CN1687420A

CN1687420A - 一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的基因hrpNEccs及其表达产物HarpinEccs蛋白质

Info

Publication number: CN1687420A
Application number: CN 200510020663
Authority: CN
Inventors: 吴伯骥; 汤承; 崔亚亚
Original assignee: Chengdu Pairun Boilogical Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Wu Boji
Priority date: 2005-04-05
Filing date: 2005-04-05
Publication date: 2005-10-26

Abstract

本发明公开了一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的基因hrpN_Eccs及其表达产物Harpin_Eccs蛋白质，hrpN_Eccs基因来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)白菜软腐菌变种CSDS001菌株，具有以下属性：(1)编码区共计有1071个核甘酸；(2)富含甘氨酸密码子，缺少半胱氨酸密码子；(3)与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌褐腐致病菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)Ecc71和Ecc1菌株的hrpN_Ecc基因分别享有93％和92％的同源性；(4)与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌黑腐致病菌(Erwinia carotovora subsp.atrose pitica)SCR11043和SCR11039菌株的hrpN_Eccs基因分别享有89％和88％的同源性。该基因表达产物Harpin_Eccs蛋白具有多种功能活性，能诱导植物产生抗病性、驱虫性和抗逆性，并促进植物生长发育和提高产量。

Description

一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的基因hrpNEccs及其表达产物HarpinEccs蛋白质

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，特别是涉及一种胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)白菜软腐菌变种CSDS001菌株hrpN_Eccs基因以及此基因通过生物技术方法提高植物多功能活性和广谱抗性并改良植物品质的应用。

背景技术

植物在长期的自然选择和进化过程中，逐渐形成了响应各种环境胁迫影响的遗传因子。植物病原物就是影响植物生长发育的重要环境因子之一。研究表明，植物与病原物之间的相互作用受双方基因型的组合调控。通常，在寄主植物抗病-感病等位基因与病原物无毒-毒性基因的相互作用中，寄主植物抗病基因和病原物无毒基因均表现为显性。在自然界中，植物抗病表型是普遍的，而感病表型仅在特定情况下发生。一种病原物所能侵染并定殖的植物总是少数，多数植物对该病原物是非寄主性的，并对其侵染表现出抗性。

现代分子植物病理学揭示，植物病原细菌既有其致病性，也有诱导植物产生抗病性和促进生长的能力，而决定这种能力的基因是植物病原细菌的hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因簇。hrp基因决定着植物病原细菌在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitive response onnon-host plants，HR)的能力和在寄主植物上的基本寄生性或致病性(parasitism or pathogenicity on host plants)。HR是植物一种局部的、快速的细胞编程死亡形式，是植物主动抗性的结果，其抗性作用不仅表现在对病原细菌侵染扩展的限制，而且能进一步诱导植物体内产生类似免疫机制的系统获得性抗性反应。

20世纪90年代初，韦忠民等(Wei et al.1992)首先从E.amylovora的e.coliDH5α表达克隆中分离纯化出一种由hrpN_Ea基因编码的、能激发烟草过敏反应的蛋白，定名为Harpin_Ea(44kda)。以后有人又相继从E.carotovora subspcarotovora、E.chrysanthemi、P.s.syringae、P.s.pv.glycinea、、P.s.tomato、R.solanacearum中克隆到编码Harpin类蛋白的基因，并成功表达了这些蛋白，如Harpin_Ecc，36kda，Mukherjee A.1997；Harpin_Ech，36kda，Bauer D.W.1995；Harpin_pss，34.7kda，Preston G.1995；Harpin_Psg，35.3kda，Preston G.1995；Harpin_Pst，36.5kda，Preston G.1995；Harpin_Xoo，15.3kda，闻伟刚2001；HarpinX_ooc，15.6kda，闻伟刚2001等。

迄今为止，所有这些Harpin类蛋白差不多都具有以下分子特征：(1)亲水性；(2)对热稳定，100℃处理10分钟不会失活；(3)对蛋白酶K和紫外线敏感；(4)富含甘氨酸而缺少半胱氨酸；(5)水溶性酸性蛋白；(6)无四级结构。

最近的研究表明，Harpin类蛋白可能在植物的信号通路中起着重要作用。研究人员用Harpin处理拟南芥，发现拟南芥中Cl、Ca、K、H、Cu、Zn离子通道以及各种氧化酶被激活，这些氧化酶包括ACC合成酶、抗坏血酸氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、Cu分子伴侣前体等等。现在通常认为，植物细胞壁中广泛存在Harpin蛋白的受体，即Harpin结合蛋白(Harpin-binding proteins，HrBP)，Harpin可以通过与这些受体蛋白HrBP结合激活植物中的多条信号通路。这些信号通路大致可以分为以下三类：(1)与植物抗病和驱虫相关的信号通路的激活，包括过敏反应与细胞死亡、离子交换通道、水杨酸途径、茉莉酸途径、苯丙氨酸解氨酶介导的途径以及其它一些抗性基因介导的途径；(2)与促进植物生长相关的信号通路的激活，包括一般的生长调节因子、胚轴延伸转录因子、生长转录因子、乙烯反应元件结合蛋白系以及蔗糖合成酶和其他胚胎形成酶等；(3)与植物抗逆相关的信号通路的激活，包括热休克蛋白、COR基因和耐盐锌蛋白等。另外可能还存在一条比较特殊的不依赖于NPRl介导的植物对细菌抗性的信号通路。

