CN112773884A - HrpWpst蛋白在识别激活多类受体和/或膜蛋白及其信号通路的制药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了HrpWpst蛋白在识别激活多类受体和/或膜蛋白及其信号通路并引起级联生物学效应的制药中的应用，本发明涉及生物医药领域，所述HrpWpst蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。HrpWpst蛋白作为一类富含多个表位(线性和构象)特殊结构的配体蛋白分子，能够跨界识别、激活、结合多种类型的动物的膜受体、膜蛋白、信息通路和代谢通路，HrpWpst蛋白是一类具有全新功能，全新作用机制和全新应用前景的特殊多表位配体蛋白。

Description

HrpWpst蛋白在识别激活多类受体和/或膜蛋白及其信号通路 的制药中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种HrpWpst蛋白在识别激活多类受体和/或膜蛋白及其信号通路并引起级联生物学效应的制药中的应用。

背景技术

分子生物学是在分子水平上研究生命现象的科学，通过研究生物大分子的结构、功能和代谢来阐明各种生命现象的本质，其研究内容涵盖了生命的全过程。DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。基因组决定了生命有什么，蛋白质组决定了生命能做什么，代谢组决定了生命实际发生了什么。现代生命科学、生物技术和医药生物技术，特别是蛋白质组学和代谢组学，得到了突飞猛进的发展，更新了对疾病的认识、诊断、防控、治疗和康复的理念，开创了对新型高效安全药物的新认识和新途径，使现代医学的发展进入到了一个崭新阶段，开辟了广阔的应用前景。

现代生命科学的受体理论是药效学的基本理论之一，是从分子水平解释生命的可控的生理过程和病理过程、药物的药理作用机制、药物分子的结构效应关系的一个重要依据。配体是一类信号物质，除了与受体识别、结合和激活受体外，本身并无其他直接功能，它不能参加代谢产生有用产物，也不直接诱导任何细胞活性，更无酶的特点，它唯一的功能就是通过对受体的识别、结合和激活，向细胞传导在内外环境中存在的特殊信号或信息。

信号通路(细胞通讯)是指在多细胞生物的细胞间或细胞内通过高度精确和高效发送与接收信息的通讯机制，并通过放大引起快速的细胞生理生化反应，或启动基因活动，尔后发生一系列的细胞生理、生化活动来协调各组织活动，促使生命的统一整体对多变的内外界环境作出综合反应，这是生命机体的系统、组织、器官、细胞、亚细胞、分子、亚分子建造一个协调的生长、发育、防御和代谢的联结机制。

受体是指一类介导细胞信号转导的功能蛋白，能识别周围环境(细胞内外环境)中的某些微量物质，并与之识别、结合，被激活，通过信号放大系统触发后续的生理生化反应。受体是由细胞膜和细胞内的蛋白质、核酸、脂质、多糖等组成的生物大分子。受体在细胞生物学中是一个很泛的概念，意指任何能够同激素、神经递质、药物或细胞内外的信号分子结合并能引起细胞功能变化的生物大分子，此时的信号分子被称为配体。多细胞生物中有几百种不同的信号分子在细胞间和细胞内传递信息，这些信号分子中有蛋白质、氨基酸衍生物、核苷酸、胆固醇、脂肪酸衍生物以及可溶解的气体分子等。存在于细胞质膜上的受体称为膜受体，化学本质绝大部分是糖镶嵌蛋白；位于胞液和细胞核中的受体称为胞内受体，它们全部为DNA结合蛋白。

配体是一类信号物质，除了与受体识别、结合和激活受体外，本身并无其他直接功能，它不能参加代谢产生有用产物，也不直接诱导任何细胞活性，更无酶的特点，它唯一的功能就是通过对受体的识别、结合和激活，向细胞传导在内外环境中存在的特殊信号或信息。

配体与受体的结合是分子间识别激活过程，它靠离子配位键、氢键、π-π堆积作用、静电作用、疏水作用、范德华力等的作用，随着两种分子空间结构互补和互作程度增加，相互作用基团之间距离就会缩短，作用力就会大大增加，因此配体和受体分子空间结构的互作性和互补性是特异结合的主要因素，也即本发明所采用的表位概念。同一配体可能对应两种或两种以上的不同受体，同一配体与不同类型受体结合会产生不同的细胞反应。配体与受体结合后，将引发有关系列生理活性，无论配体是内源性的还是外源性的，与受体结合后，二者形成配体-受体结合面或复合物，从而传递信息，通过传导和转导，并通过放大引起快速的细胞生理、生化反应，或者启动基因活动，尔后发生一系列的级联反应来协调各组织、器官、细胞的活动，促成生命的统一整体对多变的内外界环境作出综合反应。

2008年，Leader等首次提出根据蛋白质药理学作用分类的思路，并将蛋白质药物分为如下四大类：①应用蛋白质的酶活性及调节活性进行治疗的蛋白质药物；②有特殊靶向活性的蛋白质药物；③重组蛋白质疫苗；④用于诊断的重组蛋白质药物。其中第一类和第二类主要用于基础蛋白质疗法，第三类和第四类重点强调蛋白质在疫苗及诊断用药中的应用。经过一个多世纪的摸索和曲折发展，蛋白质药物已经一步一步的成熟起来，在制药工业及临床应用中均占有举足轻重的地位。它们对肿瘤、感染、自身免疫性疾病、代谢性遗传病、各种老年病及退行性疾病等几乎所有疾病领域均具有重要影响，正在成为21世纪重要的治疗、预防和诊断用药。展望未来30年，以重组DNA技术为核心的生物技术的广泛应用必将赋予蛋白质药物更为广阔的发展空间：重组蛋白质药物将逐步取代非重组蛋白；重组改构、体内外修饰将成为常规；用哺乳动物细胞体系表达的产品将占主导地位；蛋白质药物非注射给药途径将受到越来越多的关注；生物仿制药和生物相似药将大有可为。(朱迅，蛋白质药物的功能分类及发展趋势，中国医药生物技术2010年2月第5卷第1期，Chin MedBiotechnol，February 2010，Vol.5，No.1)。

已有研究表明，配体与受体的识别结合，是由线性或和构象配体结合表位的关键氨基酸残基决定的，比如，boFcγ2R的82-85位多肽FIGV线性配体结合表位的苯丙氨酸(Phe82)、异亮氨酸(Ile 83)和颉氨酸(Val 85)是识别结合牛IgG2受体的关键氨基酸残基，再比如，boFcγRⅠ的142-149位多肽TNLSHNGI线性配体结合表位的苏氨酸(Thr 142)、天门冬酰胺(Asn 143)、亮氨酸(Leu 144)、甘氨酸(Gly 148)和异亮氨酸(Ile 149)是识别结合牛IgG1受体的关键氨基酸残基；又比如，boFcγRⅢ的98-103位短肽AQRVVN线性配体结合表位的丙氨酸(Ala 98)、谷氨酸(Gln 99)、颉氨酸(Val 101)、颉氨酸(Val 102)和天门冬酰胺(Asn 103)是识别结合牛IgG1受体的关键氨基酸残基。

HrpWpst蛋白(NCBI Reference Sequence:WP_005763926.1)是hrpWpst基因(Pseudomonas_syringae_tomato DC3000)的表达产物，其由424个氨基酸残基组成，有一、二、三级结构而无四级结构的非酶蛋白质，不含胱氨酸和半胱氨酸，富含甘氨酸，分子量Mw68.3kda，NCBI Reference Sequence:WP_005763926.1。HrpWpst蛋白保守结构域由184个氨基酸组成，位于蛋白的C-端，226-409；α-螺旋结构18-20、42-44、76-98、409-413；β-折叠结构224-227、231-233、238-239、245-247、264-267、272-278、286-289、293-303、309-313、321-327、338-341、346-350、352-355、360-362、373-377、379-381、386-390、397-400、403-405；do-结构1-84、91-274、276、278-295、298-300、302、310、313、323、325-327、334、336、338、341、372-374、409-412、414-424。

结构域是生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，特别是指蛋白质中由不同二级结构和超二级结构组合而成的独立的稳定结构区域，结构域也是蛋白质功能单元，在多结构域蛋白质中，不同的结构域常常与不同的功能相联系；蛋白质的二级和超二级结构主要由氢键维持，包括α螺旋、β折叠、β转角、无规卷以及do-结构等，α螺旋是一种重复性结构，螺旋中每个α-碳的Φ和Ψ分别为-57°和-47°附近。每圈螺旋占3.6个氨基酸残基，沿螺旋轴方向上升0.54nm，每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm，相邻螺圈之间形成氢键，氢键的取向几乎与螺旋轴平行；β折叠：β－折叠片由两条或多条伸展的多肽链(或一条多肽链的若干肽段)侧向聚集，通过相邻肽链主链上的N-H与C＝O之间有规则的氢键，形成锯齿状片层结构；do-结构是固有无序蛋白质(intrinsically disordered proteins，简称IDPs)结构区域，具广泛的变构效应，作为柔性的连接区域，内存多种构象和运动状态，并以重复性高、带电性、易结合、以及空间优越性和高度协调性，广泛参与和调控转录、翻译、细胞分裂、蛋白质聚集和细胞信号转导，特别参与自组装调控过程。HrpWpst蛋白是多结构域蛋白质，形成多个线性和构象表位的特殊结构，不同的结构域常常与不同的功能相联系，从而，决定了它们的在识别激活动物的多类受体、膜蛋白以及信号通路和代谢通路并能引起多功能级联生物学效应的制药中的应用。但是，目前并没有相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于：针对上述存在的问题，本发明提供一种HrpWpst蛋白在识别激活多类受体和/或膜蛋白及其信号通路并引起级联生物学效应的制药中的应用。

本发明采用的技术方案如下：

HrpWpst蛋白在识别激活多类受体和/或膜蛋白及其信号通路并引起级联生物学效应的制药中的应用，所述HrpWpst蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述HrpWpst蛋白富含多个线性和构象表位结构，是指能与细胞膜受体、膜蛋白等识别结合的氨基酸残基组成的功能基团，这个功能基团是由以下氨基酸残基组成，包括能与受体识别、结合、激活的富含供质子型或接受质子型氨基酸残基；进一步的，含有一个至多个疏水非极性氨基酸残基，含有一个至多个酸性带正电、碱性带负电氨基酸残基，含有一个至多个酰胺基极性不带电氨基酸残基，含有一个至多个极性不带电氨基酸残基；进一步的，富含供质子型(蛋氨酸残基除外)或接受质子型(包括蛋氨酸残基)氨基酸残基：谷氨酸、天门冬酰酸、赖氨酸、组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、精氨酸，它们能与多类型受体蛋白对应氨基酸残基以氢键方式识别激活连接形成结合面或复合物；进一步的，疏水非极性氨基酸残基：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸能以非极性疏水、范德华力与多类型受体形成紧密的结合面或复合物；酸性带正电、碱性带负电氨基酸残基：天冬酰酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸能通过离子键与多类型受体形成紧密的结合面或复合物；酰胺基极性不带电氨基酸残基：天冬酰胺、谷氨酰胺的酰胺基能与受体的半胱氨酸识别区Pam3CSK4以较强氢键形成结合面或复合物；极性不带电氨基酸残基：丝氨酸通过极性以较强氢键与多类型受体形成紧密的结合面或复合物。

