CN111171123A - 一种植物免疫激活蛋白PsPII1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植物免疫激活蛋白PsPII1及其应用，属于农作物生物防治技术领域；本发明的发明人从大豆疫霉菌的培养液中发现了一种新的植物免疫激活蛋白并将其命名为PsPII1，该植物免疫激活蛋白PsPII1具有较强的活性，能够诱导植物的抗性和防卫反应，可以应用于农作物的病害防治，可以用于诸如大豆、番茄、草莓和烟草的病害防治，特别是针对大豆根腐病和烟草花叶病的防治。

Description

一种植物免疫激活蛋白PsPII1及其应用

技术领域

本发明涉及一种植物免疫激活蛋白PsPII1及其应用，属于农作物生物防治技术领域。

背景技术

疫霉菌是农业生产的重要威胁。目前已发现、已鉴定的疫霉菌(Phytophthora)有180余种，能危害几乎所有的双子叶植物，引起的病害被称为“植物疫病”，例如，大豆疫霉菌(Phytophthora sojae，也称P.sojae)能引起大豆根腐病，潜育期短且发病快，是大豆生产上的毁灭性病害。据统计，每年疫霉菌导致我国马铃薯、大豆、蔬菜等作物的经济损失超过160亿元。

植物疫病疫霉菌虽然在形态上与真菌类似，但是在分类上隶属于茸鞭生物界卵菌门，许多杀真菌剂对疫霉菌的防治无效(Tyler,2007)。并且，目前，农业生产上对植物疫病的防控存在病菌容易产生抗药性、缺少高效低毒杀菌剂以及作物抗性易丧失等问题，因此，迫切需要开发高效安全的防控植物疫病的措施。

近年来，随着学科的发展以及技术的进步，科学家逐渐解析了植物免疫的相关机制，发现植物在漫长的进化中已经逐步形成完备的免疫系统(Jones and Dangl,2006)。具体来说，在病原菌侵染植物过程中，植物会利用细胞表面的模式识别受体(PatternRecognition Receptors，PRRs)识别病原菌分泌的毒性因子，触发植物自身的基础免疫反应。这些能够激活植物免疫的因子通常被称为植物免疫激发子(Plant Immunity Inducer，PII)，其中很重要的一类是植物免疫激活蛋白。

因此，如果能够应用植物免疫的原理防治农作物的病虫害，就能开发出更高效安全的防控植物疫病的措施，这已经成为植物保护领域的重要发展方向。

大量文献表明，在大豆疫霉菌与植物互作的早期，植物能够识别病原菌分泌的免疫激活蛋白，从而激发植物免疫反应(Wang et al.,2011；Ma et al.,2015)。例如，大豆疫霉中鉴定到一个糖基水解酶GH12的家族成员PsXEG1能够激活植物的免疫反应，且低浓度的PsXEG1便能够诱导植物产生抗性反应；此外，研究人员还成功筛选到了植物用以识别PsXEG1的受体RXEG1，且过表达该受体后的植物同样显示出良好的抗病性(Ma et al.,2015；Wang et al.,2018)。

因此，本领域技术人员希望能够找到并鉴定出大豆疫霉菌分泌的植物免疫激活蛋白，不仅能够揭示大豆疫霉菌与植物互作机理，而且能为开发激活植物免疫的蛋白质生物药物提供有效的资源。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明一方面提供了一种植物免疫激活蛋白PsPII1，其中，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明另一方面提供了上述植物免疫激活蛋白PsPII1在农作物病害防治方面的应用。