最近的研究表明，Harpin类蛋白可能在植物的信号通路中起着重要作用。研究人员用Harpin处理拟南芥，发现拟南芥中Cl、Ca、K、H、Cu、Zn离子通道以及各种氧化酶被激活，这些氧化酶包括ACC合成酶、抗坏血酸氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、Cu分子伴侣前体等等。现在通常认为，植物细胞壁中广泛存在Harpin蛋白的受体，即Harpin结合蛋白(Harpin-binding proteins，HrBP)，Harpin可以通过与这些受体蛋白HrBP结合激活植物中的多条信号通路。这些信号通路大致可以分为以下三类：(1)与植物抗病和驱虫相关的信号通路的激活，包括过敏反应与细胞死亡、离子交换通道、水杨酸途径、茉莉酸途径、苯丙氨酸解氨酶介导的途径以及其它一些抗性基因介导的途径；(2)与促进植物生长相关的信号通路的激活，包括一般的生长调节因子、胚轴延伸转录因子、生长转录因子、乙烯反应元件结合蛋白系以及蔗糖合成酶和其他胚胎形成酶等；(3)与植物抗逆相关的信号通路的激活，包括热休克蛋白、COR基因和耐盐锌蛋白等。另外可能还存在一条比较特殊的不依赖于NPR1介导的植物对细菌抗性的信号通路。更有趣的是，Harpin_Ea来自梨火疫病的病原菌E.amylovora，然而在转hrpN_Ea基因的梨上，Harpin_Ea也表现出非常强的抗病性，包括梨火疫病本身。

Harpin蛋白虽然来源于病原菌，但作为一类非特异性的激发蛋白因子，却能引起非寄主植物发生过敏反应，并诱导其抗病性、驱虫性和抗逆性的增加，以及促进生长、提高产量等。

发明内容

一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的基因hrpN_Eccs及其表达产物Harpin_Eccs蛋白质，基因来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovorasubsp.carotovora)白菜软腐菌变种CSDS001菌株，该基因表达产物Harpin_Eccs蛋白具有多种功能活性，能诱导植物产生抗病性、驱虫性和抗逆性，并促进植物生长发育和提高产量；hrpN_Eccs基因的核甘酸序列特征(5′→3′)为：

1 atgcttaatt ctcttggtgg cggagcttct ctgcaaatca cgatcaaagc gggtggtaac

61 ggcggtttat ttccatctca gtcttcacaa aatggcggat cgccatcgca gtcggcgttt

121 ggtggccagc gtagcaacat cgcagaacag ctgtccgata tcatgacgac tatgatgttt

181 atgggcagca tgatgggcgg cggcatgggc ggtgggctcg gtggtttagg cagtagcctg

241 ggcggactcg gtggtggttt gctgggtggt ggcttgggtg gcggtctcgg cagtagcctt

301 ggtagtggac tgggcagtgc gctcggcggc ggattaagcg gggtgctggg tgctggcatg

361 aatgccatga atccatcggc catgatgggt agcctgctgt ttagcgcgct ggaagatctg

421 ctgggcggtg gcatgtcgca gcagcagggt gggcttttcg gcaacaaaca gccgtcgtcg

481 ccggaaattt ctgcctatac ccaaggcgtt aacgatgcgc tgtccgcaat tctgggcaac

541 ggcctgagcc agacgaaagg gcaaacgtca ccgttgcaac tgggtaataa cggtctgcaa

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721 tacttcgtgg ataaagaaga tcgggcgatg gcgaaagaaa ttggtcagtt tatggatcaa

781 tatcctgaag tcttcggcaa ggcagaatac cagaaagata actggcagac ggcgaaacag

841 gaggataaat cctgggctaa agcgctgagc aagccggatg acgacggcat gactaagggc

901 agcatggata aattcatgaa ggcggtcggc atgatcaaga gtgcgatagc gggtgatact

961 ggcaacacta acctgagcgc tcgtggcaac ggcggcgcat ctctgggcat tgatgcagcg

1021 atgatcggcg accgtatcgt caatatgggg ttgcagaagc tctccagcta a

hrpN_Eccs基因(基因注册号：bankit698770 AY939927)具有以下属性：(1)编码区共计有1071个核甘酸；(2)富含甘氨酸密码子，缺少半胱氨酸密码子；(3)与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌褐腐致病菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)Ecc71和Eccl菌株的hrpN_Ecc基因分别享有93％和92％的同源性；(4)与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌黑腐致病菌(Erwinia carotovora subsp.atrosepitica)SCR11043和SCR11039菌株的hrpN_Ecc基因分别享有89％和88％的同源性。hrpN_Eccs基因可作为基因资源，用于农业生物技术育种、转基因植物和防治病虫害、调节植物生长发育以及与其它有益基因包括hrpN_Ecc、hrpN_Ea、hrpN_Ech等重组构建具有商业价值或潜在商业价值的遗传重组体。

