CN112724230B - 一种角蛋白bd-3、制法和其药物组合物与用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种角蛋白BD‑3，编码角蛋白BD‑3的核酸分子，含有该核酸分子的表达载体，以及含有该表达载体或基因组整合该核酸分子的宿主细胞，以及角蛋白BD‑3的制备方法，含有角蛋白BD‑3的药物组合物，以及上述角蛋白BD‑3、核酸分子、表达载体、宿主细胞、或药物组合物在制备解热镇痛、镇咳祛痰、抗惊厥、抗癫痫、降血压、抗炎、抗病毒药物中的应用。

Description

一种角蛋白BD-3、制法和其药物组合物与用途

技术领域

本发明涉及一种角蛋白BD-3，编码角蛋白BD-3的核酸分子，含有该核酸分子的表达载体，以及含有该表达载体或基因组整合该核酸分子的宿主细胞，以及角蛋白BD-3的制备方法，含有这种角蛋白的药物组合物，以及这种角蛋白和所述药物组合物在制备解热镇痛、镇咳祛痰、抗惊厥、抗癫痫、降血压、抗炎、抗病毒药物中的应用。

背景技术

角蛋白是蛋白质的一种，广泛存在于人和动物的表皮，并且是毛发、羽毛、蹄、壳、爪、角等的主要成分，是结缔组织极重要的结构蛋白质，起着保护机体的作用。

角蛋白广泛存在于生物体中，是一种可再生资源，具有很大的利用价值，但并没有得到广泛有效的利用。主要原因是角蛋白不溶于各种溶剂，并且角蛋白一般都较其他蛋白质更耐蛋白酶的酶解。因此提取制备天然角蛋白的难度非常大。

随着基因组学、蛋白质组学、基因工程、微生物工程等现代生物技术的飞速发展，越来越多的基因被发现。而利用蛋白表达系统制备生产目的蛋白是研究基因或蛋白的生物功能的重要手段。

利用蛋白表达系统制备目的角蛋白，进而研究其结构与功能，未见其他文献报道，具有新颖性和创造性。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种角蛋白BD-3，编码角蛋白BD-3的核酸分子，含有该核酸分子的表达载体，以及含有该表达载体或基因组整合该核酸分子的宿主细胞，以及角蛋白BD-3的制备方法，含有角蛋白BD-3的药物组合物，以及上述角蛋白BD-3、核酸分子、表达载体、宿主细胞、或药物组合物在制备解热镇痛、镇咳祛痰、抗惊厥、抗癫痫、降血压、抗炎、抗病毒药物中的应用。

为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：

本发明技术方案的第一方面是提供了一种角蛋白BD-3，其特征在于，所述角蛋白BD-3的氨基酸序列为：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加1-35个氨基酸形成的基本上保持相同生物学功能的氨基酸序列。

进一步的，在角蛋白BD-3上可进行常规修饰；或者在角蛋白BD-3上还连接有用于检测或纯化的标签。

更进一步的，所述的常规修饰包括乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、固定化修饰、硫酸化、氧化、甲基化、脱氨化、形成二硫键或二硫键断裂；所述的标签包括His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、Profinity eXact。

本发明技术方案的第二方面是提供了一种编码第一方面所述角蛋白BD-3的核酸分子。

进一步的，所述的核酸分子的核苷酸序列为：

(1)序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(2)基于SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行序列优化得到的核苷酸序列；

(3)与上述(1)或(2)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明技术方案的第三方面是提供了一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有第二方面所述的核酸分子。

进一步的，表达载体可以为pET系列、pUC系列、pQE系列、pBV系列、pMAL系列，pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1、pPICZα/A、pYAM75P，pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10、pGAPZ、pGAPZa、pPIC3.5K等；优选的表达载体为pET系列载体；最优选的表达载体为pET-28a(+)。

本发明技术方案的第四方面是提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有第三方面所述的表达载体或者基因组中整合有第二方面所述的核酸分子。

进一步的，所述的宿主细胞包括细菌、酵母、曲霉菌、植物细胞、或昆虫细胞。

更进一步的，所述的细菌包括大肠杆菌或酵母。

感受态宿主细胞可以为BL21系列，Transetta系列，Rosetta系列，DH5α系列，JM系列，Top系列，Orgami系列，Trans1-T1，TG1，TB1；Y11430，MG1003，GS115(AOX1)，KM71，SMD1168等；优选的表达感受态细胞为BL21(DE3)，Transetta(DE3)。

本发明技术方案的第五方面是提供了一种制备第一方面所述角蛋白BD-3的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.合成第一方面所述的角蛋白BD-3对应的核酸分子，将核酸分子连入相应的表达载体，将表达载体转化到宿主细胞，在一定条件下在发酵设备中培养带表达载体的宿主细胞并诱导表达角蛋白BD-3，得到含有角蛋白BD-3的粗蛋白溶液；

B.对步骤A中所表达的粗蛋白溶液进行分离纯化干燥得到角蛋白BD-3。

进一步的，在步骤A中，所述的宿主细胞主要为选自大肠杆菌，所述的角蛋白BD-3在大肠杆菌包涵体中表达，所述的发酵设备包括摇瓶或发酵罐。

进一步的，在步骤A中，诱导表达角蛋白BD-3后，可用清洗剂清洗杂质，用溶液溶解得到粗蛋白溶液。

进一步的，步骤A中的培养基可以为LB培养基、TB培养基、SB培养基、SOB培养基、SOC培养基，PDA培养基、YPD培养基、孟加拉红培养基、高盐察氏培养基、DOBA培养基、米曲培养基及其改良配方等；摇瓶发酵优选LB培养基、TB培养基，最优选为TB培养基；发酵罐优选LB培养基及其改良配方。

进一步的，步骤A中的诱导剂可以为IPTG、乳糖、阿拉伯糖等；优选为IPTG、乳糖。

进一步的，步骤A中，获得的发酵菌液，离心，弃去上清液；沉淀悬浮于缓冲液中，破碎菌体，再离心，弃去上清液；沉淀用清洗剂清洗后，再用尿素溶液溶解，得到BD-3粗蛋白溶液。

其中，缓冲液优选为buffer A，其用量为：发酵液体积：buffer A体积＝1～100∶1，优选为10∶1；

清洗剂可以为尿素溶液、盐酸胍溶液、Triton、buffer A等，优选为尿素溶液，最优选为2M尿素溶液(可含有1％Triton)，其用量为：发酵液体积：2M尿素体积＝0.2～100∶1，优选为1～15∶1；