进一步的，HrpWpst蛋白全序列有424个氨基酸残基，其中关键氨基酸残基277个：疏水非极性氨基酸残基109个，极性不带电氨基酸残基29个，酰胺基氨基酸残基61个，酸性带正电、碱性带负电氨基酸残基78个，关键氨基酸占全序列65.3％；HrpWpst蛋白保守结构区域有184个氨基酸残基：其中关键氨基酸残基140个，疏水非极性氨基酸残基62个，极性不带电氨基酸残基6个，酰胺基氨基酸残基24个，酸性带正电、碱性带负电氨基酸残基48个，关键氨基酸占保守结构域的76.1％；HrpWpst蛋白α-螺旋区，其中有44个氨基酸残基，关键氨基酸残基28个：疏水非极性氨基酸残基14个，极性不带电氨基酸残基7个，酰胺基氨基酸残基4个，酸性带正电、碱性带负电氨基酸残基3个，关键氨基酸占α-螺旋结构的63.6％；HrpWpst蛋白β-折叠区，有83个氨基酸残基，关键氨基酸残基69个：疏水非极性氨基酸残基43个，极性不带电氨基酸残基1个，酰胺基氨基酸残基9个，酸性带正电、碱性带负电氨基酸残基16个，关键氨基酸占β-折叠区的83.1％；进一步的，发明人从欧文氏菌属、假单胞菌属中筛选、克隆、制备了HrpWPsda、HrpWPsst、Hrp WPssc、HrpWPsce、HrpWPsss、HrpWPssp、HrpWPsca、HrpWPsco、HrpWPsav、HrpWPsto、HrpWPssa、HrpWEpsi、HrpWPagg、HrpWPvag、HrpWEace、HrpWEmal、HrpWSmar、HrpWEpir、HrpWEtas、HrpWErDELGPWi、HrpWEamy、HrpWEccS、HrpWPsvi、HrpWPsna、HrpWPsci、HrpWPsel、HrpWDchr、HrpWErde、HrpWDzea、HrpWDfan、HrpWDdia、HrpWDdad、HrpWDsol、HrpWBde、HrpWPbet、HrpWBren、HrpWPcar、HrpWPpol、HrpWPcar、HrpWPper、HrpWPatr等超敏蛋白，依据生物信息学分析这些分子结构表明，它们具有类似于上述多表位HrpWPst配体蛋白的相似结构特征、结构进化趋势以及具有多个构象表位和线性表位结构：含有一至多个疏水非极性氨基酸残基、含有一至多个极性不带电氨基酸残基、含有一至多个酰胺基极性不带电氨基酸残基、含有一至多个酸性带正电、碱性带负电氨基酸残基；进一步的，疏水非极性氨基酸残基：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸，极性不带电氨基酸残基：丝氨酸，酰胺基极性不带电氨基酸残基：天冬酰胺、谷氨酰胺，酸性带正电、碱性带负电氨基酸残基：天冬酰酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸；进一步的，以上所述关键氨基酸残基在这些蛋白分子的全序列中占比70.7％-62.7％，在保守结构域中占比76.1％-57.9％，在α-螺旋结构中占比84.4％-77.5％，在β-折叠区结构中占比85.1％-65.2％；进一步的，HrpWpst蛋白的上述氨基酸残基(一般统称为关键氨基酸残基)，又不限于这些氨基酸残基，能通过氢键、离子键、疏水、非极性、极性、范德华力，实现配体和受体分子空间结构和电性的互补性、互作性以及特异识别、激活、结合，与多类型受体形成紧密结合面或复合物，能引起受体分子的构象、能量、电性和信息的变化，经信号传导和转导，放大表达系列生物学效应。

优选地，所述多类受体包括HLA-B主要组织相容性复合体，I，B类受体、LGALS3BP半乳糖3结合蛋白(受体)、LAMP2溶酶体相关膜蛋白2受体、游离脂肪酸受体4、酪氨酸蛋白激酶跨膜受体1。

优选地，所述膜蛋白包括PKP1血小板亲和蛋白1、pinin桥粒相关蛋白、泛素特异性肽酶9，x连锁关联蛋白A(囊泡相关膜蛋白)、VCL黏着斑蛋白、富含脯氨酸小蛋白1A、TM9SF2跨膜9超家族成员2。

优选地，所述信号通路包括hsa03320:PPAR信号通路、hsa05120:幽门螺杆菌感染的上皮细胞信号转导的信号通路。

优选地，所述代谢通路包括抗病毒、抗细菌、抗异物、抗炎性相关代谢通路：hsa04144:内吞作用、hsa04145:吞噬体、hsa04666:Fc-r介导的吞噬作用、hsa01130:抗生素的生物合成、hsa05131:志贺氏菌病、hsa04612:抗原处理和呈递、hsa05130:致病性大肠杆菌感染、hsa05100:上皮细胞的细菌侵袭、hsa05132:沙门氏菌感染、hsa05169:巴尔病毒感染、hsa05168:单纯疱疹病毒1感染、hsa05203:病毒致癌作用；包括重要神经疾病代谢通道：hsa05010:阿尔茨海默氏症、hsa05012:帕金森病、hsa05016:亨廷顿氏舞蹈症；包括核酸、蛋白质、氨基酸、糖、脂肪代谢相关通路：hsa04110:细胞周期、hsa03030:DNA复制、hsa03013:RNA运输、hsa03018:RNA降解、hsa03040:剪接体、hsa03010:核糖体、hsa04141:内质网蛋白加工、hsa04810:肌动蛋白骨架的调控、hsa03050:蛋白酶体、hsa01230:氨基酸生物合成、hsa00190:氧化磷酸化、hsa04932:非酒精性脂肪肝(NAFLD)、hsa00020:柠檬酸循环(TCA循环)、hsa00640:丙酸新陈代谢、hsa01200:碳代谢。

多功能级联生物学效应包括能诱导不同器官、组织的细胞组分、分子功能和生物学过程三个层次相关功能基因群显著表达差异，包括细胞组分(包括细胞、细胞结、细胞部分、细胞外基质、细胞外基质成分、细胞外区域、细胞外区域部分、大分子复合物、膜、膜部分、膜封闭腔、细胞器、细胞器的部分、超分子纤维、突触、突触部分、抗氧化活性等)，分子功能(包括绑定、催化活性、化学引诱物的活动、化学排斥物活动、电子载体活动、金属伴侣蛋白活动、分子功能监管机构、活动分子传感器、核酸结合转录因子的活性、信号传感器活动、结构分子活动、转录因子活性蛋白质结合、运输活动等)，生物过程(包括行为、生物粘附、生物调节、细胞聚集、细胞死亡、细胞成分组织或生物发生、细胞过程、解毒、发展的过程、增长、免疫系统的过程、本地化、运动、代谢过程、多生物过程、多细胞生物的过程、生物过程负调控、生物过程的正调控、突触前过程涉及突触传递、生物过程调节、繁殖、生殖过程、刺激反应、有节奏的过程、信号、单一生物过程等)的相关功能基因群表达差异发生显著性变化。

优选地，所述级联生物学效应包括细胞过程(Cellular Processes)、环境信息处理(Environmental Information Processing)、遗传信息处理(Genetic InformationProcessing)、新陈代谢(Metabolism)和生物体系统(Organismal Systems)等功能途径；进一步地，①细胞过程(Cellular Processes)：HrpWpst蛋白诱导的多个差异表达基因参与了运输和分解代谢，细胞群体，细胞活性，细胞生长与死亡等细胞过程；②环境信息处理(Environmental Information Processing):HrpWpst蛋白诱导的多个差异表达基因参与了信号分子与相互作用，信号转导，膜运输等环境信息处理过程；③遗传信息处理(GeneticInformation Processing):HrpWpst蛋白诱导的多个差异表达基因参与了翻译，复制和修复，折叠、分类和降解等生物过程；④新陈代谢(Metabolism):HrpWpst蛋白诱导的多个差异表达基因参与了生物降解和代谢，核苷酸代谢，其他氨基酸的代谢，代谢的辅助因子和维生素，脂质代谢，糖的生物合成和代谢，全局和概览地图，能量代谢，碳水化合物代谢及氨基酸代谢等代谢过程；⑤生物体系统(Organismal Systems):HrpWpst蛋白诱导的多个差异表达基因参与了感觉系统，神经系统，免疫系统，排泄系统，环境适应，内分泌系统，消化系统，发育循环系统等生物过程。

优选地，所述制药中的应用的制品及药物的剂型为液剂、粉剂、片剂或胶囊剂。

所述识别激活动物的多类受体、膜蛋白及其信号通路并诱发多功能级联生物学效应的HrpWpst蛋白制剂的使用途径，可通过本领域技术人员已知的任一途径施用，所述途径包括内用、外用、口服、注射、肌内、静脉内、皮内、腹膜内、皮下、鼻、口、直肠、局部、含服和经皮施用或任何途径；可以通过任何方便的途径施用HrpWpst多表位配体蛋白，例如通过灌注或快速灌注，通过上皮或皮肤粘膜内层(例如，口粘膜、鼻腔黏膜、胃黏膜、直肠和肠粘膜等等)吸收，并且可以与其它生物活性剂顺序、间歇地或在相同组合物中施用；依据治疗部位，施用可以是局部的、表面的或者全身的。局部施用于需要治疗的区域可以，但不限于，局部灌注、表面应用，通过浸泡，通过注射，通过导管，通过栓剂；施用还可以包括控释系统，包括控释制剂和装置控释，如通过泵；在任一给定情况下最合适的途径将取决于被治疗的疾病或状况的性质和严重性和使用的具体组合物的性质。多种递送系统是已知的并且可以用于施用多表位配体蛋白，可以在脂质体、微粒、微嚢中包裹。可以制备多表位配体蛋白的药物组合物，通常，将按照管理机构的批准制备或者根据公认的药典制备药学上可接受的组合物用于患者。