本发明的编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的hrp_Eccs基因来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(E.carotovora subsp carotovora)白菜软腐菌变种CSDS001菌株。其表达产物Harpin_Eccs蛋白(35.58kda)已证明也具有上述Harpin类蛋白的分子属性和生物活性。由于这类Harpin蛋白在增强植物抗病、驱虫、抗逆以及促进生长和提高产量方面的良好表现，加之其对人、畜无毒性，不引起病虫害的抗药性，不诱发植物遗传结构(基因组DNA)的改变，在环境中容易很快分解、没有任何残留的无公害性，可望成为未来逐步替代高毒、高残留化学农药和有公害的化学调节剂的优良环保型生物产品的首选。目前正在就其对各种作物、蔬菜、水果、花卉以及各种经济植物包括烟草、茶叶等数十种植物的抗病驱虫和促长增产效果进行广泛的试验和品比。已有试验结果显示，Harpin_Eccs蛋白对黄瓜、西红柿、土豆、辣椒、烟草、玉米、草莓等的抗病驱虫和促长增产效果明显，同时对提高某些植物如烟草、茶叶的品质亦有很好的效果，而且在同类Harpin产品中对比效果也很显著；如果对Harpin_Eccs蛋白进行特殊的络合处理(专利申请编号：031350518)，其作用效果会更明显，持续时间更长，更稳定，作用谱更广。

本发明关于一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的基因hrpN_Eccs及其表达产物Harpin_Eccs蛋白质的系列特征，将按以下内容进行具体表述：

1、软腐细菌的分离该细菌在分类上属于胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwiniacarotovora subsp carotovora)白菜(Chinese cabbage)软腐菌(soft-rottingbacteria)变种，胡萝卜、白菜、芹菜都是其寄主植物。白菜软腐病多在白菜莲座末期开始发病。病株首先在短缩茎(俗称“葫芦”)处出现水浸状微黄色病斑，开始外观症状不明显，但随病情发展，白天植株外部叶片开始萎焉下垂，日落后可以恢复正常，发病严重时，叶球基部“葫芦”腐烂，呈褐色，散发出恶臭气味，叶球脱落。病菌有时也能从叶柄基部或叶球顶部伤口侵入，引起单个叶片或叶球自上而下腐烂。白菜带菌储藏期间，病情仍可发展，引起腐烂。

本菌株采自四川什邡国家无公害蔬菜生产基地。取1克被软腐菌(soft-rotting bacteria)严重感染的白菜(Chinese cabbage)组织置于1毫升磷酸缓冲液中，28℃温育10分钟；然后将悬液铺在LB平板上，28℃温育24小时；将单克隆菌落在无机平板上分别进行4种胞外酶的活性检测，这4种胞外酶分别是：果胶酶(pectate lyase)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)、蛋白酶(protease)和纤维素酶(cellulase)；选择2个具有明显胞外酶活性的单克隆菌落，分别接种进未感染细菌的新鲜白菜和芹菜组织中，28℃温育24小时。结果表明，所选择的2个单克隆菌落都能引起白菜和芹菜组织软腐和崩解。进一步检测表明，这2个单克隆菌落及其培养液能引起被注射接种的烟草叶片发生过敏反应。另外，所获得的白菜软腐病菌变种的菌落生长迅速、光滑，色泽淡白到乳黄。显微镜镜检表明：菌体呈短杆状，两端钝圆；大小1.0-2.0×0.5-0.7μm；单生或双生，少数串生；周围有鞭毛2-5根；不产生芽孢和荚膜；革兰氏染色阴性；兼性嫌气性。

按上述程序分离的白菜软腐细菌在分类上属于胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp carotovora)是基于以下事实：(1)该细菌适于生长的温度是25℃-34℃，而不是37℃；(2)该细菌大量分泌胞外酶的温度是28℃，而不是34℃；(3)该细菌只有生长在无机培养基上才大量产生胞外酶，而在像LB那样的富营养培养基上则不产生；(4)该细菌引起白菜和芹菜大量软腐或崩解的温度是28℃，而不是34℃；(5)该细菌能激发烟草叶片发生过敏反应。所有这些都与已报道的胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subspcarotovora)的资料相吻合。后来的事实进一步证明，从白菜软腐细菌中克隆的hrpN_Eccs基因与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subspcarotovora)的hrpN_Ecc基因具有90％以上的同源性，而其表达产物harpin_Eccs蛋白与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp carotovora)的harpin_Ecc蛋白也只有6个氨基酸的差别，同源性达98％以上。