尿素溶液优选为8M尿素溶液，其用量为：发酵液体积：8M尿素体积＝0.2～100∶1，优选为2～15∶1。

进一步的，在步骤B中，所述的分离纯化的方法包括超滤微滤膜技术纯化方法、柱色谱纯化方法、盐析方法、透析方法。

进一步的，步骤B中，分离纯化方法如下：

(1)所述透析方法，即将步骤A中获得的粗蛋白溶液用透析的方法纯化，得到目标蛋白BD-3溶液。

透析袋截留分子量可以为0.5-10kD，优选的透析袋截留分子量为3.5-10kD，最优选的透析袋截留分子量为10kD。

(2)所述超滤微滤方法，即将步骤A中获得的粗蛋白溶液用超滤膜或微滤膜等膜技术纯化，得到目标蛋白BD-3浓缩溶液。

优选的是两次微滤膜纯化，第一次膜孔径1000～1500nm，第二次膜孔径20～50nm。

(3)所述柱色谱方法，即将步骤A中获得的粗蛋白溶液通过柱色谱，例如各种交换柱或排阻柱色谱，分离纯化得到目标蛋白BD-3。

优选的排阻柱是葡聚糖凝胶柱，Superdex 30Increase，Superdex 75Increase，Superdex 200Increase，Superose 6Increase等；优选的交换柱是离子交换树脂柱：阴离子交换树脂柱，HiTrap Q FF，HiTrap Capto Q ImpRes，Capto Q ImpRes，HiTrap Capto Q，HiTrap DEAE，Toyopearl Q-650M，Toyopearl SuperQ-650M等；阳离子交换树脂柱，HiTrapSP FF，HiTrap Capto SP ImpRes，Capto SP ImpRes，HiTrap Capto SP，Toyopearl SP-650M，Toyopearl Super SP-650M。最优选的是阴离子交换树脂柱。

洗脱剂可以使用本领域常用的洗脱剂，例如水、盐溶液，所述盐溶液包括氯化钠溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、醋酸钠、醋酸等。

(4)所述盐析方法，即将步骤A中获得的粗蛋白溶液中用盐析的方法纯化，得到目标蛋白BD-3混悬液。

盐析剂可以为硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、氯化镁、硫酸铝，硝酸铵、氯化铵、硫酸镁等。优选的盐析剂为硫酸铵及其水溶液。加入饱和硫酸铵水溶液使硫酸铵终浓度达到10～50％，优选为20～30％，更优选为25％。

盐析次数为1～3次，优选为2次。

盐析后沉淀加入纯水清洗，清洗次数为2～5次，优选为3次。

进一步的，步骤B纯化得到的目标蛋白BD-3溶液可经冷冻干燥或真空干燥成干粉，也可将浓缩液直接喷雾干燥成干粉。

本发明技术方案的第六方面是提供了一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有第一方面所述的角蛋白BD-3或第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明上述步骤中得到的角蛋白可经冷冻干燥或真空干燥成干粉，也可把浓缩液体直接喷雾干燥成干粉，然后制成各种剂型。

本发明涉及一种药物组合物，包括上述步骤中得到的任意一种角蛋白及药学上可接受的载体。

本发明还涉及含有作为活性成份的本发明角蛋白以及常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明角蛋白占药物组合物总重量的0.1～100.0％。

本发明还提供一种药物组合物，它包括药物有效剂量的作为活性成分的蛋白质及药学上可接受的载体。

本发明所述的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明蛋白质与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明角蛋白或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺、皮肤、阴道、腹膜、直肠等，优选口服给药。

本发明角蛋白或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、腹腔注射和穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括水包油型、油包水型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等。固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明角蛋白可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯毗咯烷酮、聚乙二丙醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯毗咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与构椽酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、月桂酸聚乙二醇甘油酯、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄菩胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。

为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明角蛋白与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明角蛋白制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明角蛋白制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、l,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的角蛋白或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明角蛋白药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明角蛋白组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明角蛋白的每天的合适剂量范围：本发明的角蛋白的用量为0.01～500mg/kg体重，优选为0.5～100mg/kg体重，更优选为1～50mg/kg体重，最优选为2～30mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药，这取决于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。每一种治疗所需总剂量可分成多次或按一次剂量给药。本发明的蛋白质或药物组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。

本发明技术方案的第七方面是提供了第一方面所述的角蛋白BD-3或第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞或第六方面所述的药物组合物在制备解热、镇痛、镇咳、祛痰、抗惊厥、抗癫痫、降血压、抗炎、抗病毒药物中的应用。

为了完成本发明之目的，本发明采取如下技术方案，具体地讲，制备本发明角蛋白BD-3，包括如下步骤：

(1)合成核苷酸序列，并测定序列的准确性；

优选的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

(2)将核苷酸序列转入表达载体中；

表达载体可以为pET系列、pUC系列、pQE系列、pBV系列、pMAL系列，pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1、pPICZα/A、pYAM75P，pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10、pGAPZ、pGAPZa、pPIC3.5K等；优选的表达载体为pET系列载体；最优选的表达载体为pET-28a(+)。

(3)将表达载体转染入宿主细胞中；

宿主细胞可以为大肠杆菌或酵母；优选的宿主细胞为大肠杆菌；

感受态细胞可以为BL21系列，Transetta系列，Rosetta系列，DH5α系列，JM系列，Top系列，Orgami系列，Trans1-T1，TG1，TB1；Y11430，MG1003，GS115(AOX1)，KM71，SMD1168等；优选的表达感受态细胞为BL21(DE3)，Transetta(DE3)。

(4)将在适当的条件下，发酵培养宿主细胞，诱导表达目标蛋白BD-3；

发酵设备可以采用摇瓶或发酵罐；

培养基可以为LB培养基、TB培养基、SB培养基、SOB培养基、SOC培养基，PDA培养基、YPD培养基、孟加拉红培养基、高盐察氏培养基、DOBA培养基、米曲培养基及其改良配方等；摇瓶发酵优选LB培养基、TB培养基，最优选为TB培养基；发酵罐优选LB培养基及其改良配方。

诱导剂可以为IPTG、乳糖、阿拉伯糖等；优选为IPTG、乳糖。

(5)目标蛋白BD-3产物富集；

步骤(4)获得的发酵菌液，离心，弃去上清液；沉淀悬浮于缓冲液中，破碎菌体，再离心，弃去上清液；沉淀用清洗剂清洗后，再用尿素溶液溶解，得到BD-3粗蛋白溶液。

其中，缓冲液优选为buffer A，其用量为：发酵液体积：buffer A体积＝1～100∶1，优选为10∶1；

清洗剂可以为尿素溶液、盐酸胍溶液、Triton、buffer A等，优选为尿素溶液，最优选为2M尿素溶液(可含有1％Triton)，其用量为：发酵液体积：2M尿素体积＝0.2～100∶1，优选为1～15∶1；