优选的，所述农作物为大豆、番茄、草莓和烟草。

优选的，所述应用为植物免疫激活蛋白PsPII1在大豆根腐病防治方面的应用。

优选的，所述应用为植物免疫激活蛋白PsPII1在烟草花叶病防治方面的应用。

本发明还一方面提供了一种农药组合物，其中，所述农药组合物包含上述的植物免疫激活蛋白PsPII1。

优选的，所述农药组合物还包含精甲霜灵或咯菌腈。

本发明还一方面提供了一种农药制剂，其中，所述农药制剂包含上述的植物免疫激活蛋白PsPII1和农药辅料。

优选的，所述植物免疫激活蛋白PsPII1的浓度范围为0.1～10mg/L。

优选的，所述农药制剂还包含精甲霜灵或咯菌腈。

本发明的发明人从大豆疫霉菌的培养液中发现了一种新的植物免疫激活蛋白并将其命名为PsPII1，该植物免疫激活蛋白PsPII1具有较强的活性，能够诱导植物的抗性和防卫反应，可以应用于农作物的病害防治，可以用于诸如大豆、番茄、草莓和烟草的病害防治，特别是针对大豆根腐病和烟草花叶病的防治。

附图说明

图1为实施例3中注射了农杆菌液且培养了三天后的烟草叶片的照片；

图2为实施例5中分别注射了蛋白溶液及其对照且培养一天后的烟草叶片的照片；

图3为实施例7中分别注射了蛋白溶液及其对照且被烟草花叶病毒侵染后的烟草叶片的照片；

图4为实施例8中分别浸泡了蛋白溶液及其对照，再接种禾谷镰刀菌进行培养后的大豆黄化苗的照片。

具体实施方式

以下将结合附图所示的具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。

现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的实施方式；相反，提供这些实施方式使得本发明将全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。

下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到(例如，常规生化试剂商店购买得到的)。本发明实施例所涉及引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。

实施例1

测定大豆疫霉菌培养液中的候选蛋白并进行筛选

本实施例所用大豆疫霉菌菌株(Phytophthora sojae Kaufmann et Gerdemann)购自于美国典型菌种保藏中心ATCC(American Type Culture Collection，www.atcc.org)，菌株编号为

将上述购得的大豆疫霉菌接种于V8培养基平板，25℃培养7天，挑取菌落边缘处接种于200mL的PDB液体培养基(容器为500mL三角瓶)中，25℃、180r/min摇床培养5天，得到大豆疫霉菌的培养液。

上述V8培养基平板的配制方法：将1g CaCO₃加入到100mL V8汁中，在磁力搅拌器上混匀搅拌10min，3000rpm，室温离心5-7min，取上清液与去离子水按1：9的比例稀释配制成10％的V8培养液，加入琼脂粉15g，煮沸10min溶化后分装，121℃高压蒸汽灭菌30min。

PDB液体培养基的配制方法与V8培养基平板的区别仅在于：不加琼脂粉；其余步骤相同，具体不再赘述。

取上述获得的大豆疫霉菌的培养液，在4℃、8000rpm条件下离心30min，收集上清液，用0.22μM的滤膜(Whatman品牌)进一步过滤除杂质。

取50mL滤液(大豆疫霉菌的培养液)送至深圳华大基因公司进行蛋白质组学分析，测定该滤液中含有40个蛋白。基于大豆疫霉菌基因组已经测序完成，发明人将蛋白质组学所得数据(上述40个蛋白的肽段序列)比对大豆疫霉菌蛋白质数据库和基因组数据，确定了滤液中的40个候选蛋白。根据所检测到的蛋白肽段数目多少排序后，选取检测到肽段次数最多的20个蛋白进行后续分析。

分别将20个候选蛋白的基因进行克隆，并构建原核表达载体；将经鉴定的构建成功的原核表达载体进行原核表达，获得蛋白并进行纯化。

发明人分别对这20个候选蛋白进行研究分析，意外地发现其中一个蛋白具有植物免疫激活功能，将其命名为植物免疫激活蛋白PsPII1。该名称中，“Ps”代表大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)，“PII”代表植物免疫激活子(Plant Immunity Inducer，PII)，“1”是发明人给予的编号。

编码植物免疫激活蛋白PsPII1的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；植物免疫激活蛋白PsPII1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