鉴于所分离的细菌菌株的来源不同，包括寄主植物不同和地区差异性，以及hrpN基因和Harpin蛋白质的同源性、遗传多样性和差异性，我们将所分离的白菜软腐菌菌株定名为“Erwinia carotovora subsp.carotovora strain CSDS001”，而将从该菌株中克隆出的hrpN基因及其编码产物Harpin蛋白分别定名为“hrpN_Eccs基因”和“Harpin_Eccs蛋白”。

2、hrpN_Eccs基因的克隆(1)根据已经报道的胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwiniacarotovora subsp carotoyora)的hrpN_Ecc基因的核甘酸序列设计2个PCR引物分子，hrpN 1：5′-GCCGTATGCTTAATTCTCTTGGTGGCG-3′；hrpN 2：5′-GCAAGCTTCCGTTTAGCTGGAGAGCTTCT-3′。(2)用分离的白菜软腐细菌的染色体DNA作模板DNA，按如下程序进行PCR扩增：94℃/2min1个循环；94℃/15sec+55℃/30sec+72℃/15sec24个循环；94℃/1min+55℃/2min+72℃/3min1个循环。(3)PCR产物经限制酶Nde I和HindIII消化后，克隆进高表达载体pET28a(+)的NdeI-HindIII位点。(4)将克隆到的带有hrpN_Eccs基因的pET28a(+)质粒转进大肠杆菌工程菌E.coli JM109(DE3)的菌株中。

3、hrpN_Eccs基因的核甘酸序列编码区共计1071个核甘酸，其序列如SEQID.No1。

hrpN_Eccs基因具有以下属性：(1)富含甘氨酸密码子，缺少半胱氨酸密码子；(2)与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌褐腐致病菌(Erwinia carotovora subsp.carotoyora)Ecc71和Ecc1菌株的hrpN_Ecc基因分别享有93％和92％的同源性；(3)与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌黑腐致病菌(Erwinia carotovora subsp.atrosepitica)SCR11043和SCR11039菌株的hrpN_Ecc基因分别享有89％和88％的同源性。

4、Harpin_Eccs蛋白的高效表达将携带有hrpN_Eccs质粒的E.coli JM109(DE3)在加有50ml/L Km的LB液体培养基中37℃培养生长，待OD₆₀₀达到0.7(即细菌进入对数生长期)后，再加入诱导剂IPTG至终浓度1mM，继续培养6个小时后，离心(5,000rpm，10min)收集细菌细胞。细菌细胞经超声波破碎、离心、12％SDS-PAGE凝胶电泳，在电泳胶板的细菌样品泳道上，会呈现一条显著宽而浓的35.58kda条带，它就是hrpN_Eccs基因的表达产物Harpin_Eccs蛋白，约占细菌蛋白总量的60％以上。进一步将Harpin_Eccs蛋白分离纯化，可用作Harpin_Eccs蛋白的Western blot分析和HR检测。

5、Harpin_Eccs蛋白的氨基酸序列由N→C端共计356个氨基酸残基，其序列如SEQ ID.No2。

Harpin_Eccs蛋白具有以下属性：(1)356个氨基酸序列中各氨基酸组成分别为：Met22、Asn20、Gly75、Leu40、Ser41、Ala28、Gln24、Ile13、Lys17、Thr13、Asp16、Phe10、Va17、Arg5、Glu9、Trp2、Tyr4、His1、Pro9；(2)分子量35.58kda；(3)等电点pI：5.26；(4)与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovorasubsp carotovora)褐腐致病变种的Harpin_Ecc蛋白相比，分子中有6个位点发生了氨基酸替换(序列中的红色位点)，分别为Ser₇₀→Gly₇₀、Gly₁₁₃→Ser₁₁₃、Ala₁₁₅→Val₁₁₅、Gly₂₄₉→Ala₂₄₉、Arg₃₁₇→Ala₃₁₇、Lys₃₅₂→Gln₃₅₂；(5)富含甘氨酸Gly和较多的疏水性氨基酸亮氨酸Leu，分别占氨基酸数目总量的21％和11％，尤其是在第1、2个突变氨基酸G₇₀和S₁₁₃之间，其丰度分别高达56％和28％；(6)缺乏半胱氨酸Cys；(7)对温度特稳定，在100℃沸水中耐受10-15分钟仍有活性；(8)没有四级结构。

6、Harpin_Eccs蛋白的生物学活性及其应用目前公认的Harpin类蛋白的生物活性检测方法主要有：(1)过敏反应(hypersensitive response，HR)，通常以烟草作被试植物，这也是Harpin类蛋白生物活性检测最快速、简便的方法；(2)血清学反应，即用标准的Harpin蛋白纯品制成血清抗体，然后用这种抗血清对未知样品进行Western blot分析，通过抗体-抗原识别反应，可以准确检测出未知样品中的Harpin类蛋白。

Harpin_Eccs蛋白具有以下主要生物学功能：(1)促进植物生长发育、提高产量；(2)增强植物的广谱抗病性，包括对多种细菌、真菌和病毒的抗性；(3)使植物获得对某些有害昆虫的驱虫性；(4)增强植物的抗逆性；(5)延长植物产品的储存时间；(6)对盆花、苗木还有良好的塑型作用。