尿素溶液优选为8M尿素溶液，其用量为：发酵液体积：8M尿素体积＝0.2～100∶1，优选为2～15∶1。

(6)分离纯化目标蛋白BD-3：

步骤(5)获得的粗蛋白溶液，需经过纯化获得目标蛋白BD-3。所述纯化可以通过透析、或超滤微滤、或柱色谱、或盐析步骤进行。

A.所述透析步骤，即将步骤(5)获得的粗蛋白溶液用透析的方法纯化，得到目标蛋白BD-3溶液。

透析袋截留分子量可以为0.5-10kD，优选的透析袋截留分子量为3.5-10kD，最优选的透析袋截留分子量为10kD。

B.所述超滤微滤步骤，即将步骤(5)获得的粗蛋白溶液用超滤膜或微滤膜等膜技术纯化，得到目标蛋白BD-3浓缩溶液。

优选的是两次微滤膜纯化，第一次膜孔径1000～1500nm，第二次膜孔径20～50nm。

C.所述柱色谱步骤，即将步骤(5)获得的粗蛋白溶液通过柱色谱，例如各种交换柱或排阻柱色谱，分离纯化得到目标蛋白BD-3。

优选的排阻柱是葡聚糖凝胶柱，Superdex 30Increase，Superdex 75Increase，Superdex 200Increase，Superose 6Increase等；优选的交换柱是离子交换树脂柱：阴离子交换树脂柱，HiTrap Q FF，HiTrap Capto Q ImpRes，Capto Q ImpRes，HiTrap Capto Q，HiTrap DEAE，Toyopearl Q-650M，Toyopearl SuperQ-650M等；阳离子交换树脂柱，HiTrapSP FF，HiTrap Capto SP ImpRes，Capto SP ImpRes，HiTrap Capto SP，Toyopearl SP-650M，Toyopearl Super SP-650M。最优选的是阴离子交换树脂柱。

洗脱剂可以使用本领域常用的洗脱剂，例如水、盐溶液，所述盐溶液包括氯化钠溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、醋酸钠、醋酸等。

D.所述盐析步骤，即将步骤(5)获得的粗蛋白溶液中用盐析的方法纯化，得到目标蛋白BD-3混悬液。

盐析剂可以为硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、氯化镁、硫酸铝，硝酸铵、氯化铵、硫酸镁等。优选的盐析剂为硫酸铵及其水溶液。加入饱和硫酸铵水溶液使硫酸铵终浓度达到10～50％，优选为20～30％，更优选为25％。

盐析次数为1～3次，优选为2次。

盐析后沉淀加入纯水清洗，清洗次数为2～5次，优选为3次。

步骤A～D纯化得到的目标蛋白BD-3溶液可经冷冻干燥或真空干燥成干粉，也可将浓缩液直接喷雾干燥成干粉。

本发明的有益技术效果：

1、本发明蛋白为首次获得的角蛋白，本发明的制备方法具备收率高、样品纯度高的特点。

2、本发明通过蛋白BD-3对脂多糖(LPS)诱导的SD大鼠发热模型的药效试验研究，证明蛋白BD-3在造模后2小时、4小时具有显著的降低体温升高的作用；通过蛋白BD-3对酵母诱导的SD大鼠发热模型的药效试验研究，证明蛋白BD-3在造模后2小时、4小时，均可显著抑制体温升高，且作用较强；

3、本发明通过蛋白BD-3对致惊剂匹罗卡品(PLO)致小鼠惊厥和癫痫的药效试验研究，证明蛋白BD-3能够显著延长小鼠癫痫III级和IV级发作潜伏期；

4、本发明通过蛋白BD-3对小鼠酚红排泄法祛痰的药效试验研究，证明蛋白BD-3具有明显的祛痰作用；

5、本发明通过蛋白BD-3对小鼠氨水引咳法镇咳的药效试验研究，证明蛋白BD-3能够显著延长潜伏期，明显减少咳嗽次数，具有显著的镇咳作用；

6、本发明通过蛋白BD-3对ICR小鼠醋酸扭体的药效试验研究，证明蛋白BD-3能明显减少小鼠扭体次数，具有显著的镇痛作用。

附图说明

图1：表达蛋白BD-3还原型SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析(M：蛋白分子量标准；S：表达蛋白BD-3)

图2.蛋白BD-3对脂多糖(LPS)诱导大鼠发热模型的影响

(与正常对照组比较，***P<0.001；与模型组比较，##P<0.01，###P<0.001)

图3.蛋白BD-3对酵母诱导大鼠发热模型的影响

(与正常对照组比较，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001)

具体实施方式

下面的实施例及药理活性试验例用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。

下述实施例及药理活性试验例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。

实施例1摇瓶发酵制备蛋白BD-3粗溶液A(TB培养基)

合成如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，将其转入pET-28a(+)载体中；测序确定得到含有正确序列的表达载体；将表达载体转染入BL21(DE3)细胞，得到含有目标核苷酸序列的表达感受态宿主细胞。加入LB培养基中，于摇床中，在37℃、220rpm条件下培养1小时，得到重组菌株。

蘸取重组菌株在含有Kana霉素的LBA平板中划线，平板倒置于37℃恒温培养箱过夜培养16小时。

配置400ml TB培养基，分装2瓶，每瓶200ml。在每瓶(200ml)TB培养基中加入Kana霉素(终浓度50μg/ml)，取平板上单一菌落加入TB培养基中，于摇床中，在37℃、220rpm条件下过夜扩增培养，得到种子液。

配置28.8L TB培养基，分装于144瓶，每瓶200ml。在每瓶(200ml)TB培养基中加入Kana霉素(终浓度50μg/ml)，再加入2ml种子液，于摇床中，在37℃、220rpm条件下培养2-3小时。监测OD₆₀₀，当OD₆₀₀达到1.0左右时，加入诱导剂，于摇床中诱导表达蛋白，诱导条件选自下表。

合并各瓶菌液，7000rpm离心5分钟，上清液灭菌后弃去；沉淀悬浮于约3L缓冲液中，用80-100目筛网过滤，滤液用高压破碎仪破碎，压力800-1000bar，2次，每次2分钟。破碎后菌液7000rpm离心30分钟，弃去上清液，得到沉淀(即包涵体)。沉淀加入1L清洗剂清洗2次，离心，弃去上清液。沉淀再加入尿素溶液溶解4次，分别为800ml、600ml、400ml、400ml。合并4次溶液，7000rpm离心30分钟，沉淀弃去，上清液即为蛋白粗溶液A。

蛋白BD-3粗溶液A，用还原型SDS-PAGE分析，分离胶浓度为12.5％，考马斯亮蓝R250法染色；在分子量43kD附近显示明显蓝色条带。

实施例2摇瓶发酵制备蛋白BD-3粗溶液B(其它培养基)

实施例1中合成并测序确定得到含有如SEQ ID No.2所示的序列的表达载体；将表达载体转染入BL21(DE3)细胞，得到含有目标核苷酸序列的表达感受态宿主细胞。

配制20ml LB培养基，取800μl，加入含有目标编码序列的宿主细胞50μl，于摇床中，在37℃、220rpm条件下培养1小时。

蘸取上述菌液在含有Kana霉素的LBA平板中划线，平板倒置于37℃恒温培养箱过夜培养16小时。

取10ml LB培养基，加入Kana霉素(终浓度50μg/ml)，取平板上单一菌落加入LB培养基中，于摇床中，在37℃、220rpm条件下过夜扩增培养15小时，得到种子液。

配置1L下表所示培养基，分装于10瓶，每瓶100ml。在每瓶(100ml)培养基中加入Kana霉素(终浓度50μg/ml)，再加入1ml种子液，于摇床中，在37℃、220rpm条件下培养2-3小时。监测OD₆₀₀，当OD₆₀₀达到1.0左右时，加入诱导剂IPTG(终浓度0.5mM)，于摇床中，在37℃、220rpm条件下诱导表达蛋白。