所述制药中的应用还包括为HrpWpst蛋白质依据药学治疗的活性化合物(HrpWpst蛋白制品或和药物)和其衍生物通常以单位剂型或多次剂型的配制和施用，每个单位剂量含有预定量的治疗活性化合物，其与所需的药物载体、运载体或赋形剂结合足够产生希望的治疗效果。单位剂型的实例包括安瓿和注射器和单独包装的片剂或胶囊剂。可以以部分或其倍数施用单位剂型。多次剂型是在单个容器中包装的多个相同的单位剂型，其将以分开的单位剂型施用。多次剂型的实例包括小瓶、片剂或胶囊瓶或加仑瓶。所以，多次剂型是在包装中不分开的多个单位剂量。可以制备含有0.001％到100％的活性成分的剂型或组合物，剩余部分由无毒载体组成，对于口服施用，药物组合物可以采取例如片剂或胶嚢剂的形式，其通过常规方法用药学上可接受的赋形剂如黏合剂(包括，但不限于，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或者丙基甲基纤维素)；填充剂(包括，但不限于，乳糖、微晶纤维素)；润滑剂(包括，但不限于，硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(包括，但不限于，马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)；或湿润剂(包括，但不限于，十二烷基硫酸钠)制备。可以通过本领域公知的方法包衣片剂。药物组合物也可以为液体形式，包括，但不限于，溶液剂、糖浆剂或混悬剂，或者可以以药物产品给出，其在使用前用水或其他合适的运载体重构。此类液体制剂可以通过常规方法用药学上可接受的添加剂制备，所述添加剂为如悬浮剂(包括，但不限于，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或食用脂肪)；乳化剂(包括，但不限于，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性运载体(包括，但不限于，杏仁油、油性酯，或者分级分离的植物油)；和防腐剂(包括，但不限于，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。适于直肠施用的制剂可以作为单位剂量栓剂提供。这些可以通过将HrpWpst蛋白活性化合物与一种或多种固体载体，如可可脂混合，然后将所得混合物成型来制备。适于局部应用于皮肤或眼睛的制剂包括，但不限于，软骨剂、霜剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂和油。示例性载体包括，但不限于，凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇类，和其两种或多种的组合。局部制剂也可以含有按重量计0.001％到15％、20％、25％的增稠剂，其选自包括，但不限于，羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚/羟基烷基(甲基)丙烯酸酯或聚(甲基)丙烯酰胺类。通常通过滴注或作为软骨剂应用到结膜嚢中来应用局部制剂。它也可以用于冲洗或润滑眼、面部窦和外耳道。也可以将它注射到眼前房和其他地方。液体状态的局部制剂也可以以带或者隐形眼镜的形式存在于亲水的三维聚合物基质中，活性成分从所述基质释放。对于适于含服(舌下)施用的制剂包括，但不限于，在调味基质(通常蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)中含有活性化合物的锭剂；和在惰性基质包括，但不限于，明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中含有化合物的软锭剂。可以配制配体同种型的药物组合物用于通过注射，包括，但不限于，通过快速浓注或连续灌注进行肠胃外施用。用于注射的制剂可以为单位剂型，例如，在安瓿或多剂量容器中，具有加入的添加剂。组合物可以为油性或水性载体中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并且可以包括，但不限于，配制试剂，如悬浮剂、稳定剂，备选地，活性成分可以为粉末形式，在使用前用合适的载体如无菌无致热原的水或其他溶剂重构。适于经皮施用的制剂可以以离散的贴剂给出，适于在长时间内与接受者的表皮保持密切接触。此类贴剂合适地含有活性化合物作为活性化合物的任选緩冲的水溶液。适于经皮施用的制剂可以通过离子电渗疗法递送并采取活性化合物的任选緩沖的水溶液形式。

所述识别激活动物的多类受体、膜蛋白及其信号通路并诱发多功能级联生物学效的HrpWpst多表位配体蛋白引起的多功能级联生物学效应和多样性功能广泛涉及多系统、组织、器官、细胞相关疾病和状况的诊断、或和预防、或和治疗、或和康复以及广泛涉及有关疾病和状况的食字号、消字号、妆字号、械字号和健字号制品及药物的制药中的应用。

优选地，所述制药中应用的涉及识别激活动物的多类受体、膜蛋白及其信号通路并诱发多功能级联生物学效应的HrpWpst多表位配体蛋白的制品及药物为涉及诊断、或和预防、或和治疗、或和康复神经系统、消化系统、运动系统、循环系统、呼吸系统、内分泌系统、免疫系统、泌尿系统、生殖系统疾病和状况的制品及药物：包含所述多表位的配体蛋白的制品及药物为涉及诊断、或和预防、或和治疗、或和康复神经连结疾病、痴呆、帕金森病、中枢神经系统疾病、神经肌肉病、癫痫、头痛和神经痛、周围神经病、注意缺陷多动障碍和抽动障碍、失眠症、抑郁症、焦虑障碍、双相情感障碍、精神病性障碍、神经性皮炎相关的神经系统疾病和状况的制品及药物。

包含所述多表位的配体蛋白的制品及药物为涉及诊断、或和预防、或和治疗、或和康复胃酸分泌不调、胃肠神经官能症、胃肠动力、胃肠黏膜炎、肝脏疾病、微生态障碍相关的消化系统疾病和状况的制品及药物。

包含所述多表位的配体蛋白的制品及药物为涉及诊断、或和预防、或和治疗、或和康复关节炎、肌肉痉挛、疼痛、肌营养不良、肌肉神经损伤、脱水相关的运动系统疾病和状况的制品及药物。

包含所述多表位的配体蛋白的制品及药物为涉及诊断、或和预防、或和治疗、或和康复心力衰竭、心律失常、高血压、心肌损伤、缺血、心绞痛、高脂血症、钙通道阻滞、血管痉挛、血凝、血象异常、心肌梗死相关的循环系统疾病和状况的制品及药物。

包含所述多表位的配体蛋白的制品及药物为涉及诊断、或和预防、或和治疗、或和康复哮喘、慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、过敏原免疫、变态反应、肺炎、急性或慢性支气管炎、支气管哮喘、胃食管反流、鼻炎相关的呼吸系统疾病和状况的制品及药物。

包含所述多表位的配体蛋白的制品及药物为涉及诊断、或和预防、或和治疗、或和康复糖尿病、甲状腺疾病、垂体疾病、高催乳素血症、尿崩症、肾上腺疾病、甲状旁腺疾病、骨质疏松症相关的内分泌系统疾病和状况的制品及药物。

包含所述多表位的配体蛋白的制品及药物为涉及诊断、或和预防、或和治疗、或和康复免疫低下、类风湿关节炎、红斑狼疮相关的免疫系统疾病和状况的制品及药物。

包含所述多表位的配体蛋白的制品及药物为涉及诊断、或和预防、或和治疗、或和康复肾病综合征、间质性肾炎、肾衰竭、泌尿、生殖系统感染、肾盂肾炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、附睾炎或睾丸炎、前列腺增生、膀胱过度活动症、性功能障碍相关、以及各类男科、妇科感染性炎症和功能性疾病等的泌尿生殖系统疾病和状况的制品及药物。

包含所述多表位的配体蛋白的制品及药物为涉及诊断、或和预防、或和治疗、或和康复全身肌肤细胞营养、激活、再生、修复、清除、细腻光洁、紫外黑色素沉积、湿疹、粗糙、裂纹、暗纹、干枯、硬皮、红斑、过敏、神经性皮炎、损伤、青春痘、暗疮、疤痕、暗沉、螨虫、油性皮肤、炎症性皮肤病、自身免疫性皮肤病、色素性皮肤病、皮肤萎缩、变薄、干燥、色素沉着、皱纹增生、表皮角化不良、干皮症、接触性皮炎、抗皮肤衰老、改善皮肤功能、美白祛斑、防治皮肤疾病的相关的皮肤系统疾病和状况的制品及药物。

优选地，所述制药中的HrpWpst蛋白纯化原药蛋白制剂的制备为高聚态HrpWpst蛋白的解聚和活化生产HrpWpst蛋白纯化原药的制备和生产：

1.预处理用葡萄糖Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液调节收集发酵制备的高聚态HrpWpst多表位蛋白的体积浓度范围0％-30％，优选地浓度0％-5％；优选地浓度30％-20％；优选地浓度5％-10％；优选地浓度20％-15％；最优选地浓度10％-15％。在常温(20-30℃)条件下，用预处理葡萄糖Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液，pH范围是1-14，葡萄糖浓度范围是0-2500mmol，缓冲系统pH，优选地pH 1-3；优选地pH 14-10；优选地pH4-5；优选地pH 9-6；最优选地pH 5-5.5。葡萄糖浓度为0-100mmol；优选地浓度100-200mmol；优选地浓度2500-1000mmol；优选地浓度1000-300mmol；最优选地浓度200-300mmol，预处理。处理时间为0-24h，优选地时间为0-2h；优选时间为24-15h；优选地时间为2-4h；优选地时间为15-6h；最优选地时间为4-6h。

2.解聚活化HrpWpst高聚态多表位蛋白对上述已预处理的高聚态蛋白预处理液，进行超高压解聚和活化的操作，超高压范围1000-3000Mpa，优选地3000Mpa；优选地1500Mpa；优选地2500Mpa；优选地2000Mpa；最优选地2000-2500Mpa；

3.后处理超高压解聚和活化的操作完成后，在35℃-38℃条件下静置0-24h，优选地时间为0-1h；优选地时间为24-10h；优选地时间为1-2h；优选地时间为10-4h；最优选地时间2-4h，然后收集解聚活化的HrpWpst多表位蛋白分子；

4.用NI-NTA亲和层析凝胶纯化高聚态HrpWpst多表位蛋白-His-Tag重组蛋白，蛋白纯化按NI-NTA亲和层析凝胶厂家建议方法实施，完成解聚活化多表位蛋白HrpWpst原药的纯化制备。

优选地，所述识别激活动物的多类受体、膜蛋白及其信号通路并诱发多功能级联生物学效应的HrpWpst多表位配体蛋白的制备：

1、所述HrpWpst多表位配体蛋白的制备，可以从来源于中国四川德阳什邡箭台村采集的“Pseudomonas_syringae_tomato”菌株的分泌蛋白中分离纯化HrpWpst蛋白，按照HrpWpst蛋白的特定分子量，可以采用通行的蛋白质分离纯化方法进行，再经过所建立的高聚态HrpWpst多表位蛋白分子的解聚和活化技术，收集解聚活化的HrpWpst纯化蛋白制品。

2、所述HrpWpst多表位配体蛋白的制备，还可以采用我们已注册的hrpWpst基因(W_Pseudomonas_syringae_tomato DC3000)的工程菌，通过发酵，纯化制备和收集解聚活化的HrpWpst蛋白，HrpWpst蛋白(NCBI Reference Sequence:WP_005763926.1)是hrpWpst基因(W_Pseudomonas_syringae_tomato DC3000)的表达产物：

1)HrpWpst蛋白的工程菌发酵制备：将编码HrpWpst蛋白的基因(包括，但不限于生物样品天然基因、化学合成基因、转基因遗传重组体基因以及相似基因及其基因修饰)的工程菌(E.coli)，相关蛋白的生产系是K-12原菌经特殊改造后的衍生菌JY-01(DE3)，在LB液体培养基(每升含卡那霉素50微克)中，在一定的温度下条件下，培养至OD600＝0.7时，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactosid)(终浓度1mMol)，继续培养后离心收集菌体。用10％SDS－PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表达产物HrpWpst蛋白，在电泳胶板的样品泳道上，会呈现一条68.3kda条带，它就是基因hrpWpst的表达产物HrpWpst蛋白；

