CN112779268A - 大豆GmCRF4a基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了大豆GmCRF4a基因在调控植物高度和生育期中的应用。所述大豆GmCRF4a基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。研究发现低表达GmCRF4a基因的转基因植株相比野生型植株的株高变矮，生育期缩短；超表达GmCRF4a基因的转基因植株相比野生型植株的株高变高，生育期延长，说明GmCRF4a基因参与调控植物高度、生育期长短的生物学过程。本发明提供了大豆GmCRF4a基因在调控植物高度、生育期中的用途，该基因在育种技术领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程、生物技术领域，尤其涉及大豆GmCRF4a(Cytokininresponse factor 4)基因及其应用。
背景技术
大豆在我国食物生产和消费系统中扮演了非常重要的角色。大豆一方面为中华民族的繁衍、发展和昌盛，提供了优质的植物蛋白和食用油；另一方面也对我国传统农业的精耕细作和可持续发展提供了良好的地力基础。然而最近几年随着国外生物技术的发展和转基因大豆的研究，我国的大豆市场遭遇剧烈波动，进口大豆的数量迅速增加，对外依存度超过80％。因此提高国内大豆产量迫在眉睫。
株高是作物的外在表现，当植株株高变高时，会增加植株有效分枝数，单株荚数，可有效提高单株产量；当植株株高变低时，会减少植株有效分枝数，单株荚数，同时也会增加作物的抗倒伏性，并可通过与玉米等作物的间套作来增加大豆的种植面积，进而提高大豆的总产量。
Glyma.14G205600基因是一个转录因子，属于Ethylene Response Factor/Apetala2基因家族，分析发现大豆中AP2基因家族一共包含大约450到500个成员，本发明基因与拟南芥中Cytokinin response factor 4基因AT4G27950同源，而拟南芥基因AT4G27950在大豆中有多个同源基因，因此为了便于区分，将本发明基因命名为GmCRF4a。CRF4虽然名称中与细胞分裂素有关，但已有的文献报道该基因与细胞分裂素关系不明显，反而参与到低温响应中，当温度变低后，该基因表达量会上调。
根据https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html网站中Williams 82的基因序列，本申请人利用基因克隆的方法克隆到GmCRF4a的基因序列，并对其功能进行研究。最终发现，当 GmCRF4a基因在受体栽培品种天隆一号中过量表达后，植株呈现株高变高、生育期延长等性状；而当GmCRF4a基因在受体栽培品种天隆一号中微量表达后，植株呈现株高变矮、生育期缩短等性状。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大豆GmCRF4a基因以及该基因在调控植株高度、生育期方面的应用。
为了实现本发明目的，首先我们利用Gateway系统，将大豆GmCRF4a基因的cDNA序列克隆到pDONR201入门载体上，通过同源重组技术将cDNA序列连接到pEarley101终载体上，并利用成熟的大豆遗传转化体系技术将目的基因转到受体栽培品种天隆一号中，对获得稳定的表达后代植株进行植株高度、生育期等表型的鉴定。
本发明提供的大豆GmCRF4a基因，其核苷酸序列为如下(1)～(4)中的任意一种：
(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸而形成的具有同等功能的核苷酸序列；
(3)在严格杂交条件下与SEQ ID NO.1杂交的核苷酸序列；
(4)与(1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且具有同等功能的核苷酸序列。
由大豆GmCRF4a基因编码的蛋白，其氨基酸序列为如下(a)或(b)：
(a)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(b)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而形成的具有同等功能的序列。
含有上述的大豆GmCRF4a基因的生物材料均属于本发明的保护范围，所述生物材料为表达载体、细胞系或宿主菌。
本发明还提供了上述的大豆GmCRF4a基因，上述的蛋白或上述的生物材料在调控植物高度中的应用。所述的调控植物高度为增加或减少植物高度。
本发明还提供了上述的大豆GmCRF4a基因，上述的蛋白或上述的生物材料在调控植物生育期中的应用。所述的调控植物生育期为延长或缩短植物生育期。
本发明还提供了上述的大豆GmCRF4a基因，上述的蛋白或上述的生物材料在培育生育期延长和植株变高的转基因植物中的应用。
本发明还提供了上述的大豆GmCRF4a基因，上述的蛋白或上述的生物材料在植物种质资源改良中的应用。
