CN101647814A - 一种动物角的仿生酶解产物及其用途 - Google Patents

一种动物角的仿生酶解产物及其用途 Download PDF

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刘国飞
周小明
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Abstract

本发明公开了一种动物角的酶解产物及其用途，属中药领域，其特征是采用仿生酶解的方法，取动物角，粉碎成细粉，加水匀浆后，在适当的条件下，先以胃蛋白酶保温酶解，再以胰酶或胰蛋白酶保温酶解，所得的酶解物按不同的制剂要求制成制剂。本发明产物在清热解毒、凉血止血、抗炎，抗感染，抗病毒、定惊、镇痛方面具有良好效果。

Description

一种动物角的仿生酶解产物及其用途
技术领域
本发明涉及一种中药动物角的仿生酶解产物及其在清热解毒、凉血止血、抗炎，抗感染，抗病毒、定惊、镇痛的药物中的应用。属中药领域。
背景技术
动物角类作为传统中药应用，已有悠久的历史，临床应用很广泛。动物的角同属皮肤衍化物的组织，其结构和成分相似，均由角质细胞组成。犀角Cornu Rhinoceri Asiatic、广角Cornu Rhinoceri African具有清血热、解温毒、定惊的功能，主治热病神昏澹语、斑疹、吐血等证。羚羊角Cornu Saigae Tataric为哺乳纲偶蹄目牛科动物赛加羚羊SaigatataricaLinnaeus的角，它具有清热镇痉、平肝熄风、解毒消肿的功能，中医用于高热神昏、惊厥抽搐等证。藏羚羊角Cornu Pantholopsis Hodgson是藏羚羊Pantholops hodgsoni的角，主治月经不调、子宫出血、死胎不下等证。山羊角为牛科动物青羊NaemorhedusgoralHardwicke、北山羊Capira ibex Linnaeus的角，本品首载于《本草新编》，曰其：“专活死血”，具有清热镇惊，散瘀止痛之功，目前发现其有明显的解热，镇痛，镇静，抗惊厥，抗病毒作用，与羚羊角药理作用相似，但力弱，故临床常用治小儿惊痫，高血压头痛，流行性乙型脑炎；另发现有兴奋子宫作用，故也用治产后腹痛，痛经等疾病。黄羊角为牛科动物黄羊Procapra gutturosapallas的角，本品非传统药材，但民间常作药用，目前已被《吉林中草药》一书收载，具有平肝熄风，清热解毒之功，现代研究发现其有类似于羚羊角的药理作用，故临床也常用于治疗温热病高热神昏惊厥，小儿感冒发热，小儿惊风，中风，青光眼等症，以代替羚羊角入药。耗牛角是牛科动物耗牛Bos grunniens(藏语称Yak)的角，是传统藏医药学中的一种特有药材，本品药用始于明代，李时珍曰其：“治惊痫，热毒，诸血病”；目前牦牛已被驯为家畜，药源丰富，具有清热解毒，凉血熄风作用，临床常用治高热惊痫，血热出血等证，疗效突出，普遍认为是一味具有研究价值的中药。水牛角为牛科动物水牛Bubalus bubalis Linnaeus的角，最早见载于《名医别录》一书，曰：“疗时气寒热头痛”，有清热解毒，凉血定惊之功；现代研究表明，水牛角有明显的强心，镇静，抗惊厥，抗炎，抗感染及保肝、降血脂等作用，故临床可用治热病头痛，高热神昏，发斑发疹，出血，小儿惊风及咽喉肿痛等症，并且疗效显著；另尚用治急性黄疸性肝炎，精神分裂症等疾病。黄牛角为牛科动物黄牛Bos taurus Gmelin的角，本品非传统药材，但民间常作药用，目前已被《中国动物药》收载，为寒性苦味药，具有清热解毒，凉血止血作用；现代研究发现，黄牛角不但能强心，抗炎，抗感染，而且能使血小板数量增加，出、凝血时间缩短，故临床常用治流行性脑膜炎，乙型脑炎，出血症，流行性出血热，咽喉肿痛等疾病，且疗效令人满意。鹿角为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminek、马鹿Cervus elaphus Linnaeus已骨化的角或脱落的角基，鹿角的药用，在我国已沿用了近2千年，其始载于《神农本草经》中，为温性咸味药，善入肝肾两经，具有补肝肾，益精血，强筋骨，行血消肿等多方面作用；可广泛用治肾虚腰脊冷痛、阳痿遗精，阴疽疮疡，跌打损伤，产后腹痛，妇人赤白带下；另外，临床亦用鹿角治疗乳腺炎及乳腺增生等疾病；目前，研究发现，鹿角能明显增加心脏搏出量，提高机体免疫功能，用治心力衰竭等。犀角及羚羊角药材资源匾乏，许多国家已经明令禁止使用犀角和羚羊角及其制成品。