Harpin_Eccs蛋白可直接应用于植物的生长发育调节和病虫害防治，包括粮食作物、经济植物、蔬菜、水果、花卉以及园林和草场的养护等；使用方法有浸种、拌种、蘸根、种子包衣、植株注射、叶面喷施、花果喷涂等；使用剂量因使用方法和品种而异，一般5μg/ml-80μg/ml均为有效浓度；施用后2-12小时内即发生作用，药效可持续20天左右，一个生长季节可用药2-3次；本产品属天然有机蛋白，对人、畜无毒性，不引起病虫害的抗药性，不诱发植物遗传结构(基因组DNA)的改变，在自然界能很快被光分解或被微生物降解，对环境不会造成残留或积累污染，在使用过程中也无须特殊防护措施，是未来替代高毒、高残留化学农药和有公害的化学调节剂的理想的环保型生物产品。

本发明对Harpin_Eccs蛋白的功能及应用正在尝试作进一步的扩展。鉴于Harpin类蛋白对寄主植物作用的限制，我们已将下列不同来源的Harpin蛋白的基因进行融合：(1)hrpN_Eccs基因+hrpN_Ecc基因；(2)hrpN_Eccs基因+hrpN_Ea基因；(3)hrpN_Eccs基因+hrpN_Ech基因；(4)hrpN_Ecc基因+hrpN_Ea基因；(5)hrpN_Ecc基因+hrpN_Ech基因；(6)hrpN_Ea基因+hrpN_Ech基因。目前正在进行融合蛋白的表达、活性检测、效果试验及效价评估，以期获得功能互补、应用范围更广、活性更强的Harpin融合蛋白。另外，将Harpin_Eccs蛋白在特定条件下与某些特殊金属离子进行络合其过敏反应强度及抗病增产效果较未经络合处理的Harpin_Eccs蛋白明显增强。这种处理效果对其它Harpin类蛋白也是一样。

本发明中所使用的工程菌E.coli JM109(DE3)菌株及hrpN_Eccs基因的高效表达载体pET28a(+)质粒在国内外分子生物学研究及医药工业中已广泛应用，对环境是安全可靠的。

本发明中使用的缩略语：LB(细菌培养基，酵母粉5g/L+蛋白胨10g/L+NaCl10g/L，pH7.0)；Km(卡那霉素)；IPTG(异丙基硫代-β-半乳糖苷)；PMSF(苯甲基磺酰氟)；Tris(三羟甲基氨基甲烷)。

具体实施方式

实施例1菌种制备及大规模发酵

(1)制备原种：将带有hrpN_Eccs基因高效表达质粒pET28a(+)的工程菌E.coli JM109(DE3)菌株于甘油-LB+Km20μg/ml的斜面上划线，37℃培养过夜。(2)制备母种：将原种斜面上生长良好的单克隆菌落接种于加有100ml甘油-LB+Km20μg/ml的250ml摇瓶中，于37℃110rpm振荡培养12h。(3)制备生产种：将母种菌液按1％体积比接种于加有3L甘油-LB+Km25μg/ml的5L发酵罐中，37℃110rpm和0.5L/min通气量条件下培养12h。(4)大规模发酵：将50L以上的发酵罐加入70％体积的甘油-LB及终浓度40μg/ml的Km后，原位灭菌30min(120℃，1.1MPa)；然后按1％体积比接入生产种子菌，37℃200rpm和1L/min通气量条件下发酵培养；待细菌进入对数生长期(OD₆₀₀＝0.7)后，调节转速和通气量，以保证发酵环境有充足的供氧(DO＞30％)，并按特定程序进行对数分期补料；在细菌对数生长期结束前1-2小时，通过微孔滤膜加入诱导剂IPTG至终浓度1mM；继续诱导发酵4-6小时，即可下罐。此法可实现细菌的高密化培养。

实施例2 Harpin_Eccs蛋白的制备和纯化

Harpin_Eccs蛋白在大肠杆菌细胞中主要以包涵体(inclusion body)形式存在。工业上大规模生产Harpin_Eccs蛋白时，采用8M尿素破碎制备。实验室中为了得到更进一步的Harpin_Eccs蛋白纯品，可按下列程序操作：离心(5,000rpm，10min)收集经IPTG诱导4-6小时的大肠杆菌细胞，以20mMTris缓冲液(pH9.0)充分悬浮后，加10μl/25ml的溶菌酶(100mg/ml)，冰浴10min，加0.5ml/25mlPMSF(20mg/ml)，超声波(20KHz)破碎10min，再加0.5ml/25ml的PMSF，混匀后再超声波破碎10min，10,000rpm离心10min，取上清液于100℃水浴10min，冷却后12,000rpm离心10min，收集上清液。此上清液中即含有较高纯度的Harpin_Eccs蛋白，浓度达3600μg/ml，可用来作生物活性检测或进一步浓缩成更高纯度的晶体蛋白。

