信号肽区域连接至pMD19-T载体，测序验证。根据pSUC2T7M13ORI(pSUC2)载体的EcoRI-XhoI酶切位点，通过同源重组构建重组载体并转入DH5α感受态，测序验证。阳性转化子、pSUC2-Avr1b SP和pSUC2转化至酵母菌株YTK12中，pSUC2-Avr1b SP作为阳性对照，pSUC2空载作为阴性对照。

1.2.3效应蛋白SmCSEP3诱导烟草叶片坏死。

农杆菌介导的烟草瞬时转化本实验中所有构建的重组PVX载体均通过冻融法转化至农杆菌GV3101中。阳性重组农杆菌用液体LB培养基(50μg·mL^-1Kan，25μg·mL^-1Rif)摇菌，28℃，220rpm震荡培养16h。4000rpm，5min收集菌体，用1ml渗透液(10mM MES、10mMMgCl₂、200mM AS)洗涤菌液，重复三次，并调节OD₆₀₀＝0.4，室温条件下静置3h。选取一个月大小的烟草叶片，用去掉针头的1ml注射器在叶片背面进行渗透注射，以PVX-GFP和渗透液作为阴性对照，PVX-INF1作为阳性对照。每个处理接种3株烟草，每个处理重复3次，接种后的植物置于植物培养箱培养，4d后拍照记录。由于PVX载体含有一段HA标签蛋白，构建载体时保留了HA标签蛋白序列。将重组载体转化进入农杆菌GV3101中，注射烟草48h后用NP40(碧云天)提取烟草叶片总蛋白，进行Western blot实验，以HA标签蛋白为抗体。

1.2.4信号肽分泌功能验证

利用酵母信号肽分泌系统对SmCSEP 3蛋白的信号肽分泌功能进行验证。

酵母菌株YTK12，无色氨酸合成基因，无蔗糖转化酶基因；pSUC2有色氨酸合成基因，有一个缺失ATG及信号肽的蔗糖转化酶基因；CMD-W培养基(6.7g/L yeast N basewithout amino acids，0.75g/L tryptophan dropout supplement，20g/L sucrose，1g/Lglucose and 20g/L agar)，不含色氨酸，以蔗糖和葡萄糖为碳源；YPRAA培养基(10g/Lyeast extract，20g/L peptone，20g/L raffinose，and 2g/L antimycin A)不含色氨酸，以棉籽糖为碳源。以未转化的YTK12菌株和空载pSUC2为阴性对照，pSUC2-Avr1bSP作为阳性对照。如果预测的信号肽具有分泌功能，则可以将蔗糖转化酶分泌至细胞外，使2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)还原为红色的1，3，5-三苯甲臜，通过将转化的酵母进行TTC染色可以进一步确定其信号肽的分泌功能。将阳性克隆接种于5ml CMD-W液体培养基中，30℃震荡培养24h，4700rpm，1min收集菌体，ddH₂O洗涤两次。最终吸取0.4ml菌液，加入50g/L蔗糖溶液，10g/L TTC，37℃孵育30min观察颜色变化，若颜色变为红色说明信号肽具有分泌功能。

1.2.5本发明的效应蛋白SmCSEP3亚细胞定位分析。

农杆菌介导的烟草瞬时转化本实验中所有构建的重组pEG101载体均通过冻融法转化至农杆菌GV3101中。阳性重组农杆菌用液体LB培养基(50μg·mL^-1Kan，25μg·mL^-1Rif)摇菌，28℃，220rpm震荡培养16h。4000rpm，5min收集菌体，用1ml渗透液(10mM MES、10mMMgCl₂、200mM AS)洗涤菌液，重复三次，并调节OD₆₀₀＝0.4，室温条件下静置3h。选取一个月大小的烟草叶片，用去掉针头的1ml注射器在叶片背面进行渗透注射，以pEG104作为对照。接种后的植物置于植物培养箱培养，48h后进行共聚焦显微镜观察。并用1M NaCl溶液处理叶盘10min后，用共聚焦观察质壁分离后荧光情况。