培养基	LB培养基、SOB培养基、SOC培养基

合并各瓶菌液，10000rpm离心10分钟，上清液灭菌后弃去；沉淀悬浮于约100mL缓冲液中，用80-100目筛网过滤，滤液用高压破碎仪破碎，压力800-1000bar，2次，每次2分钟。破碎后菌液10000rpm离心30分钟，弃去上清液。

沉淀先加入40mL清洗剂buffer A清洗3次，离心，弃去上清液；沉淀加入40mL清洗剂2M尿素溶液清洗2次，离心，弃去上清液；沉淀再加入40mL 4M尿素溶液清洗2次，离心，弃去上清液；沉淀再加入8M尿素溶液(含50mM Tris/HCl缓冲液)溶解3次，分别为40ml、30ml、30ml；合并溶液，7000rpm离心30分钟，沉淀弃去，上清液即为蛋白粗溶液B。

蛋白BD-3粗溶液B，用还原型SDS-PAGE分析，分离胶浓度为12.5％，考马斯亮蓝R250法染色；在分子量43kD附近显示明显蓝色条带。

实施例3发酵罐制备蛋白BD-3粗溶液C

实施例1中合成并测序确定得到含有如SEQ ID No.2所示的序列的表达载体；将表达载体转染入BL21(DE3)细胞，得到含有目标核苷酸序列的表达感受态宿主细胞。加入LB培养基中，于摇床中，在37℃、220rpm条件下培养1小时，得到重组菌株。

在含有Kana霉素的LBA平板中，加入重组菌株100μl，涂布器涂至均匀变干，平板倒置于37℃恒温培养箱过夜培养。分别取三个单菌落在含有Kana霉素的平板中划线，平板过夜培养，经三批摇瓶发酵表达验证确认无误后，用15％甘油保存菌株，分装成每支0.8ml，即得工作细胞库，冻存于-80℃冰箱备用。

从工作细胞库中取出1支甘油菌，取100μl，加入40ml LB培养基中，加入Kana霉素(终浓度50μg/ml)，于振荡器中，以37℃、220rpm条件培养6小时，得一级种子液。

取一级种子液1.2ml，加入120ml LB培养基中，加入Kana霉素(终浓度50μg/ml)，于振荡器中，以37℃、220rpm条件培养7小时，得二级种子液。

5L发酵罐中加入3L改良的LB培养液，再加入120ml二级种子液，3ml Kana霉素(终浓度50μg/ml)，以37℃、溶氧30％(串联转速)条件培养约8小时。监测OD值在20左右，3g乳糖作为诱导剂，于20℃进行诱导，以30ml/小时的速率进行补料，20℃培养24小时。

菌液7000rpm离心5分钟，上清液灭菌后弃去；沉淀悬浮于约200ml buffer A中，用80-100目筛网过滤，滤液用高压破碎仪破碎，压力800-1000bar，2次，每次2分钟。破碎后菌液7000rpm离心30分钟，弃去上清液。

沉淀加入2M尿素溶液(含1％Triton)清洗2次，每次1L；再加入1L 2M尿素溶液清洗1次，离心，弃去上清液。沉淀加入8M尿素溶液溶解4次，分别为400ml、300ml、200ml、100ml。合并四次溶液，7000rpm离心30分钟，沉淀弃去，上清液即为蛋白粗溶液C。

蛋白BD-3粗溶液C，用还原型SDS-PAGE分析，分离胶浓度为12.5％，考马斯亮蓝R250法染色；在分子量43kD附近显示明显蓝色条带。

实施例4蛋白粗溶液A通过透析制备得蛋白BD-3

实施例1获得的蛋白粗溶液A用0.45μm l滤膜过滤，合并滤液。滤液用水透析，透析袋截留分子量10kD，透析72小时，内液冷冻干燥，即得目标蛋白BD-3；电泳测得纯度96.5％。

蛋白BD-3结构确证：

1、还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分析

仪器：蛋白质电泳仪(Bio-Rad)。

方法和结果：蛋白BD-3溶液，用还原型SDS-PAGE分析，分离胶浓度为12.5％，考马斯亮蓝R250法染色。BD-3条带分子量在43kD附近。

2、基于LC-MS/MS的蛋白质全序列分析

主要材料：乙腈、甲酸、碳酸氢铵、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、胰蛋白酶、糜蛋白酶、Glu-C、Asp-N；

主要仪器：毛细管高效液相色谱仪(Thermo Ultimate 3000型)，电喷雾-组合型离子阱Orbitrap质谱仪(Thermo Q Exative Hybrid Quadrupole-Orbitrap MassSpectrometer)。

方法和结果：

蛋白BD-3通过溶解置换、还原烷基化、多种蛋白酶解等前处理，得到酶切肽段；酶切肽段溶液，经液相色谱串联质谱分析，质谱原始文件使用Maxquant(1.6.2.10)检索蛋白数据库分析数据，鉴定结果确定其与目标序列SEQ ID No.1一致。

实施例5蛋白粗溶液A通过其它方法纯化制备得蛋白BD-3

实施例1获得的蛋白粗溶液A通过下述两种方法进行纯化：

第一种方法：盐析；

蛋白粗溶液A置于带搅拌的容器中进行两次盐析：沿壁缓慢加入硫酸铵饱和溶液，使硫酸铵终浓度为25％或50％，盐析过程中蛋白析出，待盐析完全后，过滤，完成第一次盐析；沉淀中加入400ml纯水混悬，再次沿壁缓慢加入硫酸铵饱和溶液，使硫酸铵终浓度为25％，进行第二次盐析，过滤，沉淀即为蛋白粗提物。蛋白粗提物用水进行三次清洗：加200ml纯水混悬，搅拌，静置，过滤；如此重复三次后，沉淀冷冻干燥即得目标蛋白BD-3。

第二种方法：柱色谱；

蛋白粗溶液A分别经过HiTrap Q FF 16/10，HiTrap Capto Q ImpRes，Capto QImpRes，HiTrap Capto Q，HiTrap DEAE等阴离子交换树脂柱纯化。洗脱液为NaCl溶液梯度洗脱，加20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液(pH 8.0)。各洗脱流份用SDS-PAGE电泳检测合并，合并的洗脱液7000rpm离心2次，每次1小时；上清液用0.45μm滤膜过滤，合并滤液。滤液用水透析浓缩，透析袋截留分子量10kD，内液冷冻干燥，即得目标蛋白BD-3。

两种方法得到的产物蛋白BD-3，经与实施例4相同的结构确证方法，确认其与实施例4制备得到的蛋白具有相同的氨基酸序列。

实施例6蛋白粗溶液B纯化制备得蛋白BD-3

实施例2获得的蛋白粗溶液B通过下述三种方法进行纯化：

第一种方法：透析；

蛋白粗溶液B，用0.45μm膜过滤，滤液用水透析，透析72小时以上，内液冷冻干燥，即得目标蛋白BD-3。

透析袋	截留分子量：0.5kD、3.5kD、5kD、10kD

第二种方法：柱色谱；

蛋白粗溶液B分别经过HiTrap Q FF 16/10，HiTrap Capto Q ImpRes，Capto QImpRes，HiTrap Capto Q，HiTrap DEAE等阴离子交换树脂柱纯化。洗脱液为NaCl溶液梯度洗脱，加20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液(pH 8.0)。各洗脱流份用SDS-PAGE电泳检测合并，合并的洗脱液7000rpm离心2次，每次1小时；上清液用0.45μm滤膜过滤，合并滤液。滤液用水透析浓缩，透析袋截留分子量10kD，内液冷冻干燥，即得目标蛋白BD-3。