本发明还提供了一种培育生育期延长的转基因植物方法，该方法为在转基因植物细胞中过表达上述的大豆GmCRF4a基因。
本发明还提供了一种培育植株变高的转基因植物的方法，该方法为在转基因植物细胞中过表达上述的大豆GmCRF4a基因。
过量表达上述GmCRF4a基因可通过多种方法实现，如植物病毒载体介导基因过表达的方法，农杆菌介导转化过表达载体，对基因编码框进行优化修改，对该基因启动子进行优化以达到过表达效果等方法。本发明过量表达基因的方法并不限于上述几种方法，只要能过量表达GmCRF4a基因即可。
本发明的GmCRF4a基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：大豆、烟草、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、拟南芥、杨树、草坪草或苜宿等。携带有本发明GmCRF4a基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。
本发明的有益效果：
本发明过表达大豆GmCRF4a基因的植株相比野生型植株高变高、生育期延长，低表达大豆GmCRF4a基因的植株相比野生型植株的株高变矮、生育期缩短，说明GmCRF4a基因参与调控植物高度、生育期长短的生物学过程。本发明提供了大豆GmCRF4a基因在调控植物高度、生育期中的用途，在植物育种技术领域应用前景良好。
附图说明
图1：GmCRF4a低表达和过表达后，转基因植株株高及生育期变化的田间对照图，并对植株株高、生育期天数及GmCRF4a的表达量以柱状图形式表现出来。结果，低表达转基因植株GmCRF4a-LX-1与野生型对照TL1相比，其株高变低、生育期缩短；而过表达转基因植株GmCRF4a-OX-1与野生型对照TL1相比，其株高变高、生育期延长。
图2：GmCRF4a过表达后，转基因植株株高及生育期变化的温室对照图，并对植株株高、生育期天数及GmCRF4a的表达量以柱状图形式表现出来。结果，过表达转基因植株GmCRF4a-OX-2与野生型对照TL1相比，其株高变高、生育期延长。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1大豆GmCRF4a基因过表达载体的构建
1、本发明用于扩增GmCRF4a CDS序列为：
CDS-F：TACAAAAAAGCAGGCTTCATGTCCGTACACGCAAAACTGA
CDS-R：GTACAAGAAAGCTGGGTCGTAAGGCCACGTCATGAACTCG
用于同源重组连接pDONR201入门载体的通用引物为：
P5600-F：GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC
P5600-R：GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC
2、RNA的提取：
对种植于短日照条件下真叶展开的Williams 82进行叶片取样，按常规TRIZOL方法进行RNA提取，使用TRIZOL法步骤为：
准备工作：所用的枪头、离心管等塑料用品均经过去RNA酶处理，镊子、小药匙、小研钵等在酒精中灼烧大约30min，实验中用到的移液枪等其它用品以及实验台都用70％酒精擦拭灭菌。
a)取用液氮冷冻后的植物组织大约100mg于研钵中，加入液氮快速研磨成粉末，整个研磨过程保持组织处于冷冻状态，将粉末转入1.5ml离心管，迅速加入1ml裂解液RZ，用匀浆器将组织彻底打碎。
b)匀浆后的样品室温放置5-10min，保证核酸蛋白复合物完全分离。
c)4℃，12,000rpm离心5min。将上清液转入无RNase的1.5ml离心管中。
d)加入200μl氯仿，剧烈涡旋15s，混匀，室温静置3-5min。
e)4℃，12,000rpm，离心10min，此时样品分为三层：有机相、中间层、水相，RNA 主要存在于水相，体积约为500μl。将水相转移至新的离心管。
f)加入0.5倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，转入吸附柱CR3中，4℃，12,000rpm离心30s，弃废液。
g)向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD，4℃，12,000rpm离心30s，弃废液。
h)向吸附柱CR3中加700μl漂洗液RW，室温静置2min，4℃，12,000rpm离心30s，弃废液。
i)向吸附柱CR3中加700μl漂洗液RW，4℃，12,000rpm离心30s，弃废液。
j)将吸附柱放入收集管中，4℃，12,000rpm，离心2min，去除残留漂洗液，开盖室温放置，充分晾干。
k)将吸附柱CR转入新的无RNAase离心管中，加入35μl RNase-free ddH2O，室温放置2min。4℃，12,000rpm离心2min。该步骤重复一次。
提取好的RNA放于-80℃冰箱中备用。