实施例3 Harpin_Eccs蛋白的使用方法

Harpin_Eccs蛋白在使用上方法多样，可因处理材料、处理部位、处理时间以及处理目的不同而有所差异。具体可按以下介绍的方法使用：

(1)浸种：首先用水将Harpin_Eccs蛋白配成30-60μg/ml的浓度，然后将种子浸于其中8-12小时。此法适宜作催芽的作物或蔬菜种子。浸种结束后，将种子从Harpin_Eccs蛋白浸种液中取出，即可催芽或播种。出苗一周后，苗高比对照增长10％以上，生长量也提高10％以上，而且苗期抗猝倒病的能力也明显增强。

(2)拌种：将种子稍加湿润，加入种子量0.1％的Harpin_Eccs蛋白制剂，充分拌匀后播种。出苗后苗齐苗壮，增强苗期抗猝倒病的能力。

(3)蘸根：适于移栽定殖的作物，如瓜果、蔬菜、棉花、玉米等。首先将Harpin_Eccs蛋白制剂配成30μg/ml的水溶液，然后将被移栽作物幼苗的根浸在该溶液中1-2小时。移栽后，植株恢复生长快，缓苗时间缩短，植株长势强劲。

(4)叶面喷雾：作物的整个生长季节均可进行喷施。将Harpin_Eccs蛋白制剂配成15-20μg/ml的水溶液，在作物的苗期、分蘖期、初花期、初果期或灌浆期进行喷雾使用。作物生长季节一般可喷雾2-3次。喷雾后，可提高作物营养体生长量15-30％，提高产量10-20％，而且整个生长季节可省掉80％以上的化学农药。某些作物如黄瓜可抗住60％的灰霉病、烟草可抗住60-80％的花叶病毒病。另外还有一定的抗逆(抗旱、抗寒、耐盐碱等)和驱虫效果。

实施例4 Harpin_Eccs蛋白的应用举例

目前已对数十种作物、蔬菜、水果、花卉作了Harpin_Eccs蛋白的施用效果试验，虽然在不同作物品种上表现程度有所不同，但Harpin_Eccs蛋白的促长增产、抗病驱虫、提高抗逆性以及盆花、苗木塑型等方面的作用是显著的。下面举几例加以说明：

(1)玉米：选取两块5分地大小的4叶期玉米苗田，分别用作对照和处理样块。处理块分别在4叶期和6叶期用15-20μg/ml的Harpin_Eccs蛋白溶液作了叶面喷雾，此外不使用任何农药，其它方面的管理与对照块一样。在试验过程中发现，用药后一周，处理块平均株高比对照块高出10-15cm，玉米大小斑病发病率也比对照块低20-30％；同时处理块开花比对照块提前5-10天，灌浆期双苞率明显高于对照。收获后比较产量，处理块比对照块增产12％以上。

(2)黄瓜：选取三块5分地大小的3叶期黄瓜苗田，分别用作对照、Harpin_Eccs蛋白处理、络合Harpin_Eccs蛋白处理的样块。两种蛋白处理液的浓度均为20μg/ml。两个处理块都分别在3叶期、5叶期和7叶期进行过叶面喷雾，其它管理同对照。试验结果表明：络合Harpin_Eccs蛋白处理和Harpin_Eccs蛋白处理，开花分别比对照提前10天和8天；花叶病分别比对照减少70％和65％；灰霉柄分别比对照减少40％和30％；产量分别比对照增加26％和23％以上。

(3)草莓：选取约2分地大小的两厢3叶期草莓苗棚，分别作对照和络合Harpin_Eccs蛋白处理。处理苗棚的络合Harpin_Eccs蛋白使用浓度为20μg/ml。3叶期开始叶面喷雾，以后每间隔15天喷施一次，共计5次。结果显示，处理棚比对照棚提早10左右开花；单株花、果率平均比对照增加2-3个；灰霉病发生率明显少于对照；鲜果呈色好、果型优、畸形果率低，产量比对照增产25％以上。另外，通过对等量鲜果进行烘干称重，发现处理棚的干物质积累也比对照增加1-2％。

(4)仙客来：仙客来是深受大众喜欢的盆花品种，但是由细菌性软腐病引起的死亡率很高，高温时休眠，而且因病毒病造成的畸形叶、花严重影响了其观赏价值和商业价值。我们选区了400盆3-4月龄仙客来作供试材料，随机分成两组，分别作对照和络合Harpin_Eccs蛋白处理。络合Harpin_Eccs蛋白的使用浓度为20μg/ml。处理方法为叶面喷雾，每间隔10-15天喷施一次。结果表明，用药一周以后，处理组的叶色变深、有光泽，株型也明显变得挺拔、紧凑、活脱，并能打破高温休眠；用药一个月以后，以前因病毒病而畸形卷曲的幼叶开始逐渐伸展成正常形态，而对照组的幼叶则变得越来越畸形，连开出的花瓣也呈畸形扭曲。另外，络合Harpin_Eccs蛋白似乎对仙客来叶片上的白粉虱也有一定的驱赶作用。