其中，发酵用培养基Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲系统，缓冲系统的pH范围是1-14；优选地pH 1-3；优选地pH 14-10；优选地pH 4-5；优选地pH 9-7；最优选地pH 6.5-5.5；

发酵温度范围0-60℃。优选地温度为0-20℃；优选地温度为20-35℃；优选地温度为60-50℃；优选地温度为50-45℃；最优选地温度为37-38℃；

发酵增殖液体培养基葡萄糖浓度范围3.00％-0.00％；优选地3.00％-1.00％；优选地0.00％-0.01％；优选地1.00％-0.3％；最优选地0.01％-0.05％；最优选地pH0.1％-0.05％；

发酵诱导液体培养基葡萄糖浓度范围3.00％-0.00％；优选地3.00％-1.00％；优选地1.00％-0.3％；优选地0.3％-0.1％；优选地0.1％-0.05％；最优选地0.05％-0.00％；

发酵诱导液体培养基乳糖浓度范围10.00％-0.00％；优选地10.00％-1.00％；优选地0.00％-0.1％；优选地1.00％-0.6％；优选地0.1％-0.3％；最优选地0.5％-0.4％；

发酵诱导液体培养时间范围0-24h；优选地时间0-2h；优选地时间为24-15h；优选地时间为2-6h；优选地时间为15-10h；最优选地时间为7-9h。

2)工程菌生产系在多表位蛋白生产发酵结束后的后处理：①灭菌发酵液在80℃温度下，30分钟完成灭菌处理，迅速降温至30℃以下；②清洗用葡萄糖Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液(pH范围是1-14，葡萄糖浓度范围是0-2500mmol，缓冲系统pH 1-3；优选地pH 14-10；优选地pH 4-5；优选地pH 9-6；最优选地pH 5-5.5。葡萄糖浓度为0-100mmol；优选地浓度为100-200mmol；优选地浓度为2500-1000mmol；优选地浓度为1000-300mmol；最优选地浓度为200-300mmol，在蝶式连续流离心机里清洗工程菌体五至八次；③破碎工程菌并清除细胞壁，再用pH 5-5.5、葡萄糖浓度200-300mmol的Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液稀释菌体，调节菌体鲜重为稀释液的20％-30％，导入高压破碎机，连续用800-1000Mpa压力，破碎工程菌，将破碎菌液通入蝶式连续流离心机，清除细胞壁，收集高聚态HrpWpst多表位蛋白分子；

3)高聚态HrpWpst多表位蛋白分子的解聚和活化(I)预处理用葡萄糖Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液调节发酵收集的高聚态HrpWpst多表位蛋白的体积浓度范围0％-30％，优选地浓度0％-5％；优选地浓度30％-20％；优选地浓度5％-10％；优选地浓度20％-15％；最优选地浓度10％-15％。在常温(20-30℃)条件下，用预处理葡萄糖Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液，pH范围是1-14，葡萄糖浓度范围是0-2500mmol，缓冲系统pH，优选地pH 1-3；优选地pH 14-10；优选地pH4-5；优选地pH 9-6；最优选地pH 5-5.5。葡萄糖浓度为0-100mmol；优选地浓度100-200mmol；优选地浓度2500-1000mmol；优选地浓度1000-300mmol；最优选地浓度200-300mmol，预处理。处理时间为0-24h，优选地时间为0-2h；优选时间为24-15h；优选地时间为2-4h；优选地时间为15-6h；最优选地时间为4-6h。

(II)解聚活化HrpWpst高聚态多表位蛋白对上述已预处理的高聚态蛋白预处理液，进行超高压解聚和活化的操作，超高压范围1000-3000Mpa，优选地3000Mpa；优选地1500Mpa；优选地2500Mpa；优选地2000Mpa；最优选地2000-2500Mpa；

(III)后处理超高压解聚和活化的操作完成后，在35℃-38℃条件下静置0-24h，优选地时间为0-1h；优选地时间为24-10h；优选地时间为1-2h；优选地时间为10-4h；最优选地时间2-4h，然后收集解聚活化的HrpWpst多表位蛋白分子。

(IV)用NI-NTA亲和层析凝胶纯化高聚态多表位蛋白-His-Tag重组蛋白，蛋白纯化按NI-NTA亲和层析凝胶厂家建议方法实施，完成解聚活化HrpWpst蛋白的纯化制备。

3、所述HrpWpst多表位配体蛋白的制备，进一步，HrpWpst蛋白也可以通过“人工合成基因”的表达蛋白进行制备，通过发酵，纯化制备和收集解聚活化的HrpWpst蛋白，具体包括以下步骤：

编码HrpWpst蛋白的hrpWpst基因的人工合成及其表达蛋白制备，包括以下步骤：

1)按照现代生物信息学对GenBank公布的编码HrpWpst蛋白的hrpWpst基因核苷酸序列作为人工合成HrpWpst多表位蛋白基因，它的DNA序列来自于(NCBI ReferenceSequence:WP_005763926.1)：

编码HrpWpst蛋白基因的克隆：

根据编码HrpWpst蛋白基因hrpWpst的DNA序列，DNA序列如下：

设计及使用引物(下划线分别为BamHI和HindIII位点)：

5’-tgcggatccatgagcatcggcatcacaccccgg

5’-tgcaagctttcaaagctcggtgtgttgggtcga

2)根据以上DNA序列，人工合成蛋白基因时，在基因的5′和3′分别加上BamHI和HindIII酶切位点，方便蛋白基因克隆；

人工基因合成委托Thermo Fisher Scientific公司的GeneArt基因合成与服务部门完成。人工合成蛋白基因的优点主要是：a)合成周期短，可以保证序列的100％正确无误；b)可以对密码子进行优化，以提高基因的表达效率；由于每个物种偏爱的编码子不同，当异源蛋白在大肠杆菌里表达时，有些蛋白很难得到高表达。如果将异源蛋白的密码子改为大肠杆菌偏爱的密码子，就可以实现蛋白的基因的高效表达，提高该基因的表达水平，适于大规模工业生产；c)可根据需要进行基因的定点突变以改造基因，提高蛋白的作用效率；d)研究人员可根据自己的意愿设计得到自然界中很难获得甚至不存在的基因。

3)将合成的编码HrpWpst蛋白基因的DNA片段，逐一克隆到我们构建的高效蛋白表达载体JY-01(含His-Tag标签)BamHI-HindIII位点，经DNA测序确保克隆的准确性；

4)HrpWpst蛋白的工程菌发酵制备：将1)至3)编码HrpWpst蛋白的基因(包括，但不限于生物样品天然基因、化学合成基因、转基因遗传重组体基因以及相似基因及其基因修饰)克隆转入大肠杆菌工程菌(E.coli)中，相关蛋白的生产系(E.coli)是K-12原菌经特殊改造后的衍生菌JY-01(DE3)；在LB液体培养基(每升含卡那霉素50微克)中，在一定的温度下条件下，培养至OD600＝0.7时，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactosid)(终浓度1mmol)，继续培养后离心收集菌体，用10％SDS－PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析编码HrpWpst蛋白，在电泳胶板的样品泳道上，会呈现一条68.3kda条带，它就是基因hrpWpst的表达产物HrpWpst蛋白。

其中，发酵用培养基Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲系统，缓冲系统的pH范围是1-14；优选地pH 1-3；优选地pH 14-10；优选地pH 4-5；优选地pH 9-7；最优选地pH 6.5-5.5；

发酵温度范围0-60℃。优选地温度为0-20℃；优选地温度为20-35℃；优选地温度为60-50℃；优选地温度为50-45℃；最优选地温度为37-38℃；

发酵增殖液体培养基葡萄糖浓度范围3.00％-0.00％；优选地3.00％-1.00％；优选地0.00％-0.01％；优选地1.00％-0.3％；优选地0.01％-0.05％；最优选地pH0.1％-0.05％；

发酵诱导液体培养基葡萄糖浓度范围3.00％-0.00％；优选地3.00％-1.00％；优选地1.00％-0.3％；优选地0.3％-0.1％；优选地0.1％-0.05％；最优选地0.05％-0.00％；

发酵诱导液体培养基乳糖浓度范围10.00％-0.00％；优选地10.00％-1.00％；优选地0.00％-0.1％；优选地1.00％-0.6％；优选地0.1％-0.3％；最优选地0.5％-0.4％；

发酵诱导液体培养时间范围0-24h；优选地时间0-2h；优选地时间为24-15h；优选地时间为2-6h；优选地时间为15-10h；最优选地时间为7-9h。

5)工程菌生产系在多表位蛋白生产发酵结束后的后处理：①灭菌发酵液在80℃温度下，30分钟完成灭菌处理，迅速降温至30℃以下；②清洗用葡萄糖Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液(pH范围是1-14，葡萄糖浓度范围是0-2500mmol，缓冲系统pH 1-3；优选地pH 14-10；优选地pH 4-5；优选地pH 9-6；最优选地pH 5-5.5。葡萄糖浓度为0-100mmol；优选地浓度为100-200mmol；优选地浓度为2500-1000mmol；优选地浓度为1000-300mmol；最优选地浓度为200-300mmol，在蝶式连续流离心机里清洗工程菌体五至八次；③破碎工程菌并清除细胞壁，再用pH 5-5.5、葡萄糖浓度200-300mmol的Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液稀释菌体，调节菌体鲜重为稀释液的20％-30％，导入高压破碎机，连续用800-1000Mpa压力，破碎工程菌，将破碎菌液通入蝶式连续流离心机，清除细胞壁，收集高聚态HrpWpst多表位蛋白分子。

6)高聚态HrpWpst多表位蛋白分子的解聚和活化

(I)预处理用葡萄糖Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液调节发酵收集的高聚态HrpWpst多表位蛋白的体积浓度范围0％-30％，优选地浓度0％-5％；优选地浓度30％-20％；优选地浓度5％-10％；优选地浓度20％-15％；最优选地浓度10％-15％。在常温(20-30℃)条件下，用预处理葡萄糖Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液，pH范围是1-14，葡萄糖浓度范围是0-2500mmol，缓冲系统pH，优选地pH 1-3；优选地pH 14-10；优选地pH4-5；优选地pH 9-6；最优选地pH 5-5.5。葡萄糖浓度为0-100mmol；优选地浓度100-200mmol；优选地浓度2500-1000mmol；优选地浓度1000-300mmol；最优选地浓度200-300mmol，预处理。处理时间为0-24h，优选地时间为0-2h；优选时间为24-15h；优选地时间为2-4h；优选地时间为15-6h；最优选地时间为4-6h。

(II)解聚活化HrpNEcb高聚态多表位蛋白对上述已预处理的高聚态蛋白预处理液，进行超高压解聚和活化的操作，超高压范围1000-3000Mpa，优选地3000Mpa；优选地1500Mpa；优选地2500Mpa；优选地2000Mpa；最优选地2000-2500Mpa；