3、cDNA第一链的合成
采用TaKaRa公司的Prime Script TM 1st cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一链，具体步骤如下：
a)在无RNAase离心管中配置如下比例混合液：
b)将混合液放置在PCR仪上，65℃，5min，进行变性、退火反应，取出后冰上迅速冷却。
c)在上述离心管中继续加入下列反转录反应液：
d)混合并瞬时离心后，在PCR仪上进行反转录反应：42℃，60min；70℃，15min； 4℃，结束反应。
e)反转后的cDNA放置在-20℃储存。
4、首先用CDS-F/CDS-R扩增引物，以反转录产物为模板，进行第一步PCR扩增；紧接着利用第一步扩增的PCR产物为模板，以P5600-F/P5600-R为引物进行第二次PCR扩增。以获得进行BP反应的目的片段。两步骤PCR反应体系如下：
PCR反应体系：
PCR扩增程序：
5、DNA片段胶回收，本试验胶回收采用Axygen公司AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，具体操作步骤如下：
a)在紫外灯下切下含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶，切碎，称重；
b)以1mg作为1μL计算此琼脂糖凝胶块相应的体积；
c)加入3倍琼脂糖凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75℃金属浴加热，每隔1分钟左右混匀一次，至凝胶块完全融化(大约需5分钟)；
d)加入0.5倍BufferDE-A体积的BufferDE-B，混匀；
e)将DNA制备管置于2mL离心管中，吸去上步混合液，转移至DNA制备管中， 12000×g离心1分钟，弃去滤液；
f)将DNA制备管重新置于2mL离心管中，加入500μL Buffer W1，12000×g离心30秒，弃去滤液；
g)将DNA制备管重新置于2mL离心管中，加入700μL Buffer W2(已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇)，12000×g离心30秒，弃去滤液；
h)重复(f)一次；
i)将DNA制备管重新置于2mL离心管中，12000×g离心1分钟，将DNA制备管置于新的1.5mL离心管中，于65℃烘箱10分钟，干燥；
j)向DNA制备管中央滴加25μL ddH2O，室温静置1分钟，12000×g离心1分钟，将所得滤液重新滴加至原先的DNA制备管中央，12000×g离心2分钟；
k)将所得DNA溶液通过Nano测量浓度和琼脂糖凝胶电泳检测质量，合格品置于4℃或-20℃保存，用于后续试验。
6、载体连接
BP反应体系：
按上述反应体系在冰上配置反应液，混匀，进行PCR反应
反应程序
25℃过夜
LR反应体系：
按上述反应体系在冰上配置反应液，混匀，进行PCR反应
反应程序
25℃2h
7、原核转化与表达
对连接产物进行大肠杆菌转化实验。
a)取50μL感受态加入2.5μL酶连接产物，混合均匀后冰浴30min；
b)热击，42℃水浴90s；
c)冰浴2min；
d)加入无抗LB液体培养基1ml，37℃200rpm培养1h；
e)12000rpm离心1min,弃适量上清，将剩余溶液混合均匀后涂在含有卡那青霉素的固体平板上；
f)涂好的固体板，37℃静止培养，过夜。
8、大肠杆菌阳性克隆检测
a)用牙签挑取大肠杆菌单克隆菌斑到1.5mL离心管中，37℃200rpm培养8-10小时；并将牙签放于PCR管中，用于PCR检测。
b)并将检测正确的PCR产物对应的菌液送往北京华大测序公司进行测序。
测序得到大豆GmCRF4a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
9、质粒的提取
对测序正确的菌液进行质粒的提取，质粒的提取参照天根质粒小提中量试剂盒说明书进行提取。
a)取5-6mL过夜培养菌液，离心，12000rpm，10min，弃上清，留沉淀。
b)加入250μL Buffer S1，重悬菌体(Buffer S1在使用之前加入RNaseA)，将菌体加入到1.5mL离心管中。
c)加入250μL Buffer S2，轻轻上下颠倒混匀6-7次，使粘稠溶液变得清亮。
d)加入350μL Buffer S3，同时温和下上颠倒混匀6-7次，此时出现白色沉淀物，室温静置5min左右，12000rpm离心10min。
e)转移上清液到离心吸附柱CP4管中，室温静置离心，12,000rpm，1min，弃废液。
f)加入700μL Buffer WB，离心12000rpm，1min，弃废液(重复一次)；
g)打开吸附柱盖，12000rpm离心1-2min，室温晾干残留液体将CP4放入一新的离心管中，向CP4吸附柱中加入50μL在65℃提前预热的ddH2O，离心12000rpm，1min(重复一次)
10、质粒转化农杆菌
1)农杆菌感受态制备