1.2.6本发明的效应蛋白SmCSEP3诱发烟草叶片ROS迸发分析。

农杆菌介导的烟草瞬时转化本实验中所有构建的重组PVX载体均通过冻融法转化至农杆菌GV3101中。阳性重组农杆菌用液体LB培养基(50μg·mL^-1Kan，25μg·mL^-1Rif)摇菌，28℃，220rpm震荡培养16h。4000rpm，5min收集菌体，用1ml渗透液(10mM MES、10mMMgCl₂、200mM AS)洗涤菌液，重复三次，并调节OD₆₀₀＝0.4，室温条件下静置3h。选取一个月大小的烟草叶片，用去掉针头的1ml注射器在叶片背面进行渗透注射，以PVX-GFP作为阴性对照，PVX-INF1作为阳性对照。接种后的植物置于植物培养箱培养。48h后采集烟草叶盘(1cm²)于96孔板中，用200μl无菌水保持过夜以消除物理损伤引起的ROS。叶子用含有37.5μg/ml鲁米诺和25μg/ml辣根过氧化物酶溶液处理，在562nm下使用多扫描光谱测试荧光。

1.2.7本发明的效应蛋白SmCSEP3诱发烟草叶片胼胝质沉积分析。

农杆菌介导的烟草瞬时转化本实验中所有构建的重组PVX载体均通过冻融法转化至农杆菌GV3101中。阳性重组农杆菌用液体LB培养基(50μg·mL^-1Kan，25μg·mL^-1Rif)摇菌，28℃，220rpm震荡培养16h。4000rpm，5min收集菌体，用1ml渗透液(10mM MES、10mMMgCl₂、200mM AS)洗涤菌液，重复三次，并调节OD₆₀₀＝0.4，室温条件下静置3h。选取一个月大小的烟草叶片，用去掉针头的1ml注射器在叶片背面进行渗透注射，以PVX-GFP作为阴性对照，PVX-INF1作为阳性对照。接种后的植物置于植物培养箱培养。48h后采集烟草叶盘(1cm²)，将其用酒精脱色后在pH 9.5的含0.1％(W/V，g/100ml)苯胺蓝的150mM磷酸缓冲液中暗处理2h。染色结束后在荧光显微镜下拍照观察胼胝质的沉积情况。

1.2.8本发明的效应蛋白SmCSEP3提高烟草防御反应相关基因表达水平。

农杆菌介导的烟草瞬时转化本实验中所有构建的重组PVX载体均通过冻融法转化至农杆菌GV3101中。阳性重组农杆菌用液体LB培养基(50μg·mL^-1Kan，25μg·mL^-1Rif)摇菌，28℃，220rpm震荡培养16h。4000rpm，5min收集菌体，用1ml渗透液(10mM MES、10mMMgCl₂、200mM AS)洗涤菌液，重复三次，并调节OD₆₀₀＝0.4，室温条件下静置3h。选取一个月大小的烟草叶片，用去掉针头的1ml注射器在叶片背面进行渗透注射，以PVX-GFP作为阴性对照。接种后的植物置于植物培养箱培养。24h后用TRNzol(天根)提取烟草叶片总RNA，反转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测烟草相关防卫基因(超敏反应相关基因NbHIN1、NbHSR203J；水杨酸(SA)-、茉莉酸(JA)-或乙烯介导的免疫相关基因NbPR1a、NbPR2、NbPR4和NbERF1；PTI反应相关基因NbCYP71D20、NbPTI5、Nb Acre31、NbWRKY7和NbWRKY8)的相对表达量，以NbEF1α作为内参基因。三次重复。所采用的引物为qNbPR1a引物对、qNbPR2引物对、qNbERF1引物对、qNbHIN1引物对、qNbPR4引物对、qNbPTI5引物对、qNbWRKY7引物对、qNbHSR203J引物对、qNbAcre31引物对、qNbWRKY8引物对、qNbCYP71D20引物对和qNbEF1α引物对。各引物对的序列如下所示：