第三种方法：盐析；

蛋白粗溶液B置于带搅拌的容器中进行两次盐析：沿壁缓慢加入硫酸铵饱和溶液，使硫酸铵终浓度为25％或50％，盐析过程中蛋白析出，待盐析完全后，过滤，完成第一次盐析；沉淀中加入400ml纯水混悬，再次沿壁缓慢加入硫酸铵饱和溶液，使硫酸铵终浓度为25％，进行第二次盐析，过滤，沉淀即为蛋白粗提物。蛋白粗提物用水进行三次清洗：加200ml纯水混悬，搅拌，静置，过滤；如此重复三次后，沉淀冷冻干燥即得目标蛋白BD-3。

三种方法得到的产物蛋白BD-3，经与实施例4相同的结构确证方法，确认其与实施例4制备得到的蛋白具有相同的氨基酸序列。

实施例7蛋白粗溶液C纯化制备得蛋白BD-3

实施例3获得的蛋白粗溶液C通过下述两种方法进行纯化：

第一种方法：微滤膜技术；

蛋白粗溶液C，通过微滤膜技术进行纯化：先用1500nm或1000nm陶瓷膜芯进行固液分离；内液弃去，外液再用20nm或50nm陶瓷膜芯反复微滤除去尿素；二次微滤的内液冷冻干燥，即得目标蛋白BD-3。

第二种方法：盐析；

蛋白粗溶液C置于带搅拌的容器中进行两次盐析：沿壁缓慢加入硫酸铵饱和溶液，使硫酸铵终浓度为25％，盐析过程中蛋白析出，待盐析完全后，过滤，完成第一次盐析；沉淀中加入400ml纯水混悬，再次沿壁缓慢加入硫酸铵饱和溶液，使硫酸铵终浓度为25％，进行第二次盐析，过滤，沉淀即为蛋白粗提物。蛋白粗提物用水进行三次清洗：加200ml纯水混悬，搅拌，静置，过滤；如此重复三次后，沉淀冷冻干燥即得目标蛋白BD-3。

两种方法得到的产物蛋白BD-3，经与实施例4相同的结构确证方法，确认其与实施例4制备得到的蛋白具有相同的氨基酸序列。

药理试验

实验例1蛋白BD-3(实施例4蛋白)对脂多糖(LPS)诱导SD大鼠发热模型的药效试验动物：雄性SD大鼠230-260克；

药品：脂多糖(LPS，SIGMA L-2880)，阿司匹林(SIGMA A2093)，蛋白BD-3；

仪器：电子天平(SARTORIUS BP121S型)，电子体温计(CITIZEN CT-513W型)。

实验分组：

正常对照组；

模型组：脂多糖发热模型；

阳性对照组：阿司匹林(Aspirin)300mg/kg组；

蛋白BD-3，10mg/kg组，50mg/kg组。

方法：腹腔注射脂多糖复制大鼠发热模型方法：

实验动物的准备：实验动物在实验环境(温度22℃±2℃，相对湿度50％±2％)中适应1天后，分别于早8:00及15:00预适应测量肛温操作，实验前12小时禁食不禁水，测定肛温前让动物排空粪便。每次测温前电子体温计探头涂抹凡士林，插入大鼠直肠2cm(可在2cm处标记，确保每次插入深度一致)，待读数稳定以后记录体温值。

腹腔注射脂多糖复制大鼠发热模型：造模前测大鼠体温，筛选出体温在36.2-37.3℃的合格大鼠，随机分组，每组8只。口服给予阿司匹林及不同剂量蛋白BD-3后立即腹腔注射脂多糖(20μg/kg，2ml/kg)，正常对照组腹腔注射等体积生理盐水，2小时后开始监测大鼠体温，共监测8小时。

数据统计：

根据实验当天测量的各时间点体温值，计算各组大鼠体温均值、标准差及标准误，应用TTEST将各组数据进行组间比较，P<0.05认为有显著性差异。

实验结果：

口服给予阿司匹林(300mg/kg)、蛋白BD-3(10mg/kg、50mg/kg)后立即腹腔注射20μg/kg脂多糖造模，分别于造模后2小时、4小时、6小时、8小时监测动物体温。结果见表1和图2。

表1.受试药对脂多糖(LPS)诱导大鼠发热模型的影响

(与正常对照组比较，***P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001)实验结论：

分别口服给予阿司匹林(300mg/kg)、蛋白BD-3(10mg/kg、50mg/kg)后立即腹腔注射20μg/kg脂多糖造模，并于造模后2小时、4小时、6小时、8小时监测动物体温，结果显示：

1)腹腔注射20μg/kg脂多糖可成功诱导大鼠体温升高，模型组大鼠在造模2小时、4小时、6小时、8小时体温明显升高，与正常组比较，P<0.05，有统计学差异，模型稳定。

2)阳性工具药阿司匹林组在造模2小时、4小时、6小时、8小时均可以有效抑制模型大鼠体温升高，与模型组比较，P<0.05，有统计学差异，阳性工具药表现较稳定。

3)蛋白BD-3 50mg/kg剂量组在造模后2小时、4小时可降低模型大鼠体温，且与模型组比较，P<0.05，有统计学差异。

实验例2蛋白BD-3(实施例4蛋白)对酵母诱导SD大鼠发热模型的药效试验

动物：雄性SD大鼠230-260克；

药品：酵母菌(OXOID LP0021)，阿司匹林(SIGMA A2093)，蛋白BD-3；

仪器：电子天平(SARTORIUS BP121S型)，电子体温计(CITIZEN CT-513W型)。

实验分组：

正常对照组；

模型组：酵母菌发热模型；

阳性对照组：阿司匹林(Aspirin)300mg/kg组；

蛋白BD-3，10mg/kg组，50mg/kg组。

方法：

实验动物的准备：实验动物在实验环境(温度22℃±2℃，相对湿度50％±2％)中适应1天后，分别于早8:00及15:00进行预适应测量肛温操作，实验前12小时禁食不禁水，测定肛温前让动物排空粪便。每次测温前电子体温计探头涂抹凡士林，插入大鼠直肠2cm(可在2cm处标记，确保每次插入深度一致)，待读数稳定以后记录体温值。

皮下注射干酵母复制大鼠发热模型：造模前测大鼠体温，筛选出体温在36.2-37.3℃的合格大鼠，随机分组，每组8只。口服给予阿司匹林、不同剂量蛋白BD-3后立即皮下注射20％酵母菌混悬液(10ml/kg)，正常对照组皮下注射等体积生理盐水，2小时后开始监测大鼠体温，每间隔2小时监测体温1次，共监测8小时。