a)挑取活化过的根癌农杆菌K599单菌落，接种于5ml无抗LB液体培养基中，28℃,200rpm震荡培养过夜；
b)将2ml过夜培养的菌液加到50ml含无抗的LB液体培养基中，28℃,200rpm震荡3-4小时，至OD600＝0.8左右；
c)4000rpm离心5分钟，去上清；
d)加入50ml 10％甘油悬浮菌体，
e)4000rpm离心5分钟，去上清；
f)加入25mL10％甘油重悬浮菌体，4000rpm离心5分钟；
g)重复f一次，去上清，加入2ml10％甘油悬浮，分装于1.5ml的离心管中(100μl/管)。
h)立即放于液氮中进行速冻，放于-80℃备用。
2)农杆菌感受态的电转化
a)取2μl质粒加到100μl K599感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟(可忽略时间)；
b)把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化；
c)马上加入lml新鲜的无抗LB液体培养基，28℃，200rpm轻摇4小时；
d)将培养好的菌液12000rpm离心10s弃部分上清，将剩余上清与菌体混匀涂于含卡那青霉素的LB固体培养基平板上，28℃暗培养2天。
3)农杆菌阳性检测
a)挑取长好的农杆菌单菌落于1.5ml离心管中，离心管中加有卡那青霉素的LB培养基中，过夜培养。
b)同时进行PCR检测，PCR检测正确的菌液加入等体积的50％甘油,混匀,放入-80℃保存。
实施例2转基因大豆植株的获得
将实施例1含有GmCRF4a基因的农杆菌进行大豆遗传转化。
大豆遗传转化步骤为：
1)种子消毒：挑取饱满、健康的大豆种子。利用4ml浓盐酸和100ml花王消毒水(Bleach)反应出来的氯气对豆子进行灭菌。灭菌时间为16-18h，之后置于超菌工作台中吹净氯气。
2)催芽和摇菌：晚上用无菌水浸泡种子用于催芽并对用于转化的农杆菌进行摇菌。
3)切豆子：第二天早上对泡好的豆子进行切除，去掉部分胚芽，轻轻的在生长点处划 3-5下，将切好的豆瓣置于浸有灭菌水的三角瓶中。当农杆菌的OD值达到0.6-0.8时进行离心(4000rpm，10min)，利用液体共培培养基对离心底物进行重悬，重悬后的菌液体积为30-40ml。倒掉三角瓶中灭菌水并倒入重悬后的菌液浸泡30min。
4)共培培养：将浸泡好的豆瓣均匀的铺在含有灭过菌的滤纸的固体共培培养基上，封上胶带，置于26度黑暗培养箱中培养3天。
5)诱导培养：切掉共培后已经长长的胚芽，只保留3-4mm，并利用无菌水和加有激素的液体诱导培养基对切好的外植体进行清洗，洗去残留的农杆菌。将外植体斜插入固体诱导培养基中，培养30天，期间需更换2次诱导培养基。
6)伸长培养：将长出丛生芽的外植体切掉豆瓣(此时豆瓣已变黄，营养已基本耗浸)，刮掉黑色表面，置于伸长培养基中。每10-15天进行一次培养基更换。
7)生根培养：将长长的幼苗切掉，插到生根培养基中进行生根培养。一般需30天左右。
8)移栽：将生根的转化植株置于带有土的盆中，给予水或营养液。盖上盖子放于温室中培养。一周后去掉盖子。
实施例3转基因阳性株系的鉴定
为了确定实施例2获得的转基因阳性植株，取少量鲜嫩的叶片，提取RNA反转录为cDNA进行目的基因GmCRF4a表达量的检测。
分别对实施例2获得的表达植株GmCRF4a-LX-1、GmCRF4a-OX-1、GmCRF4a-OX-2进行了检测。表达量结果见图1和图2。其中GmCRF4a-LX-1为低表达的转基因植株， GmCRF4a-OX-1、GmCRF4a-OX-2为高表达的转基因植株。
实施例4转基因大豆表型鉴定
对实施例2获得的转基因大豆表达植株GmCRF4a-LX-1、GmCRF4a-OX-1、GmCRF4a-OX-2进行表型鉴定，图1为大田表型，图2为温室表型。结果说明，过表达GmCRF4a基因的转基因大豆与野生型大豆相比，具有株高变高、生育期延长的表型；低表达GmCRF4a基因的转基因大豆与野生型大豆相比，具有株高变矮、生育期缩短的表型。
本发明首次证明大豆GmCRF4a基因是一个调控植物高度和生育期的基因，运用分子生物学及基因工程技术的验证，说明了该基因的表达能够使植株株高变高或变矮，生育期延长或缩短。这就为培育高矮品种的作物提供了一个完善的思路。对作物品种的改良，具有很好的实践意义。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQ ID NO.1