所述qNbPR1a引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列；

所述qNbPR1a引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；

所述qNbPR2引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列；

所述qNbPR2引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列；

所述qNbERF1引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列；

所述qNbERF1引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列；

所述qNbHIN1引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列；

所述qNbHIN1引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列；

所述qNbPR4引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列；

所述qNbPR4引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列；

所述qNbPTI5引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列；

所述qNbPTI5引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列；

所述qNbWRKY7引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列；

所述qNbWRKY7引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列；

所述qNbHSR203J引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列；

所述qNbHSR203J引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列；

所述qNbAcre31引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列；

所述qNbAcre31引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列；

所述qNbWRKY8引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列；

所述qNbWRKY8引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列；

所述qNbCYP71D20引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列；

所述qNbCYP71D20引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；

所述qNbEF1α引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列；

所述qNbEF1α引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列。

1.2.9本发明的效应蛋白SmCSEP3对辣椒疫霉的致病性分析。

农杆菌介导的烟草瞬时转化本实验中所有构建的重组PVX载体均通过冻融法转化至农杆菌GV3101中。阳性重组农杆菌用液体LB培养基(50μg·mL^-1Kan，25μg·mL^-1Rif)摇菌，28℃，220rpm震荡培养16h。4000rpm，5min收集菌体，用1ml渗透液(10mM MES、10mMMgCl₂、200mM AS)洗涤菌液，重复三次，并调节OD₆₀₀＝0.4，室温条件下静置3h。选取一个月大小的烟草叶片，用去掉针头的1ml注射器在叶片背面进行渗透注射，以PVX-GFP作为阴性对照。接种后的植物置于植物培养箱培养。24h后接种辣椒疫霉，在接种2-3d观察病斑面积大小。

2.结果与分析

2.1转录组分析

从壳针孢菌S.musiva SO2202全基因组中预测出142个效应蛋白，用S.musivaMN14菌株接种侵染3种不同的杨树品种后，分别测定了这142个候选效应子在不同侵染阶段(0h、24h、72h)的转录水平，选出在侵染阶段高表达的28个候选效应子。结果从中挑选了在侵染阶段高表达的Top 28个效应子基因(图1)。

2.2SmCSEP3蛋白可以诱导烟草细胞坏死。

将重组质粒通过冻融法转化进农杆菌GV3101中，运用渗透注射的方法，使重组质粒在烟草叶片中瞬时表达。INF1是致病疫霉的PAMP，可以在本氏烟草叶片上诱导细胞坏死，从而引发植物的PTI免疫反应，因而作为阳性对照。以GFP和渗透液为阴性对照。5d后，注射SmCSEP3的叶片出现坏死，与阳性对照结果一致(图2A)。并用酒精对烟草叶片进行脱色，以更直观的显示病斑(图2B)通过Western blot实验(图2C)验证了蛋白的表达情况，以HA标签蛋白作为抗体，总蛋白用考马斯亮蓝染色显示。

2.3SmCSEP3的信号肽具有分泌功能。

质粒pSUC2含有色氨酸合成基因，及一个缺失信号肽和起始密码子ATG的蔗糖转化酶基因(SUC2)。所以含有pSUC2质粒的酵母菌株YTK12可以在CMD-W培养基上生长，但是不能在以棉籽糖为碳源的YPRAA培养基上生长。当pSUC2载体的蔗糖转化酶基因中插入含有起始密码子ATG的信号肽，才能在YPRAA培养基上生长。Avr1b是大豆疫霉中的效应蛋白，其信号肽具有分泌活性，作为本实验的阳性对照；pSUC2和YTK12作为本实验的阴性对照。结果显示，pSUC2，pSUC2-Avr1b SP，pSUC2-SmCSEP3 SP转化的酵母菌株均可以在CMD-W培养基上生长，说明重组质粒已经转化进入酵母中。但是只有pSUC2-Avr1bSP，pSUC2-SmCSEP3 SP转化的酵母菌株可以在YPRAA培养基上生长，说明SmCSEP3的信号肽具有分泌活性，TTC染色进一步证明了实验结果(如图3)。