序列表

<110>成都派润生物科技有限公司

<120>一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的基因hrpN_Eccs及其表达

产物Harpin_Eccs蛋白质

<160>2

<170>PatentIn Version 2.1

<210>1

<211>1071

<212>DNA

<213>胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)

<221>1-1071

<400>1

1 atgcttaatt ctcttggtgg cggagcttct ctgcaaatca cgatcaaagc gggtggtaac

61 ggcggtttat ttccatctca gtcttcacaa aatggcggat cgccatcgca gtcggcgttt

121 ggtggccagc gtagcaacat cgcagaacag ctgtccgata tcgtgacgac tatgatgttt

181 atgggcagca tgatgggcgg cggcatgggc ggtgggctcg gtggtttagg cagtagcctg

241 ggcggactcg gtggtggttt gctgggtggt ggcttgggtg gcggtctcgg cagtagcctt

301 ggtagtggac tgggcagtgc gctcggcggc ggattaagcg gggtgctggg tgctggcatg

361 aatgccatga atccatcggc catgatgggt agcctgctgt ttagcgcgct ggaagatctg

421 ctgggcggtg gcatgtcgca gcagcagggt gggcttttcg gcaacaaaca gccgtcgtcg

481 ccggaaattt ctgcctatac ccaaggcgtt aacgatgcgc tgtccgcaat tctgggcaac

541 ggcctgagcc agacgaaagg gcaaacgtca ccgttgcaac tgggtaataa cggtctgcaa

601 ggcttgagcg gtgcgggtgc gtttaatcaa ctgggtagca cgctggggat gagcgttggg

661 caaaaagccg gtttgcagga gttgaacaac atcagcacgc acaatgatag cccgacgcgt

721 tacttcgtgg ataaagaaga tcgggcgatg gcgaaagaaa ttggtcagtt tatggatcaa

781 tatcctgaag tcttcggcaa ggcagaatac cagaaagata actggcagac ggcgaaacag

841 gaggataaat cctgggctaa agcgctgagc aagccggatg acgacggcat gactaagggc

901 agcatggata aattcatgaa ggcggtcggc atgatcaaga gtgcgatagc gggtgatact

961 ggcaacgcta acctgagcgc tcgtggcaac ggcggcgcat ctctgggcat tgatgcagcg

1021 atgatcggcg accgtatcgt caatatgggg ttgcagaagc tctccagcta a

<210>2

<211>356

<212>PRT

<213>胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)

<400>2

Met Leu Asn Ser Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Gln Ile Thr Ile Lys

1 5 10 15

Ala Gly Gly Asn Gly Gly Leu Phe Pro Ser Gln Ser Ser Gln Asn Gly

20 25 30

Gly Ser Pro Ser Gln Ser Ala Phe Gly Gly Gln Arg Ser Asn Ile Ala

35 40 45

Glu Gln Leu Ser Asp Ile Met Thr Thr Met Met Phe Met Gly Ser Met

50 55 60

Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu

85 90 95

Gly Ser Ser Leu Gly Ser Gly Leu Gly Ser Ala Leu Gly Gly Gly Leu

100 105 110

Ser Gly Val Leu Gly Ala Gly Met Asn Ala Met Asn Pro Ser Ala Met

115 120 125

Met Gly Ser Leu Leu Phe Ser Ala Leu Glu Asp Leu Leu Gly Gly Gly

130 135 140

Met Ser Gln Gln Gln Gly Gly Leu Phe Gly Asn Leu Gln Pro Ser Ser

145 150 155 160

Pro Glu Ile Ser Ala Tyr Thr Gln Gly Val Asn Asp Ala Leu Ser Ala

165 170 175

Ile Leu Gly Asn Gly Leu Ser Gln Thr Lys Gly Gln Thr Ser Pro Leu

180 185 190

Gln Leu Gly Asn Asn Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe

195 200 205

Asn Gln Leu Gly Ser Thr Leu Gly Met Ser Val Gly Gln Leu Ala Gly

210 215 220

Leu Gln Glu Leu Asn Asn Ile Ser Thr His Asn Asp Ser Pro Thr Arg

225 230 235 240

Tyr Phe Val Asp Lys Glu Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln

245 250 255

Phe Met Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Ala Glu Tyr Gln Lys

260 265 270

Asp Asn Trp Gln Thr Ala Lys Gln Glu Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala

275 280 285

Leu Ser Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Lys Gly Ser Met Asp Lys