ATGTCCGTACACGCAAAACTGAAGCACCACCCCATGAACCTAGCATCCCCAAGTTCCC ATTTTGAGGACGACCCACCATGCAAAACCAAGACCAAAACCCAAAGGAGGCTCCTTCG GATCATAATCACCGACCATGACGCCACCGATTCTGACTCCTCCGACGAAGAACAACAG CAGCAGCAACAAAAAACAAGAAGAGTGAACAGAGAAATCACCCAAATCAACATGCAA CTTCCTCTATCACATAATAGTTCCTTTTCCCCTTCATCTTCTTATTACTCTTCAGCTTCCACCTCATCGGAACAAAACCTAAAGTGCAAGAGACCCAACAAAAAGCCGCCACCTTCCTC CGCCGAGGCCCGCCGCCGCAACAAGTTCCGCGGCGTCCGGCAGCGGCAGTGGGGACG GTGGGCGGCCGAGATCCGCGACCCCACCCGCCGGAAACGCCTCTGGCTCGGAACCTTC GACACGGCGGAGGAAGCCGCCACGGAGTACGACAGAGCCGCCGTCAAACTCAAGGGC CCCAACGCCGTCACCAACTTCCCCCTCGCGCCGGAGGCTACGGCGCAGTCTCCACCGCT CGCCGCGGACAACCTCAGCTCCGACGGCGGCGCGTCGTACTCGGACCTAGTGGCCTCG CCGACGTCCGTCTTGGCCTACGAGTGCGACTCGACGCCGTTCGACGGTTTCCGTTATCT CGACGTTGACGCGTTCGGGTTCCACATCGACGCGCCGTTAAGTTTGCCGGAAGTTAAC GTTAACGTTGCGCTGACGTGTCATCACGGGAAGAAGCAGGAGGAGGCGTTTGATGAAT TCGATCTGGACGAGTTCATGACGTGGCCTTACTAG
SEQ ID NO.2
MSVHAKLKHHPMNLASPSSHFEDDPPCKTKTKTQRRLLRIIITDHDATDSDSSDEEQQQQQ QKTRRVNREITQINMQLPLSHNSSFSPSSSYYSSASTSSEQNLKCKRPNKKPPPSSAEARRRN KFRGVRQRQWGRWAAEIRDPTRRKRLWLGTFDTAEEAATEYDRAAVKLKGPNAVTNFPL APEATAQSPPLAADNLSSDGGASYSDLVASPTSVLAYECDSTPFDGFRYLDVDAFGFHIDA PLSLPEVNVNVALTCHHGKKQEEAFDEFDLDEFMTWPY。
序列表
<110> 南京农业大学
中国农业科学院作物科学研究所
<120> 大豆GmCRF4a基因及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 849
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max Linn. Merr.)
<400> 1
atgtccgtac acgcaaaact gaagcaccac cccatgaacc tagcatcccc aagttcccat 60
tttgaggacg acccaccatg caaaaccaag accaaaaccc aaaggaggct ccttcggatc 120
ataatcaccg accatgacgc caccgattct gactcctccg acgaagaaca acagcagcag 180
caacaaaaaa caagaagagt gaacagagaa atcacccaaa tcaacatgca acttcctcta 240
tcacataata gttccttttc cccttcatct tcttattact cttcagcttc cacctcatcg 300
gaacaaaacc taaagtgcaa gagacccaac aaaaagccgc caccttcctc cgccgaggcc 360
cgccgccgca acaagttccg cggcgtccgg cagcggcagt ggggacggtg ggcggccgag 420
atccgcgacc ccacccgccg gaaacgcctc tggctcggaa ccttcgacac ggcggaggaa 480
gccgccacgg agtacgacag agccgccgtc aaactcaagg gccccaacgc cgtcaccaac 540
ttccccctcg cgccggaggc tacggcgcag tctccaccgc tcgccgcgga caacctcagc 600
tccgacggcg gcgcgtcgta ctcggaccta gtggcctcgc cgacgtccgt cttggcctac 660
gagtgcgact cgacgccgtt cgacggtttc cgttatctcg acgttgacgc gttcgggttc 720
cacatcgacg cgccgttaag tttgccggaa gttaacgtta acgttgcgct gacgtgtcat 780
cacgggaaga agcaggagga ggcgtttgat gaattcgatc tggacgagtt catgacgtgg 840
ccttactag 849
<210> 2
<211> 282
<212> PRT
<213> 大豆(Glycine max Linn. Merr.)