克隆植物免疫激活蛋白PsPII1的编码基因

步骤1)：总RNA提取

以液体培养的大豆疫霉菌的菌丝为材料，总RNA的抽提采用Omega公司RNA提取试剂盒，具体操作按照说明书进行；获得的总RNA用分光度计检测其含量和质量。

步骤2)：反转录生成第一链

取0.7μg上述步骤1)获得的总RNA作为模板，采用Takara公司PrimeScript反转录酶配套试剂盒进行cDNA合成(具体操作参见试剂盒说明书，定容至20μL反应)。获得的反转录产物cDNA作为模板用于随后的基因克隆PCR。

步骤3)：RT-PCR扩增PsPII1编码基因的全长

发明人根据SEQ ID NO.1所示的PsPII1编码基因序列，设计了如下PCR扩增引物序列：

上游引物(如SEQ ID NO.3所示)：

5’-CAGCTAGCATCGATTCCCATGAACACGTACTTCGCTCTC-3’；

下游序列(如SEQ ID NO.4所示)：

5’-AATCTCTAGAGGATCCCCGCAGGCTCCGCCAGGCACCA-3’；

50μL的反应体系，其中5×buffer 10μL，2.5mM dNTPs 4μL，TakaraPrimerSTARTaq酶0.5μL，步骤2)获得的cDNA模板1μL，加水至50μL；PCR扩增程序为98℃预变性3min，98℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸10min。

琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴化乙锭(EB)染色照相，记录结果，并切胶回收PsPII1编码基因的PCR产物(用Agarose Gel DNA Purification Kit(TaKaRa)对电泳条带进行回收)。

切胶回收的PsPII1编码基因的PCR产物，采用CloneExpress II One StepCloning Kit(Vazyme)，并按照说明书操作，连接到SmaI酶切的pGR107::3HA载体(载体购自于BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)上得到pGR107::PsPII1-3HA质粒；将质粒转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂LB(含卡纳50μg/mL)平板，37℃培养16h后，挑取三个阳性克隆，再通过质粒提取试剂盒(Takara)提取质粒，并送至南京金斯瑞公司测序，测序所得序列与SEQ ID NO.1序列(PsPII1编码基因的核苷酸序列)一致，证明该pGR107::PsPII1-3HA质粒是连接正确的质粒。

实施例3

在烟草叶片上瞬时表达PsPII1编码基因

将实施例3获得的pGR107::PsPII1-3HA质粒(经验证正确的)，电击转化到农杆菌GV3101中，涂LB(含卡纳霉素50μg/mL，利福平50μg/mL)平板，28℃培养48h后，挑取阳性克隆，并PCR验证，获取正确克隆(即转染了pGR107::PsPII1-3HA质粒的农杆菌GV3101单菌落)，以下称实施例3克隆。

另外，获取对照克隆——转染了pGR107::GFP-3HA质粒的农杆菌GV3101单菌落。

分别将实施3克隆和对照克隆进行放大培养，具体操作：分别接种到2mL的LB液体培养基中(含卡纳霉素50μg/mL，利福平50μg/mL)于恒温摇床上28℃，200rpm培养过夜至OD₆₀₀为2.0。再分别收集菌液5000g，离心3min收集菌体。用缓冲液(缓冲液组分：10mM 2-[N-morpholino]ethanesμL fonic acid，10mM MgCl₂，200μM乙酰丁香酮，且pH 5.6)悬浮菌体后，再离心收集菌体；如此重复洗2次后；最后用缓冲液稀释菌体，将最终浓度都控制在为OD₆₀₀＝0.3。

将配制好的实施例3克隆的农杆菌液和对照克隆的农杆菌液，分别用1mL去掉针头的注射器注射到烟草叶片中，注射后烟草于温室(21-23℃、14h光照/10h黑暗)培养。

参见图1，图1中的标注“GFP”的结果是注射了对照克隆的农杆菌液且培养三天后的烟草叶照片，标注“PsPII1”的结果是注射了实施例3克隆的农杆菌液且培养三天后的烟草叶照片；