(III)后处理超高压解聚和活化的操作完成后，在35℃-38℃条件下静置0-24h，优选地时间为0-1h；优选地时间为24-10h；优选地时间为1-2h；优选地时间为10-4h；最优选地时间2-4h，然后收集解聚活化的HrpNEcb多表位蛋白分子。

(IV)用NI-NTA亲和层析凝胶纯化高聚态多表位蛋白-His-Tag重组蛋白，蛋白纯化按NI-NTA亲和层析凝胶厂家建议方法实施，完成解聚活化HrpWpst蛋白的纯化制备；

与现有的技术相比本发明的有益效果是：

HrpWpst蛋白作为一类富含多个线性和构象表位特殊结构的配体蛋白分子，能够跨界识别、激活、结合多种类型的动物的膜受体、膜蛋白、信息通路和代谢通路，HrpWpst蛋白是一类具有特殊多表位结构、全新功能、全新作用机制和全新应用前景的配体蛋白，它们诱导的多方向、多层次和多方面的生物学效应和功能，广泛涉及多系统、多组织、多器官、多细胞相关疾病和状况的诊断、或和预防、或和治疗、或和康复以及广泛涉及有关疾病和状况的食字号、消字号、妆字号、械字号和健字号制品及药物的制药中的应用。

附图说明

图1为HrpWpst蛋白解聚前后的电泳检测：左边为分子量标识带，1：解聚活化纯化前多表位配体蛋白HrpWpst条带；2：解聚活化纯化后多表位配体蛋白HrpWpst条带；

图2为HrpNEcb蛋白液注射诱导烟草叶片过敏反应图:其中所见焦斑处是经过HarpinWpst蛋白液处理24h所形成，1、2：H₂O注射；3、4、5：HarpinWpst蛋白液注射，浓度按顺序分别为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml；

图3为本发明的HrpWpst蛋白口服和喷涂小鼠诱导激活肝脏的相关差异基因火山图，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h；

图4为本发明的HrpWpst蛋白口服和喷涂小鼠诱导激活大脑丘脑的相关差异基因火山图，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h；

图5为本发明的HrpWpst蛋白通过口服和涂抹实验鼠诱导心脏表达差异基因火山图，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h、涂抹12h；

图6为本发明的HrpWpst蛋白通过口服和涂抹实验鼠诱导大脑皮层表达差异基因火山图，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h、涂抹12h；

图7为本发明的HrpWpst蛋白口服和涂抹实验鼠诱导大脑海马表达差异基因火山图，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h、涂抹12h；

图8为本发明的HrpWpst蛋白口服和喷涂小鼠诱导激活肝脏的相关差异基因集聚类热图，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h；(处理组左3道，对照组右4道)；

图9为本发明的HrpWpst蛋白口服和涂抹实验鼠诱导大脑丘脑表达差异基因集聚类热图，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h；(处理组左3道，对照组右4道)；

图10为本发明的HrpWpst蛋白口服和涂抹实验鼠诱导大脑皮层表达差异基因集聚类热图，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h、涂抹12h；(处理组左3道，对照组右3道)；

图11为本发明的HrpWpst蛋白口服和涂抹实验鼠诱导大脑海马表达差异基因集聚类热图，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h、涂抹12h；(处理组左3道，对照组右3道)；

图12为本发明的HrpWpst蛋白处理肝脏与对照比较KEGG Pathway(总基因)，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h；

图13为本发明的HrpWpst蛋白处理肝脏与对照比较KEGG Pathway(上调基因)，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h；

图14为本发明的HrpWpst蛋白处理肝脏与对照比较KEGG Pathway(下调基因)，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h；

图15为本发明的HrpWpst蛋白处理大脑丘脑与对照比较KEGG Pathway(总基因)，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h；

图16为本发明的HrpWpst蛋白处理大脑丘脑与对照比较KEGG Pathway(上调基因)，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h；

图17为本发明的HrpWpst蛋白处理大脑丘脑与对照比较KEGG Pathway(下调基因)，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h；

图18为本发明的HrpWpst蛋白处理心脏与对照比较KEGG Pathway(总基因)，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h、涂抹12h；

图19为本发明的HrpWpst蛋白处理心脏与对照比较KEGG Pathway(上调基因)，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h、涂抹12h；

图20为本发明的HrpWpst蛋白处理心脏与对照比较KEGG Pathway(下调基因)，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h、涂抹12h；

图21为本发明的HrpWpst蛋白处理大脑皮层与对照比较KEGG Pathway(总基因)，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h、涂抹12h；

图22为本发明的HrpWpst蛋白处理大脑皮层与对照比较KEGG Pathway(上调基因)，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h、涂抹12h；

图23为本发明的HrpWpst蛋白处理大脑皮层与对照比较KEGG Pathway(下调基因)，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h、涂抹12h；

图24为本发明的HrpWpst蛋白处理大脑海马与对照比较KEGG Pathway(总基因)，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h、涂抹12h；

图25为本发明的HrpWpst蛋白处理大脑海马与对照比较KEGG Pathway(上调基因)，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h、涂抹12h；

图26为本发明的HrpWpst蛋白处理大脑海马与对照比较KEGG Pathway(下调基因)，自左至右依次为口服6h、口服24h；涂抹6h、涂抹12h；

图27为本发明的mRNA(RNA-Seq)测序实验流程图；

图28为本发明的mRNA测序数据分析流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊的说明，均可从商业途径得到。

实施例1

HrpWpst多表位配体蛋白采用已注册的GenBank公布的编码HrpWpst蛋白的hrpWpst基因(NCBI Reference Sequence:WP_005763926.1)的工程菌发酵，纯化制备和收集解聚活化的HrpWpst蛋白，具体包括以下步骤：

1)HrpWpst蛋白的工程菌发酵制备：将编码HrpWpst蛋白的基因(包括，但不限于生物样品天然基因、化学合成基因、转基因遗传重组体基因以及相似基因及其基因修饰)的工程菌(E.coli)，相关蛋白的生产系是K-12原菌经特殊改造后的衍生菌JY-01(DE3)，在LB液体培养基(每升含卡那霉素50微克)中，在一定的温度下条件下，培养至OD600＝0.7时，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactosid)(终浓度1mMol)，继续培养后离心收集菌体。用10％SDS－PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表达产物HrpWpst蛋白，在电泳胶板的样品泳道上，会呈现一条68.3kda条带，它就是基因hrpWpst的表达产物HrpWpst蛋白；其中，发酵用培养基Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲系统pH 6.5-5.5；发酵温度为37-38℃；发酵增殖液体培养基葡萄糖浓度0.01％-0.05％；发酵诱导液体培养基葡萄糖浓度0.05％-0.00％；发酵诱导液体培养基乳糖浓度0.5％-0.4％；发酵诱导液体培养时间为7-9h。

2)工程菌生产系在多表位蛋白生产发酵结束后的后处理：①灭菌：发酵液在80℃温度下，30分钟完成灭菌处理，迅速降温至30℃以下；②清洗：用葡萄糖Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液，pH 5-5.5，葡萄糖浓度200-300mmol，在蝶式连续流离心机里清洗工程菌体五至八次；③破碎工程菌并清除细胞壁，再用pH5-5.5、葡萄糖浓度200-300mmol的Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液稀释菌体，调节菌体鲜重为稀释液的20％-30％，导入高压破碎机，连续用800-1000Mpa压力，破碎工程菌，将破碎菌液通入蝶式连续流离心机，清除细胞壁，收集高聚态HrpWpst多表位蛋白分子。

3)高聚态HrpWpst多个表位蛋白分子的解聚和活化：①预处理：用葡萄糖Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液调节发酵收集的高聚态HrpWpst多表位蛋白的体积浓度为10％-15％，在常温(20-30℃)条件下，用预处理葡萄糖Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液，pH 5-5.5，葡萄糖浓度200-300mmol，预处理，处理时间4-6h；②解聚活化HrpNEcb高聚态多表位蛋白：对上述已预处理的高聚态蛋白预处理液，进行超高压解聚和活化的操作，超高压2000-2500Mpa；③后处理：超高压解聚和活化的操作完成后，在35℃-38℃条件下静置2-4h，然后收集解聚活化的HrpWpst多表位蛋白分子；④用NI-NTA亲和层析凝胶纯化高聚态多表位蛋白-His-Tag重组蛋白，蛋白纯化按NI-NTA亲和层析凝胶厂家建议方法实施，完成解聚活化的纯化HrpWpst蛋白制备。

实施例2

HrpWpst蛋白通过“人工合成基因”的表达蛋白进行制备，具体包括以下步骤：

第一步：编码HrpWpst蛋白的hrpWpst基因的人工合成；

1)按照现代生物信息学对GenBank公布的编码HrpWpst蛋白的hrpWpst基因核苷酸序列作为人工合成HrpWpst多表位蛋白基因

它的DNA序列来自于(NCBI Reference Sequence:WP_005763926.1)

编码HrpWpst蛋白基因的克隆：

根据编码HrpWpst蛋白基因hrpWpst的DNA序列，DNA序列如下：

设计及使用引物(下划线分别为BamHI和HindIII位点)：

5’-tgcggatccatgagcatcggcatcacaccccgg

5’-tgcaagctttcaaagctcggtgtgttgggtcga

用高保真Taq酶扩增所需供试编码HrpWpst蛋白全基因的DNA片段，PCR扩增按高保真Taq酶厂家建议的方法实施；

第二步：2)根据以上DNA序列，人工合成蛋白基因时，在基因的5′和3′分别加上BamHI和HindIII酶切位点，方便蛋白基因克隆；

第三步：人工基因合成委托Thermo Fisher Scientific公司的GeneArt基因合成与服务部门完成。3)将合成的编码HrpWpst蛋白基因的DNA片段，逐一克隆到我们构建的高效蛋白表达载体JY-01(含His-Tag标签)BamHI-HindIII位点，经DNA测序确保克隆的准确性；

第四步：将1)至3)编码HrpWpst蛋白的基因克隆转入大肠杆菌工程菌(E.coli)中，相关蛋白的生产系(E.coli)是K-12原菌经特殊改造后的衍生菌JY-01(DE3)；在LB液体培养基(每升含卡那霉素50微克)中，37℃条件下，培养至OD600＝0.7时，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactosid)(终浓度1mmol)，继续培养后离心收集菌体，用10％SDS－PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表达产物HrpWpst蛋白，在电泳胶板的样品泳道上，会呈现一条68.3kda条带，它就是基因hrpWpst的表达产物HrpWpst蛋白，详见图1；

其中发酵用培养基Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲系统，缓冲系统的pH6.5-5.5；发酵增殖液体培养基葡萄糖浓度为0.01％-0.05％；发酵诱导液体培养基乳糖浓度0.5％-0.4％；

第五步：将收集菌体悬浮到Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液中，在80℃温度下，30分钟完成灭菌处理，迅速降温至30℃，在蝶式连续流离心机里清洗工程菌体五至八次，导入高压破碎机，连续用800-1000Mpa压力下，破碎工程菌，将破碎菌液通入蝶式连续流离心机，清除细胞壁，收集高聚态HrpWpst多表位蛋白分子；