<400> 2
Met Ser Val His Ala Lys Leu Lys His His Pro Met Asn Leu Ala Ser
1 5 10 15
Pro Ser Ser His Phe Glu Asp Asp Pro Pro Cys Lys Thr Lys Thr Lys
20 25 30
Thr Gln Arg Arg Leu Leu Arg Ile Ile Ile Thr Asp His Asp Ala Thr
35 40 45
Asp Ser Asp Ser Ser Asp Glu Glu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Thr
50 55 60
Arg Arg Val Asn Arg Glu Ile Thr Gln Ile Asn Met Gln Leu Pro Leu
65 70 75 80
Ser His Asn Ser Ser Phe Ser Pro Ser Ser Ser Tyr Tyr Ser Ser Ala
85 90 95
Ser Thr Ser Ser Glu Gln Asn Leu Lys Cys Lys Arg Pro Asn Lys Lys
100 105 110
Pro Pro Pro Ser Ser Ala Glu Ala Arg Arg Arg Asn Lys Phe Arg Gly
115 120 125
Val Arg Gln Arg Gln Trp Gly Arg Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro
130 135 140
Thr Arg Arg Lys Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Glu
145 150 155 160
Ala Ala Thr Glu Tyr Asp Arg Ala Ala Val Lys Leu Lys Gly Pro Asn
165 170 175
Ala Val Thr Asn Phe Pro Leu Ala Pro Glu Ala Thr Ala Gln Ser Pro
180 185 190
Pro Leu Ala Ala Asp Asn Leu Ser Ser Asp Gly Gly Ala Ser Tyr Ser
195 200 205
Asp Leu Val Ala Ser Pro Thr Ser Val Leu Ala Tyr Glu Cys Asp Ser
210 215 220
Thr Pro Phe Asp Gly Phe Arg Tyr Leu Asp Val Asp Ala Phe Gly Phe
225 230 235 240
His Ile Asp Ala Pro Leu Ser Leu Pro Glu Val Asn Val Asn Val Ala
245 250 255
Leu Thr Cys His His Gly Lys Lys Gln Glu Glu Ala Phe Asp Glu Phe
260 265 270
Asp Leu Asp Glu Phe Met Thr Trp Pro Tyr
275 280
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacaaaaaag caggcttcat gtccgtacac gcaaaactga 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtacaagaaa gctgggtcgt aaggccacgt catgaactcg 40
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtggggacaa gtttgtacaa aaaagcaggc ttc 33
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtggggacca ctttgtacaa gaaagctggg tc 32
Claims (10)
1.大豆GmCRF4a基因，其特征在于，该大豆GmCRF4a基因的核苷酸序列为如下(1)～(4)中的任意一种：
(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸而形成的具有同等功能的核苷酸序列；
(3)在严格杂交条件下与SEQ ID NO.1杂交的核苷酸序列；
(4)与(1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且具有同等功能的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的大豆GmCRF4a基因编码的蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列为如下(a)或(b)：
(a)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(b)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而形成的具有同等功能的序列。
3.含有权利要求1所述的大豆GmCRF4a基因的生物材料，所述生物材料为表达载体、细胞系或宿主菌。
4.权利要求1中所述的大豆GmCRF4a基因，权利要求2中所述的蛋白或权利要求3中所述的生物材料在调控植物高度中的应用。
5.权利要求1中所述的大豆GmCRF4a基因，权利要求2中所述的蛋白或权利要求3中所述的生物材料在调控植物生育期中的应用。
6.权利要求1中所述的大豆GmCRF4a基因，权利要求2中所述的蛋白或权利要求3中所述的生物材料在培育生育期延长和植株变高的转基因植物中的应用。
7.权利要求1中所述的大豆GmCRF4a基因，权利要求2中所述的蛋白或权利要求3中所述的生物材料在植物种质资源改良中的应用。
8.一种培育生育期延长的转基因植物方法，其特征在于，在转基因植物细胞中过表达权利要求1所述的大豆GmCRF4a基因。
9.一种培育植株变高的转基因植物的方法，其特征在于，在转基因植物细胞中过表达权利要求1所述的大豆GmCRF4a基因。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述的植物为单子叶植物或双子叶植。
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