从图1中可以看出，与对照相比，注射了含有pGR107::PsPII1-3HA质粒的农杆菌液的烟草叶片，经培养三天后，烟草叶片出现了明显的过敏性坏死反应。

分别收集注射并培养三天后的烟草叶片进行蛋白累计量的检测。具体操作：将收集的烟草叶片液氮速冻后研磨加入蛋白提取液(组分为：150mM NaCl,50mM Tris-HCl pH7.5,1.0％(v/v)NP-40,1.0％(v/v)protease inhibitor cocktail)混匀至于冰上30min。18000g离心收集上清液80μL加入20μL 5倍蛋白上样缓冲液混合均匀后沸水浴5min。取10μL样品在SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，120V跑胶1.5h。反应结束后将蛋白样品转到PVDF膜上，用5％(g/100ml)PBST牛奶孵育封膜。加入1:5000稀释的HA一抗(Abmart)孵育2h后用PBST洗膜5min三次，随后加入1:10000稀释的鼠抗(LI-COR,irdye 800,926-32210)孵育30min后用PBST洗膜5min三次，扫膜拍照。

从Western blot的检测结果来看，在26KD处检测到GFP条带，在20KD处检测到PsPII1条带，证实瞬时表达系统可以正确表达GFP基因和PsPII1基因。

实施例4

植物免疫激活蛋白PsPII1的原核表达和纯化

(1)原核载体的构建

以上述实施例2的步骤2)获得的反转录产物cDNA作为模板进行PCR。

发明人根据SEQ ID NO.1所示的PsPII1编码基因序列以及载体(参下述的pGEX-4T-2载体)连接序列，设计了如下PCR扩增引物序列：

上游引物(SEQ ID NO.5)：

5’-TCCCCAGGAATTCCCATGAACACGTACTTCGCTCTC-3’

下游引物(SEQ ID NO.6)

5’-CGCTCGAGTCGACCCGCAGGCTCCGCCAGGCACCA-3’；

50μL反应体系，其中5×buffer 10μL，2.5mM dNTPs 4μL,Takara PrimerSTARTaq酶0.5μL，模板cDNA 1μL，加水至50μL；PCR扩增程序为98℃预变性3min，98℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸10min。

琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴化乙锭(EB)染色照相，记录结果，并切胶回收PsPII1编码基因的PCR产物(用Agarose Gel DNA Purification Kit(TaKaRa)对电泳条带进行回收)。

切胶回收的PsPII1编码基因的PCR产物，采用CloneExpress II One StepCloning Kit(Vazyme)，并按照说明书操作，连接到SmaI酶切的pGEX-4T-2载体上得到pGEX-4T-2-PsPII1质粒；将质粒转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂LB(含氨苄50μg/mL)平板，37℃培养16h后，挑取三个阳性克隆，再通过质粒提取试剂盒(Takara)提取质粒，并送至南京金斯瑞公司测序，测序所得序列与SEQ ID NO.1序列(PsPII1编码基因的核苷酸序列)一致，证明该pGEX-4T-2-PsPII1质粒是连接正确的质粒。

经正确的质粒热激转化大肠杆菌Rossetta(DE3)，感受态细胞涂LB(含氨苄50μg/mL)平板，37℃培养16h后，挑取阳性克隆，并PCR验证，获取正确克隆(即转染了pGEX-4T-2-PsPII1质粒的大肠杆菌DE3的单菌落)，以下称实施例5克隆。

(2)蛋白诱导表达

将实施例4克隆的菌株过夜活化，同时取含有pGEX-4T-2空质粒的菌株作为对照。分别取1mL过夜培养液加入到含有50μg/mL氨苄的100mL LB液体培养基中(2％接种量)，37℃，200r/min振荡培养2～3h培养至OD₆₀₀至0.6～0.8。加入诱导剂IPTG(终浓度为1mM)，20℃，220r/min继续振荡培养16h，诱导表达目的蛋白。

将培养液高速离心，收集菌体，再加入缓冲液悬浮菌体；高压破碎菌体后，4℃高速离心，收集上清，得到表达的蛋白液。

取20μL上清液，加入5μL的5×SDS蛋白上样缓冲液，沸水浴中加热10min，13000r/min离心10min，取上清进行SDS-PAGE检测，考马斯亮兰染色。经过SDS-PAGE检测，获得一个分子量约46kD的包含GST的融合表达蛋白(GST-PsPII1)。