第六步：高聚态HrpWpst多表位蛋白分子的解聚和活化(I)预处理用葡萄糖Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液调节收集纯化的高聚态HrpWpst多表位蛋白的体积浓度10％-15％。在常温(20℃-30℃)条件下，用预处理葡萄糖Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液，pH 5-5.5。葡萄糖浓度为200-300mmol，预处理；处理时间为4-6h。

(II)解聚活化HrpWpst高聚态多表位蛋白对上述预处理得到的高聚态蛋白预处理液，进行超高压解聚和活化的操作，超高压范围2000-2500Mpa；

(III)后处理超高压解聚和活化的操作完成后，在35℃-38℃条件下静置2-4h，然后收集解聚活化的HrpWpst多表位蛋白分子。

(IV)用NI-NTA亲和层析凝胶纯化高聚态多表位蛋白-His-Tag重组蛋白，蛋白纯化按NI-NTA亲和层析凝胶厂家建议方法实施，完成解聚活化多表位蛋白HrpWpst的纯化制备。

10％SDS聚丙酰胺凝胶电泳检测高效表达的解聚活化蛋白-His-Tag重组条带，详见图1。

如图1所示，左面为分子量标识带；1处为解聚活化前的电泳谱带，对应分子量区聚集了较多的条带，也包括68.3kda条带；2处为解聚活化的纯化HrpWpst蛋白条带，分子量68.3kda，在配体蛋白对应分子量区，表明已经得到相应的解聚活化的纯化HrpWpst蛋白。

如图2所示，解聚活化的多表位配体蛋白的过敏实验检测：HrpWpst蛋白制剂以及无菌水处理后24hr的烟草叶片反应结果见图2，其中，3、4、5点为分别注射100μg·mL^-1、200μg·mL^-1、300μg·mL^-1的HrpWpst蛋白液100μL；1、2点为注射无菌水100μL为对照处理。HrpWpst蛋白液处理12h引起烟草叶片萎缩、塌陷，24hr该处枯死；水对照处理烟草叶片无过敏反应。可知随HarpinWpst蛋白浓度的增加，在烟草叶片上的超敏反应逐步增强。

解聚活化的多表位配体蛋白能普遍引发多种植物叶片发生超敏反应，供试植物种类可以是：烟草、辣椒、茄子、西红柿、土豆、草莓、黄瓜、空心菜、鸡冠花、玻璃海棠、九月菊、三色堇、胭脂花、矮牵牛、葡萄、月季、槐树、豌豆、桃树、一串红、丝瓜、四季豆、花椰菜、菠菜、油菜、薯蓣、豇豆、蚕豆、玉米、水稻、大豆、仙客来、桑树、南瓜、枇杷、椿树等36个种类的不同植物。

实施例3

动物实验mRNA(RNA-Seq)测序

mRNA-seq是通过逆转录过程将细胞产生的RNA转化为DNA(cDNA，互补，并对获得的cDNA进行文库构建)。然后对得到的DNA进行测序，并从观察到的特定DNA丰度中，从中推断细胞中mRNA的原始量，从而找到在实验条件下转录水平发生变化的基因或转录本，即差异表达。通过找到这些差异表达的基因和转录本，推断出不同条件的功能特征。我们采用RNA-seq技术，研究并证明HrpWpst蛋白诱导小鼠多个器官中多基因的差异表达。

1.实验动物样品处理

本实验委托上海华盈生物医药科技有限公司蛋白质谱技术平台实施。

实验样品处理：实验选用8周龄的balb/C的实验小鼠，分为HrpWpst蛋白处理组，包括口服6小时、24小时和涂抹6小时、12小时共4种处理，每种处理3只实验鼠，共计12只；空白对照组4只实验鼠；无HrpWpst蛋白的缓冲液对照假手术组，包括口服6小时、24小时和涂抹6小时、12小时共4种处理，每种处理4只实验鼠，共计16只实验鼠，三次重复；对实验处理组鼠用600mg·L^-1浓度的HrpWpst蛋白缓冲液饲喂和涂抹处理，缓冲液对照假手术组小鼠用缓冲液饲喂和涂抹处理，空白对照组小鼠不做任何处理。在相同饲养条件下，按不同时间，分别分组取小鼠大脑皮层、丘脑、大脑海马、肝脏、心脏等组织，进行RNA-Seq的测序及分析。

2.mRNA(RNA-Seq)测序

通过新一代测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有mRNA表达丰度，见图27mRNA(RNA-Seq)测序实验流程图。

I.RNA质检

采用miRNeasy Micro Kit(Cat#1071023Qiagen)并且根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的total RNA抽提。总RNA经NanoDrop ND-2000分光光度计及AgilentBioanalyzer 4200(Agilent technologies，Santa Clara，CA，US)进行质检，质检合格的RNA可进行后续的测序实验。

II.文库构建与质检

构建的文库使用

2.0Fluorometer检测浓度，Agilent2100检测大小。

III.上机测序

对质检合格的文库进行Illumina测序，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。

IV.mRNA测序数据分析按图28数据分析流程进行。

3.结果分析

1)HrpNEcb蛋白诱导的差异基因筛选

首先对fragment counts进行归一化，再根据假设检验模型计算p-value，最后对p-value多重假设检验校正，得到FDR值。FP KM值计算差异表达倍数(Fold-change)，使用edgeR软件。差异基因筛选条件如下：p-value<0.05且|Fold-change|>＝2。

2)HrpWpst蛋白诱导的差异基因火山图

采用差异基因火山图显示HrpWpst蛋白诱导的表达差异显著性基因的整体分布情况。横坐标：基因在不同样本中的表达倍数变化(log2 Fold-Chan ge)；纵坐标：基因表达差异的显著性水平(-log10 p-value)；右侧点表达显著上调基因；左侧点表达显著下调基因；下部点表达变化不显著基因。图3-7分别为小鼠的肝脏、丘脑、心脏、大脑皮层及大脑海马HrpWpst蛋白通过口服和涂抹诱导的差异基因火山图，图中HarpinWpst缩写为W1。

3)HrpWpst蛋白诱导的差异基因聚类图

差异基因集进行聚类分析，将表达模式相近的基因聚在一起，显示基因具有共同功能或参与到共同信号通路。将log10(FPKM+1)值进行归一化转换(scale number)并进行聚类，热图中红色表示高表达，蓝色表示低表达。图8-11分别为肝脏、丘脑、海马、大脑皮层表达差异基因集聚类热图，图中HarpinWpst缩写为W1。

4)HrpWpst蛋白诱导的差异基因GO富集分析

基因本体(Gene Ontology，GO)是一个在生物信息学领域中广泛使用的本体。基因本体论是对基因在不同维度和不同层次上的描述，涵盖了生物学的生物过程(biological_process)，细胞组分(cellular_component)及分子功能(molecular_function)。生物过程是在说明该基因参与了哪些生物学过程；细胞组分解释的是基因存在在哪里，包括该基因在细胞质还是在细胞核？如果存在细胞质那在哪个细胞器上？如果是在线粒体中那是存在线粒体膜上还是在线粒体的基质当中等等，这些信息都属于细胞组；分子功能解释的是该基因在分子层面的功能是什么？描述其在个体分子生物学上的活性，如催化活性或结合活性。基因本体数据库(Gene Ontology)是GO组织(Gene Ontology Consortium)在2000年构建的一个结构化的标准生物模型，旨在建立基因及其产物知识的标准词汇体系，涵盖了基因的生物学过程(biological process)，细胞组分(cellular component)、分子功能(molecular function)。Term是GO里面的基本描述单元。GO Terms用于描述基因产物的功能。通过将差异基因做GO富集分析，可以把基因按照不同的功能进行归类，达到对基因进行注释和分类的目的。我们对HrpWpst蛋白诱导的差异表达基因进行了GO term富集分析，其结果证明、证实了HrpWpst蛋白作为一类具有多表位特殊结构，全新功能，全新作用机制和全新应用前景的配体蛋白，诱导了小鼠多个器官(肝脏、大脑丘脑、心脏、大脑皮层及大脑海马)多基因的差异表达，这些差异表达基因涵盖了生物过程、细胞组分及分子功能。HrpWpst蛋白诱导的差异基因GO富集分析结果进一步表述如下：①生物过程(biological_process)相关差异表达基因包括了繁殖，细胞死亡，免疫系统的过程，行为，代谢过程，细胞过程，生殖过程，生物粘附，信号，多细胞生物过程，发育过程，增长，运动，单个组织的过程，生物相，有节奏的过程，生物过程的正调控，生物过程负调控，生物过程调节，刺激反应，定位，生物调节，细胞成分组织或生物发生，细胞聚集，解毒以及突触前过程涉及突触传递。生物过程GO富集分析结果详见表1至表6。②细胞组分(cellular_component)相关差异表达基因涵盖了细胞及细胞外区域，类核，膜，病毒粒子，细胞结，细胞外基质，细胞膜封闭腔，复杂大分子，细胞器，细胞外基质成分，细胞外区域部分，细胞器部件，病毒粒子部件，膜部件，突触部分，细胞部件，突触，以及细胞超分子纤维等。细胞组分GO富集分析结果详见表1至表6。③分子功能(molecular function)相关差异表达基因涵盖了转录因子活性，蛋白质结合，核酸结合转录因子活性，催化活性，信号传感器活动，结构分子活动，运输活动，绑定，电子载体活动，成形素活动，抗氧化活性，金属伴侣蛋白活性，蛋白质标记，化学引诱物的活动，转译调控，化学排斥物活性，活动分子传感器，分子功能调控等。分子功能GO富集分析结果详见表1至表6。

基因本体(Gene Ontology，GO)是一个在生物信息学领域中广泛使用的本体，以涵盖生物学的细胞组分、分子功能、生物过程这三个层次对应的p-value小于0.05的GOterms分类基因数统计表1-6。

其中，表1-6需要说明的是HarpinWpst缩写为HrpW1，所有表格中，空格表示没有收集到对应的未达到p-value小于0.05标准的相关数据，以下及其所有表格空白含义与此相同。

表1 HarpinWpst蛋白诱导肝脏、心脏的生物学过程、细胞组分和分子功能相关功能群显著上调表达GO terms分类基因数统计表(口服6、24小时和涂抹6小时、涂抹12小时)

表2 HarpinWpst蛋白诱导皮层的生物学过程、细胞组分和分子功能相关功能群显著上调表达GO terms分类基因数统计表(口服6、24小时和涂抹6小时、涂抹12小时)

表3 HarpinWpst蛋白诱导丘脑、海马的生物学过程、细胞组分和分子功能相关功能群显著上调表达GO terms分类基因数统计表(口服6、24小时和涂抹6小时、涂抹12小时)