数据统计：

根据实验当天测量的各时间点体温值，计算各组大鼠体温均值、标准差及标准误，应用TTEST将各组数据进行组间比较，P<0.05认为有显著性差异。

实验结果：

口服给予阿司匹林(300mg/kg)、蛋白BD-3(10mg/kg、50mg/kg)后立即皮下注射20％酵母菌造模，分别于造模后2小时、4小时、6小时、8小时监测动物体温。结果见表2和图3。

表2.受试药对酵母菌诱导大鼠发热模型的影响

(与正常对照组比较，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001)实验结论：

口服给予阿司匹林(300mg/kg)、蛋白BD-3(10mg/kg、50mg/kg)后立即皮下注射20％酵母菌造模，分别于造模后2小时、4小时、6小时、8小时监测动物体温。

结果显示：

1)模型组大鼠在造模2小时、4小时、6小时、8小时体温明显升高，与正常组比较，P<0.05，有统计学差异，模型建立成功且稳定可靠。

2)阳性工具药阿司匹林组在造模4小时、6小时、8小时均可以有效抑制模型大鼠体温升高，与模型组比较，P<0.05，有统计学差异，阳性工具药阿司匹林表现稳定。

3)不同剂量蛋白BD-3在造模后2小时、4小时均可明显抑制模型大鼠体温升高，且与模型组比较，P<0.05，有统计学差异。

实验例3蛋白BD-3(实施例4蛋白)对致惊剂匹罗卡品(Pilocarpine，PLO)致小鼠惊厥癫痫的药效试验

动物：雄性ICR小鼠；

药品：Pilocarpine HCl(PLO，匹罗卡品，盐酸毛果芸香碱)，Diazepam(地西泮片)，蛋白BD-3。

实验分组：

模型组；

地西泮(Diazepam)2mg/kg组；

蛋白BD-3，50mg/kg组，200mg/kg组。

方法：

模型制备及给药：

造模前一天下午给药一次，造模当天灌胃受试药后1小时腹腔注射PLO-225mg/kg(造模剂)，阳性药在造模前20分钟给药一次即可。注射PLO后持续观察30分钟。

观察指标：①癫痫发作情况：Ⅱ级～Ⅳ级发作时间；②死亡时间。

发作级别：参照Racine分级标准：0级：没有任何反应；I级：表现为面部肌肉或是嘴角的抽动；II级：可以点头；III级：一侧肢体抽搐；IV级：强直或全身肢体抽搐；V级：癫痫全面大发作(全身强直性惊厥发作)。

数据处理：

统计实验中各组小鼠IV级发作及死亡例数；II级、III级及IV级潜伏期，未发作至IV级的小鼠潜伏期记作最大值1800秒。例数统计用卡方检验统计。潜伏期计算均值及标准误，应用TTEST，将模型组与其他各组进行组间比，P<0.05认为有显著性差异。

实验结果：见表3和表4。

表3.受试药对PLO致小鼠癫痫实验－例数统计

组别	实验例数	IV级例数	IV级发作率	死亡例数	死亡率
						模型组	10	8	80％	0	0
地西泮2mg/kg	10	0**	0**	0	0
						BD-3-50mg/kg	10	3	30％	0	0
BD-3-200mg/kg	10	6	60％	0	0

(与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01)

表4.受试药对PLO致小鼠癫痫实验－II级，III级及IV级癫痫发作潜伏期(mean±SEM)

组别	II级发作潜伏期(s)	III级发作潜伏期(s)	IV级发作潜伏期(s)
				模型组	86±5	142±6	894±164
地西泮2mg/kg	109±8*	182±14*	1800±0**
				BD-3-50mg/kg	91±6	155±12	1573±138**
BD-3-200mg/kg	99±5	183±12**	1181±203

(与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01)

实验结论：

1)实验结果显示，模型组IV级发作率为80％。40只小鼠无死亡。

2)阳性药可以完全抑制癫痫IV级发作率，并显著延长小鼠II级、III级及IV级癫痫发作潜伏期。

3)在癫痫III级潜伏期比较中，BD-3 200mg/kg剂量组与模型组比较均有统计学差异；在癫痫IV级潜伏期比较中，BD-3 50mg/kg剂量组与模型组比较均有统计学差异。

实验例4蛋白BD-3(实施例4蛋白)对戊四唑(PTZ)致小鼠癫痫的药效试验动物：雄性ICR小鼠；

药品：戊四唑(PTZ)，瑞替加滨，蛋白BD-3。

实验分组：

模型组；

瑞替加滨60mg/kg组；

蛋白BD-3，50mg/kg组，200mg/kg组。

方法：

模型制备及给药：

造模前一天下午给药一次，造模当天灌胃受试药后1小时腹腔注射PTZ-65mg/kg(造模剂)，阳性药在造模前半小时给药一次即可。注射PTZ后持续观察15分钟。观察指标：①癫痫发作情况：Ⅲ级～Ⅵ级发作时间；②死亡情况发作级别：参照Racine分级标准：0级：没有任何反应；I级：表现为面部肌肉或是嘴角的抽动；Ⅱ级：可以点头；Ⅲ级：一侧肢体抽搐；Ⅳ级：强直或全身肢体抽搐；V级：癫痫全面大发作(全身强直性惊厥发作)。

数据处理：

统计实验中各组小鼠发作及死亡例数；Ⅲ级及Ⅳ级潜伏期，未发作至Ⅳ级的小鼠潜伏期记作最大值900秒。例数统计用卡方检验统计。潜伏期计算均值及标准误，应用TTEST，将模型组与其他各组进行组间比，P<0.05认为有显著性差异。

实验结果：见表5和表6。

表5.受试药对PTZ致小鼠癫痫实验－例数统计

(与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01)

表6.受试药对PTZ致小鼠癫痫实验－III级及IV级癫痫发作潜伏期(mean±SEM)

组别	III级发作潜伏期(秒)	IV级发作潜伏期(秒)
			模型组	63±6	185±84
瑞替加滨60mg/kg	83±7*	745±103**
			BD-3-50mg/kg	75±6	162±58
BD-3-200mg/kg	62±5	327±125

(与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01)

实验结论：

1)实验结果显示，模型组IV级发作率为90％。40只小鼠有2只死亡。

2)阳性药可以显著降低癫痫IV级发作率，并显著延长小鼠III级及IV级癫痫发作潜伏期。

3)在癫痫IV级潜伏期比较中，BD-3 200mg/kg剂量组有延长潜伏期的趋势，但与模型组比较无统计学差异。

实验例5蛋白BD-3(实施例4蛋白)对小鼠酚红排泄法祛痰的药效试验动物：雄性ICR小鼠；

药品与试剂：沐舒坦(盐酸氨溴索片)，苯酚红，碳酸氢钠，蛋白BD-3；

仪器：离心机(Sigma-3K15型)，天平(XS105DU型)，酶标测试仪(BIO-TEK型)。

实验分组：

溶剂对照组；

沐舒坦30mg/kg组；

蛋白BD-3，20mg/kg组，50mg/kg组。

方法：

模型制备及给药：

动物于实验前16小时禁食不禁水。按分组口服给予沐舒坦及不同剂量蛋白BD-3(给药体积10ml/kg)，溶剂对照组给予等量体积蒸馏水，1小时后腹腔注射2.5％酚红溶液，30分钟后脱颈处死小鼠，取自甲状软骨下至气管分支前一段气管，将气管放入3ml 5％NaHCO₃溶液静置3小时，取上清1ml，3000rpm离心5分钟后，546nm处测量并记录吸光度。根据酚红的标准曲线计算出酚红的排泄量。