(3)原核表达蛋白的纯化

选用GST标签蛋白纯化柱进行亲和层析(使用AKTA Explorer 100蛋白纯化仪)，进行原核表达蛋白的纯化。

首先，清洗缓冲液平衡亲和层析柱；再进样(样品为上述步骤(2)中得到的表达的蛋白液)，流速为1mL/min，至基线平稳后，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰，利用超滤管将洗脱峰的组分进行脱盐处理，随后进行SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯度。

获得纯化后的大小约为46KD的原核表达蛋白(GST-PsPII1)。

实施例5

植物免疫激活蛋白PsPII1在烟草上引起的防卫反应

将实施例4获得的经纯化后的原核表达蛋白(GST-PsPII1)进行浓度测定，并稀释至1μM。利用注射器将稀释后的GST-PsPII1蛋白溶液注射到烟草叶片中，将注射后的烟草于温室(21-23℃、14h光照/10h黑暗)中培养，作为实验组，标注为PsPII1。

对照1(标注为Buffer)：利用注射器将同等量的缓冲溶液注射到烟草叶片中进行温室(相同环境下)培养。

对照2(标注为GST)：利用注射器将同等量同等浓度(1μM)的GST标签蛋白溶液注射到烟草叶片中进行温室(相同环境下)培养。

参见图2，对照1和对照2的烟草叶片无明显症状，而实验组的烟草叶片有明显的过敏性坏死反应出现，这说明，植物免疫激活蛋白PsPII1具有很强的活性，能引起烟草叶片的防卫反应。

实施例6

植物免疫激活蛋白PsPII1诱导烟草叶的抗性相关基因的转录水平显著升高

将实施例4获得的经纯化后的原核表达蛋白(GST-PsPII1)进行浓度测定，并稀释至1μM。

选取生长旺盛的5～6期的烟草中部叶片，用1mL不带针头的注射器，将稀释后的GST-PsPII1蛋白溶液从叶片背面注入不同的叶片中。同时以相同浓度的pGEX-4T-2蛋白(表达空载体蛋白)溶液作为对照。

注射6h后，收集烟草叶样品，进行抗性相关基因转录水平的检测。

烟草的抗性相关基因有：Pia5、Acre31、CYP71D20和WRKY7。

检测的具体操作：提总RNA，反转录生成第一链，反转录产物用水进行10倍稀释，实时荧光定量PCR反应检测上述抗性相关基因的表达水平。

实时荧光定量PCR结果表明：与对照组(注射表达空载体蛋白)相比，经植物免疫激活蛋白PsPII1处理后的烟草叶，其抗性基因Pia5、Acre31、CYP71D20和WRKY7的表达量都出现显著升高。

实施例7

植物免疫激活蛋白PsPII1增强烟草对烟草花叶病毒的抗性

将实施例4获得的经纯化后的原核表达蛋白(GST-PsPII1)进行浓度测定，并稀释至500pM。

选取生长旺盛的5～6期的烟草中部叶片，用1mL不带针头的注射器，将稀释后的GST-PsPII1蛋白溶液从叶片背面注入不同的叶片中。同时以相同浓度的pGEX-4T-2蛋白(表达空载体蛋白)溶液作为对照。各处理20株，重复3次。

诱导24h后，在上述处理的叶片上再注射接种转化有TMV-GFP的农杆菌(添加了GFP标签的TMV(烟草花叶病毒基因)，在紫外灯下可发出绿色荧光)，接种3天后统计侵染点数。

参见图3，对照组(注射表达空载体蛋白)的烟草叶的侵染点密集，相比之下，注射了GST-PsPII1蛋白溶液的烟草叶上只有零星的侵染点，这说明经过植物免疫激活蛋白PsPII1处理的烟草叶对烟草花叶病毒的抗性显著增强。