290 295 300

Phe Met Lys Ala Val Gly Met Ile Lys Ser Ala Ile Ala Gly Asp Thr

305 310 315 320

Gly Asn Thr Asn Leu Ser Ala Arg Gly Asn Gly Gly Ala Ser Leu Gly

325 330 335

Ile Asp Ala Ala Met Ile Gly Asp Arg Ile Val Asn Met Gly Leu Gln

340 345 350

Lys Leu Ser Ser

355

Claims

1、一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的基因hrpN_Eccs及其表达产物Harpin_Eccs蛋白质，其特征在于：hrpN_Eccs基因来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwiniacarotovora subsp.carotovora)白菜软腐菌变种CSDS001菌株，该基因表达产物Harpin_Eccs蛋白具有多种功能活性，能诱导植物产生抗病性、驱虫性和抗逆性，并促进植物生长发育和提高产量；hrpN_Eccs基因的核甘酸序列为：

1 atgcttaatt ctcttggtgg cggagcttct ctgcaaatca cgatcaaagc gggtggtaac

61 ggcggtttat ttccatctca gtcttcacaa aatggcggat cgccatcgca gtcggcgttt

121 ggtggccagc gtagcaacat cgcagaacag ctgtccgata tcatgacgac tatgatgttt

181 atgggcagca tgatgggcgg cggcatgggc ggtgggctcg gtggtttagg cagtagcctg

241 ggcggactcg gtggtggttt gctgggtggt ggcttgggtg gcggtctcgg cagtagcctt

301 ggtagtggac tgggcagtgc gctcggcggc ggattaagcg gggtgctggg tgctggcatg

361 aatgccatga atccatcggc catgatgggt agcctgctgt ttagcgcgct ggaagatctg

421 ctgggcggtg gcatgtcgca gcagcagggt gggcttttcg gcaacaaaca gccgtcgtcg

481 ccggaaattt ctgcctatac ccaaggcgtt aacgatgcgc tgtccgcaat tctgggcaac

541 ggcctgagcc agacgaaagg gcaaacgtca ccgttgcaac tgggtaataa cggtctgcaa

601 ggcttgagcg gtgcgggtgc gtttaatcaa ctgggtagca cgctggggat gagcgttggg

661 caaaaagccg gtttgcagga gttgaacaac atcagcacgc acaatgatag cccgacgcgt

721 tacttcgtgg ataaagaaga tcgggcgatg gcgaaagaaa ttggtcagtt tatggatcaa

781 tatcctgaag tcttcggcaa ggcagaatac cagaaagata actggcagac ggcgaaacag

841 gaggataaat cctgggctaa agcgctgagc aagccggatg acgacggcat gactaagggc

901 agcatggata aattcatgaa ggcggtcggc atgatcaaga gtgcgatagc gggtgatact

961 ggcaacacta acctgagcgc tcgtggcaac ggcggcgcat ctctgggcat tgatgcagcg

1021 atgatcggcg accgtatcgt caatatgggg ttgcagaagc tctccagcta a

2、根据权利要求1所述之编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的基因hrpN_Eccs及其表达产物Harpin_Eccs蛋白质，其特征在于：所述hrpN_Eccs基因具有以下属性：(1)编码区共计有1071个核甘酸；(2)富含甘氨酸密码子，缺少半胱氨酸密码子；(3)与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌褐腐致病菌(Erwinia carotovorasubsp.carotovora)Ecc71和Eccl菌株的hrpN_Ecc基因分别享有93％和92％的同源性；(4)与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌黑腐致病菌(Erwinia carotovora subsp.atrosepitica)SCR11043和SCR11039菌株的hrpN_Ecc基因分别享有89％和88％的同源性。

3、根据权利要求1所述之编码植物功能活性和广谱抗性细胞信号因子的基因hrpN_Eccs及其表达产物Harpin_Eccs蛋白质，其特征在于：所述Harpin_E多_ccs蛋白序列如SEQ ID.No2，具有以下属性：(1)356个氨基酸序列中各氨基酸组成分别为：Met22、Asn20、Gly75、Leu40、Ser41、Ala28、Gln24、Ile13、Lys17、Thr13、Asp16、Phe10、Val7、Arg5、Glu9、Trp2、Tyr4、His1、Pro9；(2)分子量35.58kda；(3)等电点pI：5.26；(4)与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovorasubsp carotovora)褐腐致病变种的Harpin_Ecc蛋白相比，分子中有6个位点发生了氨基酸替换(序列中的红色位点)，分别为Ser₇₀→Gly₇₀、Gly₁₁₃→Ser₁₁₃、Ala₁₁₅→Val₁₁₅、Gly₂₄₉→Ala₂₄₉、Arg₃₁₇→Ala₃₁₇、Lys₃₅₂→Gln₃₅₂；(5)富含甘氨酸Gly和较多的疏水性氨基酸亮氨酸Leu，分别占氨基酸数目总量的21％和11％，尤其是在第1、2个突变氨基酸G₇₀和S₁₁₃之间，其丰度分别高达56％和28％；(6)缺乏半胱氨酸Cys；(7)对温度特稳定，在100℃沸水中耐受10-15分钟仍有活性；(8)没有四级结构。

4、根据权利要求1和3所述之编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的基因hrpN_Eccs及其表达产物Harpin_Eccs蛋白质，其特征在于：Harpin_Eccs蛋白及其相关活性复合体可直接应用于植物的生长发育调节和病虫害防治。