表4 HarpinWpst蛋白诱导肝脏、心脏的生物学过程、细胞组分和分子功能相关功能群显著下调表达GO terms分类基因数统计表(口服6、24小时和涂抹6小时、涂抹12小时)

表5 HarpinWpst蛋白诱导皮层的生物学过程、细胞组分和分子功能相关功能群显著下调表达GO terms分类基因数统计表(口服6、24小时和涂抹6小时、涂抹12小时)

表6 HarpinWpst蛋白诱导丘脑、海马的生物学过程、细胞组分和分子功能相关功能群显著下调表达GO terms分类基因数统计表(口服6、24小时和涂抹6小时、涂抹12小时)

5.差异表达基因的KEGG pathway富集分析

京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)，是系统分析基因功能与基因组信息的数据库，它整合了基因组学、生物化学和系统功能组学的信息，有助于研究者把基因及表达信息的过程作为一个网络进行整体研究。

KEGG主要的特点是将基因与各种生化反应联系在了一起，提供整合的代谢途径。KEGG目前共包含了19个子数据库，它们被分类为系统信息、基因组信息和化学信息三个类别。在生物体内，不同的基因产物相互协调来行使生物学功能，对差异表达基因的通路(Pathway)注释分析有助于进一步解读基因的功能。我们对HrpWpst蛋白诱导的差异表达基因进行了KEGG pathway富集分析，获得这些差异基因在信号通路中的角色(上下游关系)和生物学功能，深入理解基因与功能的关系。研究结果证明、证实了HrpNEcb蛋白作为一类具有多表位特殊结构，全新功能，全新作用机制和全新应用前景的配体蛋白，诱导了小鼠多个器官(肝脏、大脑丘脑、心脏、大脑皮层及大脑海马)多基因的差异表达，这些差异表达基因参与了归属于细胞过程(Cellular Processes)、环境信息处理(EnvironmentalInformation Processing)、遗传信息处理(Genetic Information Processing)、新陈代谢(Metabolism)和生物体系统(Organismal Systems)等功能途径。HrpWpst蛋白诱导的差异基因GO富集分析结果进一步表述如下：①细胞过程(Cellular Processes)：HrpWpst蛋白诱导的多个差异表达基因参与了运输和分解代谢，细胞群体，细胞活性，细胞生长与死亡等细胞过程(详见图12至图26)。②环境信息处理(Environmental Information Processing):HrpWpst蛋白诱导的多个差异表达基因参与了信号分子与相互作用，信号转导，膜运输等环境信息处理过程(详见图12至图26)。③遗传信息处理(Genetic InformationProcessing):HrpWpst蛋白诱导的多个差异表达基因参与了翻译，复制和修复，折叠、分类和降解等生物过程(详见图12至图26)。④新陈代谢(Metabolism):HrpWpst蛋白诱导的多个差异表达基因参与了生物降解和代谢，核苷酸代谢，其他氨基酸的代谢，代谢的辅助因子和维生素，脂质代谢，糖的生物合成和代谢，全局和概览地图，能量代谢，碳水化合物代谢及氨基酸代谢等代谢过程(详见图12至图26)。⑤生物体系统(Organismal Systems):HrpWpst蛋白诱导的多个差异表达基因参与了感觉系统，神经系统，免疫系统，排泄系统，环境适应，内分泌系统，消化系统，发育循环系统等细胞过程(详见图12至图26)。

与GO分类统计类似，对KEGG各个生物学途径(pathway)上的差异表达基因数目进行统计并以图形展示如图12-26所示。

说明：图形右边示图，从上到下中文译名：细胞过程、信息过程、遗传信息过程、代谢过程、组织系统发育过程；横坐标：涉及表达差异的各功能基因群的基因数目；纵坐标：涉及表达差异的细胞过程、信息过程、遗传信息过程、代谢过程、组织系统发育过程的功能基因群。

实施例4

HrpWpst蛋白识别结合特异蛋白的pull-down实验

1.样品准备和处理

1)HrpWpst蛋白纯化

用NI-NTA亲和层析凝胶纯化高聚态HrpWpst多表位蛋白-His-Tag重组蛋白，蛋白纯化按NI-NTA亲和层析凝胶厂家建议方法实施，完成解聚活化多表位蛋白HrpWpst的纯化制备，备用(以下称为捕获蛋白或目的蛋白)。

2)实验用培养肝细胞总蛋白(钓饵蛋白)抽提

I.细胞总蛋白的抽提：①用移液枪吸取裂解液(IP专用裂解液，加入1×cocktail蛋白酶抑制剂)加入到细胞。超声，冰上静置2h以上；②使用超声细胞破碎仪，冰上超声2s，停5s，共1min，冰上裂解总时长2h以上(间隔30min振荡器震荡混匀)；③将细胞裂解产物4℃下13000rpm离心15min，吸取上清转移至新的1.5mLEP管，冰上放置待用；④将蛋白抽提液再次于4℃下13000rpm离心5min，小心地吸取中间层的溶液，转移至新的1.5mL EP管中，4℃冰箱放置待用，并取部分稀释后测浓度(稀释10倍)，采用BCA法测定浓度。

II.蛋白浓度测定：参照BCA试剂盒的方法，对提取的蛋白溶液进行浓度测定。

表7 BCA法测定蛋白浓度

NO.	样本名称	实验编号	浓度(μg/μL)	体积(μL)	总量(μg)
						1	HEPG2	HEPG2	8.34	2500	20861.30

2.pull-down实验流程

1)平衡固定链霉亲和素凝胶:①准备Pierce TM Spin Column管；②上下颠倒重悬凝胶液，吸取50μl悬液于标记好的Spin Column管，塞好底塞并放置于收集管中；③再向Spin Column管中加入250μl TBS，拧紧顶盖，轻轻上下颠倒4次混匀液体；④去掉顶盖和底塞，1250×g离心50s，弃掉收集管中的清洗液，把SpinColumn管重新插入收集管中；⑤重复步骤3和步骤4两次。再在Spin Column管底部塞上管底塞。

2)生物素标记生物素标记钓饵蛋白和生物素的固定:①向Spin Column管中分别加入生物素和生物素标记钓饵蛋白，拧紧顶盖和底塞；②在旋转平台rotating platform上温和地摇动，4℃孵育60min；③孵育结束后，移去Spin Column管顶盖和底塞，放入收集管中；④1250×g，60s离心后，将Spin Column管重新放入收集管中。

3)生物素的封闭:①向Spin Column管中加入250μl生物素封闭溶液。拧紧顶盖和底塞，轻轻上下颠倒4次使之混匀；②室温下孵育5min。移去顶盖，将Spin Column管放于收集管中，1250×g离心50s；③重复步骤1和步骤2一次；④再向Spin Column管中加入TBS 250μl。拧紧顶盖，轻轻上下颠倒4次使之混匀；⑤移去顶盖，放于收集管中，1250×g离心50s；⑥重复步骤3和步骤4两次，Spin Column管重新放入收集管。

4)生物素标记生物素标记蛋白的捕获:①向Spin Column管中加入300μL(1mg蛋白)的捕获蛋白(目的蛋白)样品溶液，拧紧顶盖；②在旋转平台rotating platform上温和地摇动，4℃孵育过夜；③孵育结束后，移去顶盖和底塞。将Spin Column管放入准备好的收集管中；④将收集管，1250×g，60s，离心，收集管标记“prey flow-through(B)”；⑤移去收集管中Spin Column管，盖好收集管的盖子，冰上放置以便后续分析；⑥将Spin Column管放入新的收集管，准备洗脱。

5)Spin Column管的诱饵蛋白和靶蛋白复合物的洗脱:①在每个Spin Column管中加入250μl Wash Buffer。拧紧顶盖和底塞，轻轻颠倒6次使之混匀；②将Spin Column管在室温下孵育1分钟。将顶盖底塞去掉，将Spin Column管置于收集管上，1250×g离心50s。另外重复步骤1-2，3次；③在冲洗的过程中，在收集管上写上标签“Wash1，……，Wash3”；④最后一次冲洗时，加入200μl Wash Buffer后，将管内液体连同珠子一起转移至1.5mL；⑤新的离心管中，离心后弃170μl上清，该步骤重复3次。

6)检测：①吸干Sepharose上面的液体后，加入20μl 1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴5min，放入-20℃冰箱备用；②通过SDS-PAGE和Western blot进行检测。

3.结果分析

1)HrpWpst蛋白识别结合的细胞膜受体：识别结合5个膜受体，包括HLA-B主要组织相容性复合体，I，B类受体、LGALS3BP半乳糖3结合蛋白(受体)、LAMP2溶酶体相关膜蛋白2受体、游离脂肪酸受体4、酪氨酸蛋白激酶跨膜受体1。

2)HrpWpst蛋白识别结合的细胞膜蛋白：识别结合7个膜蛋白，包括PKP1血小板亲和蛋白1、pinin，桥粒相关蛋白、泛素特异性肽酶9、x连锁关联蛋白A(囊泡相关膜蛋白)、VCL黏着斑蛋白、富含脯氨酸小蛋白1A、TM9SF2跨膜9超家族成员2。

3)HrpWpst蛋白识别结合的信号通路：识别结合2条，包括hsa03320:PPAR信号通路、hsa05120:幽门螺杆菌感染的上皮细胞信号转导的信号通路。

4)HrpWpst蛋白识别结合的抗病毒、抗细菌、抗异物、抗炎性相关代谢通路：识别结合15条，包括hsa04144:内吞作用、hsa04145:吞噬体、hsa04666:Fc-r介导的吞噬作用、hsa01130:抗生素的生物合成、hsa05131:志贺氏菌病、hsa04612:抗原处理和呈递、hsa05130:致病性大肠杆菌感染、hsa05100:上皮细胞的细菌侵袭、hsa05132:沙门氏菌感染、hsa05169:巴尔病毒感染、hsa05168:单纯疱疹病毒1感染、hsa05203:病毒致癌作用。

5)HrpWpst蛋白识别结合的重要神经疾病代谢通道：识别结合3条，包括hsa05010:阿尔茨海默氏症、hsa05012:帕金森病、hsa05016:亨廷顿氏舞蹈症。

6)HrpWpst蛋白识别结合的核酸、蛋白质、氨基酸、糖、脂肪代谢相关通路：识别结合15条，包括hsa04110:细胞周期、hsa03030:DNA复制、hsa03013:RNA运输、hsa03018:RNA降解、hsa03040:剪接体、hsa03010:核糖体、hsa04141:内质网蛋白加工、hsa04810:肌动蛋白骨架的调控、hsa03050:蛋白酶体、hsa01230:氨基酸生物合成、hsa00190:氧化磷酸化、hsa04932:非酒精性脂肪肝(NAFLD)、hsa00020:柠檬酸循环(TCA循环)、hsa00640:丙酸新陈代谢、hsa01200:碳代谢。