实施例8

植物免疫激活蛋白PsPII1增强大豆对禾谷镰刀菌的抗性

禾谷镰刀菌属半知菌亚门真菌，不仅能够侵染小麦，玉米等谷类作物，导致严重的小麦赤霉病、玉米茎腐病和穗腐病等，而且能够侵染大豆导致大豆根腐病。

将实施例4获得的经纯化后的原核表达蛋白(GST-PsPII1)进行浓度测定，并稀释至500pM。

实验组(标注为PsPII1)的处理方式：将生长5天的大豆黄化苗浸泡到稀释后的GST-PsPII1蛋白溶液中，25℃培养室中遮光处理12h后，取出大豆黄化苗，再接种禾谷镰刀菌，25℃培养室中遮光保湿培养，2天后进行发病症状观察拍照。

对照1(标注为Buffer)：将生长5天的大豆黄化苗浸泡到同等量的缓冲溶液中，再在相同环境下进行相同方式地培养。

对照2(标注为GST)：将生长5天的大豆黄化苗浸泡到同等量的GST标签蛋白溶液中，再在相同环境下进行相同方式地培养。

每处理10株，重复3次。

参见图4，与对照1和对照2的大豆黄化苗相比，而实验组的大豆黄化苗的病斑长度显著减小，这说明，经植物免疫激活蛋白PsPII1处理后，大豆黄化苗受到禾谷镰刀菌侵染的生物量显著降低，也就是说，对禾谷镰刀菌的抗性显著增强；因此，植物免疫激活蛋白PsPII1可以用来防治大豆根腐病。

实施例9

将实施例4获得的植物免疫激活蛋白PsPII1用去离子水稀释成0.001、0.01、0.1、1和10mg/L的药液；

在温室中播种烟草种子，待烟草出苗后一周，挑选长势一致的烟草苗移栽到含有营养土的盆钵中，每个盆钵中移栽一颗烟草苗。移栽3周后，用不同浓度的植物免疫激活蛋白PsPII1药液喷施烟草，清水喷施作为对照组。各处理10株，重复3次。喷施药剂3天后注射接种转化有TMV-GFP的农杆菌，接种3天后统计TMV侵染的点数，统计结果参见表1。

表1

表1中不同字母表示在p＜0.01水平时的差异显著性。

对照组(清水喷施)的烟草叶的侵染点密集，相比之下，喷施了0.1、1和10mg/LPsPII1蛋白药液的烟草叶上TMV侵染点数显著减少，而0.001和0.01mg/L PsPII1蛋白药液的烟草叶上TMV侵染点数目与清水喷施对照组没有显著差异，这说明0.1～10mg/L植物免疫激活蛋白PsPII1药液处理烟草叶对烟草花叶病毒具有显著的防治效果，防治效果均达到38％以上。

鉴于发明人发现了植物免疫激活蛋白PsPII1及其农作物病害防治方面的功能，本领域技术人员在获知本申请文件的基础之上，可以合理推测出本发明的植物免疫激活蛋白PsPII1可以与农药辅料进行组合来制备农药制剂，例如用于喷施的农药药液制剂。

鉴于发明人发现了植物免疫激活蛋白PsPII1及其农作物病害防治方面的功能，本领域技术人员在获知本申请文件的基础之上，可以合理推测出本发明的植物免疫激活蛋白PsPII1可以与常规的农作物病害防治药物成分进行组合形成新的农药组合物，例如植物免疫激活蛋白PsPII1可以与精甲霜灵或咯菌腈进行组合，其中，植物免疫激活蛋白PsPII1可以有效激活植物免疫系统，增加作物抗性，精甲霜灵能有效防治卵菌类病原，咯菌腈可有效防治真菌病原。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京农业大学