2.4SmCSEP3是一个胞外效应因子。

将重组质粒通过冻融法转化进农杆菌GV3101中，运用渗透注射的方法，使重组质粒在烟草叶片中瞬时表达。48h后共聚焦观察。正常叶片(图4A)和质壁分离(图4B)的亚细胞定位结果显示SmCSEP3定位于植物外质体。

2.5SmCSEP3作为PAMP诱导烟草PTI免疫反应。

包括ROS的迸发(图5)；胼胝质的积累(图6)；植物免疫相关通路如水杨酸通路、茉莉酸通路和乙烯介导的免疫相关基因的上调表达(图7)。

如图5所示，利用烟草瞬时表达系统，将重组农杆菌在烟草叶片背面渗透注射，每个注射点做好标记。48h后采集烟草叶盘(1cm²)于96孔板中，用200μl无菌水保持过夜以消除物理损伤引起的ROS。叶子用含有37.5μg/ml鲁米诺和25μg/ml辣根过氧化物酶处理，在562nm下使用多扫描光谱测试荧光。

如图6所示，利用烟草瞬时表达系统，将重组农杆菌在烟草叶片背面渗透注射，每个注射点做好标记。48h后采集烟草叶盘(1cm²)，将其用酒精脱色后在pH 9.5的含0.1％(W/V)苯胺蓝的150mM磷酸缓冲液中暗处理2h。。染色结束后在荧光显微镜下拍照观察胼胝质的沉积情况。

如图7所示，利用烟草瞬时表达系统，将重组农杆菌在烟草叶片背面渗透注射，每个注射点做好标记。48h后收集烟草叶片，提取总RNA，反转录后进行qRT-PCR，检测烟草相关防卫基因(超敏反应相关基因NbHIN1、NbHSR203J；水杨酸(SA)—、茉莉酸(JA)—或乙烯介导的免疫相关基因NbPR1a、NbPR2、NbPR4和NbERF1；PTI反应相关基因NbCYP71D20、NbPTI5、NbAcre31、NbWRKY7和NbWRKY8)的表达情况。

2.6SmCSEP3增强烟草对辣椒疫霉的抗病性(图8)。

如图8所示，利用烟草瞬时表达系统，将重组农杆菌在烟草叶片背面渗透注射，每个注射点做好标记。注射24h后叶片接种辣椒疫霉。在接种2d和3d进行发病症状观察，照相记录结果。与阴性对照相比，过表达SmCSEP3的烟草在接种辣椒疫霉后出现病斑显著性减小，这些结果证实了过表达SmCSEP3提高烟草对辣椒疫霉的抗病性。

序列表

南京林业大学

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Claims

1. 一种杨树壳针孢菌效应蛋白SmCSEP3的编码基因，其特征在于，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 一种杨树壳针孢菌效应蛋白SmCSEP3，其特征在于，该效应蛋白SmCSEP3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述杨树壳针孢菌效应蛋白SmCSEP3编码基因的生物材料，其特征在于，该生物材料为表达盒、重组载体或重组菌。

4.权利要求1中所述的杨树壳针孢菌效应蛋白SmCSEP3的编码基因，权利要求2中所述的杨树壳针孢菌效应蛋白SmCSEP3，或权利要求3中所述的生物材料在下述（1）~（4）中至少一种中的应用：

（1）诱导烟草细胞坏死；

（2）诱发烟草自身免疫；

（3）提高烟草对辣椒疫霉的抗病性；

（4）制备提高烟草对辣椒疫霉抗病性的产品。

5.一种提高烟草对辣椒疫霉抗病性的方法，其特征在于，在目标烟草中过表达权利要求1所述的杨树壳针孢菌效应蛋白SmCSEP3的编码基因。