7)HrpWpst蛋白识别结合的细胞联结、神经连结、血管、内分泌、生殖系统等代谢通路：无识别结合相关代谢通路。

HrpWpst蛋白，作为一类富含特殊多个线性和构象表位结构的配体蛋白分子，能够跨界识别、结合多种类型的膜受体、膜蛋白、信息通路和代谢通路，进一步分析这些膜受体、膜蛋白、信息通路和代谢通路的位置、结构、特性、作用机制和功能，它们广泛影响机体的生长、发育、代谢、防御和细胞程序性死亡的生命基本属性，并广泛涉及诊断、预防、治疗、康复神经系统、消化系统、运动系统、循环系统、呼吸系统、内分泌系统、免疫系统、泌尿系统、生殖系统、皮肤系统疾病和状况。HrpWpst蛋白是一类具有全新功能，全新作用机制和全新应用前景的特殊多表位配体蛋白。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

<110> 吴伯骥 吴保珍 昆明锐斯得科技有限公司

<120> HrpWpst蛋白在识别激活多类受体和/或膜蛋白及其信号通路的制药中的应用

<160> 1

<170> Patent In Version 2.1

<210> 1

<211> 424

<212> PRT

<213>HrpWpst（Pseudomonas_syringae_tomato DC3000（HrpWpst）gene（SEQ ID NO1）

<220> 1

<221> DOMAIN

<222> 保守区结构域(226)-( 409)；α-螺旋结构（18）-（20）、（42）-（44）、（76）-（98）、（409）-（413）；β-折叠结构（224）-（227）、（231）-（233）、（238）-（239）、（245）-（247）、（264）-（267）、（272）-（278）、（286）-（289）、（293）-（303）、（309）-（313）、（321）-（327）、（338）-（341）、（346）-（350）、（352）-（355）、（360）-（362）、（373）-（377）、（379）-（381）、（386）-（390）、（397）-（400）、（403）-（405）。

<400> 1

Met Ser Ile Gly Ile Thr Pro Arg Pro Gln Gln Thr Thr Thr Pro Leu

5 10 15

Asp Phe Ser Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Gln Pro Asn Thr Phe Gly

20 25 30

Glu Gln Asn Thr Gln Gln Ala Ile Asp Pro Ser Ala Leu Leu Phe Gly

35 40 45

Ser Asp Thr Gln Lys Asp Val Asn Phe Gly Thr Pro Asp Ser Thr Val

50 55 60

Gln Asn Pro Gln Asp Ala Ser Lys Pro Asn Asp Ser Gln Ser Asn Ile

65 70 75 80

Ala Lys Leu Ile Ser Ala Leu Ile Met Ser Leu Leu Gln Met Leu Thr

85 90 95

Asn Ser Asn Lys Lys Gln Asp Thr Asn Gln Glu Gln Pro Asp Ser Gln

100 105 110

Ala Pro Phe Gln Asn Asn Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ala Asp Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Thr Pro Asp Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asp Thr

130 135 140

Pro Ser Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asp Thr Pro Thr Ala Thr Gly

145 150 155 160

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Pro Thr Ala Thr Gly Gly Gly

165 170 175

Ser Gly Gly Thr Pro Thr Ala Thr Gly Gly Gly Glu Gly Gly Val Thr

180 185 190

Pro Gln Ile Thr Pro Gln Leu Ala Asn Pro Asn Arg Thr Ser Gly Thr

195 200 205

Gly Ser Val Ser Asp Thr Ala Gly Ser Thr Glu Gln Ala Gly Lys Ile

210 215 220

Asn Val Val Lys Asp Thr Ile Lys Val Gly Ala Gly Glu Val Phe Asp

225 230 235 240

Gly His Gly Ala Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Met Gly Asn Gly Asp

245 250 255

Gln Gly Glu Asn Gln Lys Pro Met Phe Glu Leu Ala Glu Gly Ala Thr

260 265 270

Leu Lys Asn Val Asn Leu Gly Glu Asn Glu Val Asp Gly Ile His Val

275 280 285

Lys Ala Lys Asn Ala Gln Glu Val Thr Ile Asp Asn Val His Ala Gln

290 295 300

Asn Val Gly Glu Asp Leu Ile Thr Val Lys Gly Glu Gly Gly Ala Ala

305 310 315 320

Val Thr Asn Leu Asn Ile Lys Asn Ser Ser Ala Lys Gly Ala Asp Asp

325 330 335

Lys Val Val Gln Leu Asn Ala Asn Thr His Leu Lys Ile Asp Asn Phe

340 345 350

Lys Ala Asp Asp Phe Gly Thr Met Val Arg Thr Asn Gly Gly Lys Gln

355 360 365

Phe Asp Asp Met Ser Ile Glu Leu Asn Gly Ile Glu Ala Asn His Gly

370 375 380

Lys Phe Ala Leu Val Lys Ser Asp Ser Asp Asp Leu Lys Leu Ala Thr

385 390 395 400

Gly Asn Ile Ala Met Thr Asp Val Lys His Ala Tyr Asp Lys Thr Gln

405 410 415

Ala Ser Thr Gln His Thr Glu Leu

420

Claims (10)

1.HrpWpst蛋白在识别激活多类受体和/或膜蛋白及其信号通路并引起级联生物学效应的制药中的应用，所述HrpWpst蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的HrpWpst蛋白在识别激活多类受体和/或膜蛋白及其信号通路并引起级联生物学效应的制药中的应用，其特征在于，所述多类受体包括识别激活HLA-B主要组织相容性复合体、I，B类受体、LGALS3BP半乳糖3结合受体、LAMP2溶酶体相关膜蛋白2受体、游离脂肪酸受体4、酪氨酸蛋白激酶跨膜受体1中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的HrpWpst蛋白在识别激活多类受体和/或膜蛋白及其信号通路并引起级联生物学效应的制药中的应用，其特征在于，所述膜蛋白包括识别激活PKP1血小板亲和蛋白1、pinin桥粒相关蛋白、泛素特异性肽酶9、x连锁关联蛋白A、VCL黏着斑蛋白、富含脯氨酸小蛋白1A、TM9SF2跨膜9超家族成员2中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的HrpWpst蛋白在识别激活多类受体和/或膜蛋白及其信号通路并引起级联生物学效应的制药中的应用，其特征在于，所述信号通路包括识别激活hsa03320:PPAR信号通路、hsa05120:幽门螺杆菌感染的上皮细胞信号转导的信号通路中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的HrpWpst蛋白在识别激活多类受体和/或膜蛋白及其信号通路并引起级联生物学效应的制药中的应用，其特征在于，所述信号通路包括代谢信号通路，代谢信号通路包括抗病毒、抗细菌、抗异物、抗炎性代谢通路，重要神经疾病代谢通道；核酸、蛋白质、氨基酸、糖、脂肪代谢通路；细胞联结、神经连结、血管、内分泌、生殖系统代谢通路。

6.根据权利要求1所述的HrpWpst蛋白在识别激活多类受体和/或膜蛋白及其信号通路并引起级联生物学效应的制药中的应用，其特征在于，所述抗病毒、抗细菌、抗异物、抗炎性相关代谢通路：hsa04144:内吞作用、hsa04145:吞噬体、hsa04666:Fc-r介导的吞噬作用、hsa01130:抗生素的生物合成、hsa05131:志贺氏菌病、hsa04612:抗原处理和呈递、hsa05130:致病性大肠杆菌感染、hsa05100:上皮细胞的细菌侵袭、hsa05132:沙门氏菌感染、hsa05169:巴尔病毒感染、hsa05168:单纯疱疹病毒1感染、hsa05203:病毒致癌作用；所述重要神经疾病代谢通道：hsa05010:阿尔茨海默氏症、hsa05012:帕金森病、hsa05016:亨廷顿氏舞蹈症；所述核酸、蛋白质、氨基酸、糖、脂肪代谢相关通路：hsa04110:细胞周期、hsa03030:DNA复制、hsa03013:RNA运输、hsa03018:RNA降解、hsa03040:剪接体、hsa03010:核糖体、hsa04141:内质网蛋白加工、hsa04810:肌动蛋白骨架的调控、hsa03050:蛋白酶体、hsa01230:氨基酸生物合成、hsa00190:氧化磷酸化、hsa04932:非酒精性脂肪肝(NAFLD)、hsa00020:柠檬酸循环(TCA循环)、hsa00640:丙酸新陈代谢、hsa01200:碳代谢；所述细胞联结、神经连结、血管、内分泌、生殖系统代谢通路。

7.根据权利要求1所述的HrpWpst蛋白在识别激活多类受体和/或膜蛋白及其信号通路并引起级联生物学效应的制药中的应用，其特征在于，所述级联生物学效应包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、新陈代谢和生物体系统功能途径；其中，细胞过程包括HrpWpst蛋白诱导的多个差异表达基因参与了运输和分解代谢，细胞群体，细胞活性，细胞生长与死亡等细胞过程；环境信息处理包括HrpWpst蛋白诱导的多个差异表达基因参与了信号分子与相互作用，信号转导，膜运输环境信息处理过程；遗传信息处理包括HrpWpst蛋白诱导的多个差异表达基因参与了翻译，复制和修复，折叠、分类和降解生物过程；新陈代谢包括HrpWpst蛋白诱导的多个差异表达基因参与了生物降解和代谢，核苷酸代谢，氨基酸的代谢，代谢的辅助因子和维生素，脂质代谢，糖的生物合成和代谢，全局和概览地图，能量代谢，碳水化合物代谢及氨基酸代谢代谢过程；生物体系统包括HrpWpst蛋白诱导的多个差异表达基因参与了感觉系统，神经系统，免疫系统，排泄系统，环境适应，内分泌系统，消化系统，发育循环系统生物过程。

8.根据权利要求1所述的HrpWpst蛋白在识别激活多类受体和/或膜蛋白及其信号通路并引起级联生物学效应的制药中的应用，其特征在于，所述制药中的应用的制品或药物的剂型为液剂、粉剂、片剂或胶囊剂。

9.根据权利要求7所述的HrpWpst蛋白在识别激活多类受体和/或膜蛋白及其信号通路并引起级联生物学效应的制药中的应用，其特征在于，所述制品或药物主要由解聚活化的HrpWpst蛋白制备得到，质量含量为0.001％-100％。

10.基于权利要求1-9任一项所述的HrpWpst蛋白的解聚活化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：预处理：用葡萄糖Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液调节收集发酵制备的高聚态HrpWpst多表位蛋白的体积浓度范围0％30％，在20-30℃条件下，处理时间为0-24h；

步骤2：解聚活化HrpWpst高聚态多表位蛋白：对步骤1已预处理的高聚态蛋白预处理液，进行超高压解聚和活化的操作，超高压范围1000-3000Mpa；

步骤3：后处理：超高压解聚和活化的操作完成后，在35-38℃条件下静置0-24h，然后收集解聚活化的HrpWpst多表位蛋白分子；

步骤4：用层析凝胶纯化高聚态HrpWpst多个表位蛋白-His-Tag重组蛋白，得到解聚活化多表位蛋白HrpWpst原药。

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