数据处理：

分别记录口服给药时间点，2.5％酚红溶液腹腔注射时间点，取气管时间点；酶标仪546nm处测量得到各组样本吸光度，根据酚红的标准曲线计算出酚红的排泄量。各组数据计算均值及标准误，应用TTEST，将溶剂对照组与其他各组进行组间比，P<0.05认为有显著性差异。

实验结果：

给予沐舒坦(30mg/kg)及不同剂量蛋白BD-3(20mg/kg、50mg/kg)，1小时后腹腔注射2.5％酚红溶液，30分钟后脱颈处死小鼠，取自甲状软骨下至气管分支前一段气管，将气管放入3ml 5％NaHCO₃溶液静置3小时，取上清1ml，3000rpm离心5分钟后，546nm处测量并记录吸光度。根据酚红的标准曲线计算出酚红的排泄量。结果见表7。

表7.受试药对小鼠酚红排泄法祛痰药效实验(X±SEM)

组别	N	酚红排泄量(μg/ml)	P
				溶剂对照组	10	0.506±0.040	---
沐舒坦30mg/kg	10	1.061±0.117**	0.001
				BD-3-20mg/kg	10	0.750±0.085*	0.018
BD-3-50mg/kg	10	0.706±0.114	0.114

(与溶剂对照组比较，*P<0.05，**P<0.01)

实验结论：

1)实验结果显示，沐舒坦30mg/kg组与溶剂对照组比较，酚红排泄量明显升高，P<0.05，具有统计学意义。

2)BD-3 20mg/kg剂量组与溶剂对照组比较，酚红排泄量明显升高，P<0.05，具有统计学意义。

实验例6蛋白BD-3(实施例4蛋白)对小鼠氨水引咳法镇咳的药效试验动物：雄性ICR小鼠；

药品与试剂：氢溴酸右美沙芬，氨水，0.2％CMC-Na，蛋白BD-3；

仪器：压缩雾化器(403T型)，天平(XS105DU型)。

实验分组：

溶剂对照组；

右美沙芬15mg/kg组；

蛋白BD-3，20mg/kg组，50mg/kg组。

方法：

模型制备及给药：

按分组口服给予右美沙芬及不同剂量蛋白BD-3(给药体积10ml/kg)，溶剂对照组给予等量体积蒸馏水，1小时后放入密封盒内，通雾化10％浓度氨水10秒钟，然后观察和记录小鼠的咳嗽潜伏期和2分钟内咳嗽次数。

数据处理：

分别记录口服给药时间点，雾化实验时间点，小鼠的咳嗽潜伏期和2分钟内咳嗽次数。咳嗽潜伏期是指雾化氨水开始时间至发生咳嗽所需的秒数。小鼠咳嗽表现以其腹肌收缩(缩胸)，同时张大嘴为准。各组数据计算均值及标准误，应用TTEST，将模型组与其他各组进行组间比，P<0.05认为有显著性差异。

实验结果：

提前给予右美沙芬(15mg/kg)及不同剂量蛋白BD-3(20mg/kg、50mg/kg)，1小时后放入密封盒内，通雾化10％浓度氨水10秒钟，然后其对观察和记录小鼠的咳嗽潜伏期和2分钟内咳嗽次数。结果见表8。

表8.受试药对小鼠氨水引咳法的镇咳药效实验(X±SEM)

组别	N	潜伏期(秒)	P	咳嗽次数	P
						溶剂对照组	9	26.9±2.3	---	67.1±5.7	---
右美沙芬15mg/kg	9	38.4±4.5*	0.037	34.0±2.9**	0.001
						BD-3-20mg/kg	9	31.6±3.3	0.258	46.7±4.1*	0.010
BD-3-50mg/kg	9	34.2±2.1*	0.032	53.6±3.7	0.063

(与溶剂对照组比较，*P<0.05，**P<0.01)

实验结论：

1)实验结果显示，右美沙芬组与溶剂对照组在潜伏期和咳嗽次数上比较，有明显的改善作用，P<0.05，具有统计学意义。

2)BD-3 50mg/kg剂量组，在潜伏期上与溶剂对照组比较，有明显改善作用，P<0.05，具有统计学意义；20mg/kg剂量组，在咳嗽次数上与溶剂对照组比较，有明显改善作用，P<0.05，具有统计学意义。

实验例7蛋白BD-3(实施例4蛋白)对ICR小鼠醋酸扭体的药效试验动物：雄性ICR小鼠；

药品与试剂：阿司匹林、生理盐水、冰醋酸、蛋白BD-3。

实验分组：

模型组；

阿司匹林(Aspirin)300mg/kg组；

蛋白BD-3，50mg/kg组，200mg/kg组。

方法：

实验动物适应环境一天后，提前一小时分别口服给予阿司匹林300mg/kg，蛋白BD-3 50mg/kg、200mg/kg，给药体积为10ml/kg；而后腹腔注射0.6％醋酸溶液，观察15分钟内动物出现扭体潜伏期(秒)及次数。

数据处理：

各组数据计算均值及标准误，应用TTEST，与模型组比较，P<0.05认为有统计学差异。

实验结果：

口服给予阿司匹林300mg/kg及不同剂量蛋白BD-3(50mg/kg、200mg/kg)一小时后，腹腔注射0.6％醋酸溶液，观察ICR小鼠扭体潜伏期和次数。结果见表9。

表9.受试药对ICR小鼠醋酸扭体实验的影响

组别	N	体重(克)	扭体潜伏期(秒)	扭体次数(次)
					模型组0.6％醋酸	18	22.8±0.2	204.2±19.6	33.3±2.5
阿司匹林300mg/kg	13	23.2±0.2	290.3±37.0*	15.2±2.9***
					BD-3-50mg/kg	13	23.2±0.3	221.5±28.4	24.7±3.0*
BD-3-200mg/kg	13	23.5±0.3	189.8±10.4	29.5±4.7

(与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

实验结论：

应用0.6％醋酸溶液注入小鼠腹腔内，引起深部的大面积而较久的疼痛刺激，致使小鼠产生扭体反应(腹部收缩成“S”形，躯干与后腿伸张、臀部高起及蠕行)。以小鼠开始出现扭体的潜伏时间及次数作为痛反应指标，判断受试样品是否具有镇痛作用。本次实验结果显示：

1)阿司匹林300mg/kg可明显后延扭体潜伏期和减少扭体次数，具有一定的镇痛作用，与模型组比较，P<0.05，有统计学意义。

2)BD-3 50mg/kg剂量组，可显著减少小鼠扭体次数，与模型组比较，P<0.05，有统计学意义。

序列表

<110> 中国医学科学院药物研究所

<120> 一种角蛋白BD-3、制法和其药物组合物与用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 384