<120> 一种植物免疫激活蛋白PsPII1及其应用

<130> 2020NN-1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 555

<212> DNA

<213> Phytophthora sojae

<400> 1

atgaacacgt acttcgctct cgccgccttc gccgccgctc tcgtcagctc tgtgagcgcc 60

gaggcctgca cgggcacgca gcagcaggct gcgtacctcg gcatgatcgg cctgctcacg 120

ggctcgtcgc tgaatgactg cgcgagcaag tcgggctaca acatgctgta cgcgacggcg 180

ctgcccacgg acacggagat ggtttccatg tgcggcgttc aggagtgtca cgacctgatc 240

gtggcggtgc tcgcgacgaa ccctcccgac tgcgacctga ccattcccac cagcaacgcc 300

gtcatgaacg tgcaccagct cgcgaccaac ttcgaatcgg actgtgacgc cttgacgaac 360

ccgacttccg ctccgactga tgcccctacg tccgctccga ctgatgcccc cacggatgcc 420

cctacttcgg cgcccacgga tgtccccacc tcggccccca cggatgcccc tactgctgcc 480

cccactgatg cccccacctc agcccctacg acggctccga cgactgagcc tgtggtgcct 540

ggcggagcct gctaa 555

<210> 2

<211> 184

<212> PRT

<213> Phytophthora sojae

<400> 2

Met Asn Thr Tyr Phe Ala Leu Ala Ala Phe Ala Ala Ala Leu Val Ser

1 5 10 15

Ser Val Ser Ala Glu Ala Cys Thr Gly Thr Gln Gln Gln Ala Ala Tyr

20 25 30

Leu Gly Met Ile Gly Leu Leu Thr Gly Ser Ser Leu Asn Asp Cys Ala

35 40 45

Ser Lys Ser Gly Tyr Asn Met Leu Tyr Ala Thr Ala Leu Pro Thr Asp

50 55 60

Thr Glu Met Val Ser Met Cys Gly Val Gln Glu Cys His Asp Leu Ile

65 70 75 80

Val Ala Val Leu Ala Thr Asn Pro Pro Asp Cys Asp Leu Thr Ile Pro

85 90 95

Thr Ser Asn Ala Val Met Asn Val His Gln Leu Ala Thr Asn Phe Glu

100 105 110

Ser Asp Cys Asp Ala Leu Thr Asn Pro Thr Ser Ala Pro Thr Asp Ala

115 120 125

Pro Thr Ser Ala Pro Thr Asp Ala Pro Thr Asp Ala Pro Thr Ser Ala

130 135 140

Pro Thr Asp Val Pro Thr Ser Ala Pro Thr Asp Ala Pro Thr Ala Ala

145 150 155 160

Pro Thr Asp Ala Pro Thr Ser Ala Pro Thr Thr Ala Pro Thr Thr Glu

165 170 175

Pro Val Val Pro Gly Gly Ala Cys

180

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial synthesis

<400> 3

cagctagcat cgattcccat gaacacgtac ttcgctctc 39

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial synthesis

<400> 4

aatctctaga ggatccccgc aggctccgcc aggcacca 38

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial synthesis

<400> 5

tccccaggaa ttcccatgaa cacgtacttc gctctc 36

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial synthesis

<400> 6

cgctcgagtc gacccgcagg ctccgccagg cacca 35

Claims (10)

1.一种植物免疫激活蛋白PsPII1，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的植物免疫激活蛋白PsPII1在农作物病害防治方面的应用。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于：所述农作物为大豆、番茄、草莓和烟草。

4.如权利要3所述应用，其特征在于：所述应用为植物免疫激活蛋白PsPII1在大豆根腐病防治方面的应用。

5.如权利要求3所述应用，其特征在于：所述应用为植物免疫激活蛋白PsPII1在烟草花叶病防治方面的应用。

6.一种农药组合物，其特征在于：所述农药组合物包含如权利要求1所述的植物免疫激活蛋白PsPII1。

7.如权利要求6所述农药组合物，其特征在于：所述农药组合物还包含精甲霜灵或咯菌腈。

8.一种农药制剂，其特征在于：所述农药制剂包含如权利要求1所述的植物免疫激活蛋白PsPII1和农药辅料。

9.如权利要求8所述的农药制剂，其特征在于：所述植物免疫激活蛋白PsPII1的浓度范围为0.1～10mg/L。

10.如权利要求9所述的农药制剂，其特征在于：所述农药制剂还包含精甲霜灵或咯菌腈。

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