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 1

Met Ser Tyr Ser Cys Cys Leu Pro Asn Leu Ser Phe Arg Ser Ser Cys

1 5 10 15

Ser Ser Arg Pro Cys Val Pro Ser Ser Cys Cys Gly Thr Thr Leu Pro

20 25 30

Gly Ala Cys Asn Ile Pro Ala Asn Val Gly Ser Cys Asn Trp Phe Cys

35 40 45

Glu Gly Ser Phe Asn Gly Ser Glu Lys Glu Thr Met Gln Phe Leu Asn

50 55 60

Asp Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Lys Val Arg Gln Leu Glu Arg Asp

65 70 75 80

Asn Ala Glu Leu Glu Ser Arg Ile Leu Glu Arg Ser Gln Gln Lys Ile

85 90 95

Leu Ala Asn Lys Ala Glu Asn Ala Arg Leu Val Val Gln Ile Asp Asn

100 105 110

Ala Lys Leu Ala Ala Asp Asp Phe Arg Thr Lys Tyr Gln Thr Glu Leu

115 120 125

Gly Leu Arg Gln Leu Val Glu Ser Asp Ile Asn Gly Leu Arg Arg Ile

130 135 140

Leu Asp Glu Leu Thr Leu Cys Lys Ser Asp Leu Glu Ala Gln Val Glu

145 150 155 160

Ser Leu Lys Glu Glu Leu Ile Cys Leu Lys Gln Asn His Glu Gln Glu

165 170 175

Val Asn Thr Leu Arg Ser Gln Leu Gly Asp Arg Leu Asn Val Glu Val

180 185 190

Asp Ala Ala Pro Thr Val Asp Leu Asn Arg Val Leu Asn Glu Thr Arg

195 200 205

Ala Gln Tyr Glu Ala Leu Val Glu Thr Asn Arg Arg Asp Val Glu Glu

210 215 220

Trp Tyr Ile Arg Gln Thr Glu Glu Leu Asn Lys Gln Val Val Ser Ser

225 230 235 240

Ser Glu Gln Leu Gln Ser Tyr Gln Ala Glu Ile Ile Glu Leu Arg Arg

245 250 255

Thr Val Asn Ala Leu Glu Val Glu Leu Gln Ala Gln His Asn Leu Arg

260 265 270

Asp Ser Leu Glu Asn Thr Leu Thr Glu Thr Glu Ala Arg Tyr Ser Cys

275 280 285

Gln Leu Ala Gln Val Gln Gly Leu Ile Gly Asn Val Glu Ser Gln Leu

290 295 300

Ala Glu Ile Arg Ser Asp Leu Glu Arg Gln Asn Gln Glu Tyr Gln Val

305 310 315 320

Leu Leu Asp Val Arg Ala Arg Leu Glu Cys Glu Ile Asn Thr Tyr Arg

325 330 335

Gly Leu Leu Asp Ser Glu Asp Cys Lys Leu Pro Cys Asn Pro Cys Ala

340 345 350

Thr Thr Asn Ala Ser Ser Val Gly Ser Cys Val Thr Asn Pro Cys Thr

355 360 365

Pro Cys Gly Pro Arg Ser Arg Phe Gly Pro Cys Asn Thr Phe Gly Cys

370 375 380

<210> 2

<211> 1155

<212> DNA

<213> Bos taurus

<400> 2

atgagctatt catgttgctt gcccaacctg tcatttcgtt cgagttgcag cagccgtcca 60

tgtgtcccaa gctcgtgctg cggcacgacg ttaccgggtg cgtgtaacat tccggccaac 120

gtcggatcat gtaactggtt ttgcgagggc tctttcaatg gcagcgagaa agagaccatg 180

cagttcttga atgaccggct ggctagctat cttgagaagg tgcggcagct tgaacgtgat 240

aacgccgaac tggaatcacg gatattagag cggtcccagc agaagattct tgctaacaag 300

gcagaaaatg cacggctggt agtccaaatt gacaacgcga aactggccgc agatgacttt 360

cgcacgaaat atcaaactga acttgggttg cgccagttag ttgagtctga tattaacggg 420

cttcggcgca tattggatga gttgaccctt tgcaagtcgg acctggaagc gcaagtagaa 480

tcacttaagg aggaactgat ttgtctgaag cagaaccacg aacaggaagt caacacattg 540

cgctcgcagt taggcgatcg gttaaacgtc gaggtcgacg ctgctccgac cgttgatctt 600

aaccgggttc ttaacgagac acgggctcaa tacgaggcat tggtggaaac taatcgccgg 660

gatgttgagg aatggtatat ccggcagacg gaggaattga ataagcaggt cgtctccagc 720

tccgagcaac tgcaatccta tcaagccgaa atcatcgagt tacggcgtac agtgaatgcg 780

ttggaggtgg aacttcaggc tcagcacaac cttcgcgatt ccctggagaa cacacttaca 840

gagactgagg cgcggtactc gtgccaatta gcgcaggtgc agggcttaat cgggaatgtc 900

gaatctcagt tggcggaaat ccgctccgat ttggaacgcc aaaatcagga gtaccaagtg 960

ttactggacg tgcgtgcgcg tttggaatgt gaaatcaata cctaccgggg gttacttgac 1020

tctgaggact gcaagttacc ctgtaacccg tgcgccacta cgaacgcgtc gtcggtaggc 1080

tcgtgtgtga ccaacccatg cacgccgtgc ggccctcgtt cccgttttgg cccgtgcaac 1140

acgtttggtt gctaa 1155

Claims (9)

1.一种角蛋白BD-3在制备解热、镇痛、镇咳、祛痰、抗惊厥、抗癫痫药物中的应用，其特征在于，所述角蛋白BD-3的氨基酸序列为：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1的应用，其特征在于，在角蛋白BD-3上进行常规修饰；或者在角蛋白BD-3上还连接有用于检测或纯化的标签；

所述的常规修饰包括乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、固定化修饰、硫酸化、氧化、甲基化、脱氨化；所述的标签包括His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、ProfinityeXact。

3.一种编码权利要求1-2中任一项所述角蛋白BD-3的核酸分子在制备解热、镇痛、镇咳、祛痰、抗惊厥、抗癫痫药物中的应用。

4.根据权利要求3的应用，其特征在于，所述的核酸分子的核苷酸序列为：

(1)序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(2)与上述(1)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

5.一种表达载体在制备解热、镇痛、镇咳、祛痰、抗惊厥、抗癫痫药物中的应用，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求3-4中任一项所述的核酸分子。

6.一种宿主细胞在制备解热、镇痛、镇咳、祛痰、抗惊厥、抗癫痫药物中的应用，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求5所述的表达载体或者基因组中整合有权利要求3-4任一项所述的核酸分子。

7.根据权利要求6的应用，其特征在于，所述的宿主细胞包括细菌、酵母、曲霉菌、植物细胞、或昆虫细胞。

8.根据权利要求7的应用，其特征在于，所述的细菌包括大肠杆菌。

9.一种药物组合物在制备解热、镇痛、镇咳、祛痰、抗惊厥、抗癫痫药物中的应用，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1～2中任一项所述的角蛋白BD-3以及药学上可接受的载体或赋形剂。