然而这些动物的角在入药的方式上通常采用原药材粉碎后直接服用，或水提后服用，其所采取的提取方法比较传统，由于动物的角含有大量的角蛋白，水提时有效成分不易完全提取出来，药材利用率较低，有效成分没有获得充分利用。经现代较为系统的与临床功效相关的生物活性和物质基础评价研究，动物角中的水溶性蛋白及肽类、游离的氨基酸成分的疗效越来越受到关注。人体经口服动物角后，经胃蛋白酶及胰酶的酶解、消化，以小分子肽类成分吸收入血发挥疗效，小分子的寡肽类物质和氨基酸很容易被小肠吸收，而大分子的蛋白类在小肠里也很难被吸收。传统的原粉直接服用，原药粉中大分子蛋白，只有少量在体内经过胃肠道的分解，变成小分子的寡肽而被吸收，由于药材粉碎的细度、胃肠道pH的变化及口服其他食物的干扰造成水解的不完全，有效成分被吸收利用的少，造成大量药材的浪费疗效大大降低。水提的提取工艺使得有大部分不溶入水的蛋白被滤过除去，造成大量的药材浪费，疗效同样大大降低。
应用酶解法水解动物蛋白，获得具有一定生理活性的生物活性肽是目前国内外研究的热点。由于不同的酶作用的部位不一样，酶解法得到的产物也不一样，用单一的胃蛋白酶或胰酶来酶解，只能使药材中的蛋白部分酶解，药材中的蛋白得不到最大程度的利用，这样就迫切的需要一种仿生的酶解方法——在动物或人体生物进化过程中已被证实、疗效确切、模拟人体的消化过程的仿生酶解方法，将动物药酶解后得到的有效成分更容易吸收，更加安全的利用，同时更加充分利用原药材。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种更有效的，安全的动物角仿生酶解产物；本发明的第二目的是提供该提取物在清热解毒、凉血止血、抗炎，抗感染，抗病毒、定惊、镇痛的药物中的应用。
发明人提供一种动物角的酶解产物，该产物采用仿生酶解的方法制备：
取动物角，粉碎成细粉，加水，调节pH至1.0～3.0，加入胃蛋白酶于35～45℃保温酶解0.5～4小时，再调节pH至7.5～8.5，加入胰酶或胰蛋白酶于40～50℃保温酶解2～8小时，即得。
进一步优化为：
取动物角，粉碎成细粉，加水，调节pH至1.5～2.5，加入动物角量的0.5％～5％的胃蛋白酶于35～45℃保温酶解1～3小时，再调节pH至7.5～8.5，加入动物角量的0.5％～5％的胰酶或胰蛋白酶于40～50℃保温酶解3～6小时，即得。
较优的制备方法为：
取动物角，粉碎成细粉，加水，调节pH至2.0，加入动物角量的1％～2％的胃蛋白酶于40℃保温酶解1～3小时，再调节pH至8.0，加入动物角量的1％～2％的胰酶或胰蛋白酶于50℃保温酶解3～6小时，即得。
发明人经过试验筛选，动物角药材细粉加水后，可预先加热至80～100℃，保温15～30分钟，再降温至酶解所需温度，按以上操作酶解，其效果更强。按本发明技术方案进行酶解，当胃蛋白酶的酶活力不低于1200U/g，胰蛋白酶的酶活力不低于2500U/mg，胰酶的酪蛋白转化力不低于25.0时，效果较为充分；酶活力越高，酶解速度越快、效果越好。
本发明所述的动物角类包括犀角Cornu Rhinoceri Asiatic，广角Cornu RhinoceriAfrican，藏羚羊Pantholops hodgsoni的角，牛科动物赛加羚羊Saigatatarica Linnaeus的角，牛科动物青羊NaemorhedusgoralHardwicke、北山羊Capira ibex Linnaeus的角，牛科动物黄羊Procapra gutturosa pallas的角，鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminek、马鹿Cervus elaphus Linnaeus已骨化的角或脱落的角基，牛科动物黄牛Bos taurus Gmelin的角，牛科动物牦牛Bos grunniens Linnaeus的角，牛科动物水牛Bubalus bubalis Linnaeus的角。
经现代研究证明，动物角中的肽类成分也是有效部位。人体经口服动物角后，经胃蛋白酶及胰酶或胰蛋白酶的酶解、消化，以小分子肽类成分吸收而发挥疗效。发明人根据人体口服动物角等动物药的过程，创造性的在体外采用人体仿生酶解的方法，先后对原料进行胃蛋白酶、胰蛋白酶或胰酶酶解，和人体直接口服药材原粉比较，所得被小肠吸收消化的有效物质群相同，但体外酶解选择较优的试验条件，酶解的更充分，再口服所得的药效更强，酶解成寡肽或小分子的活性部位群经注射或粘膜、皮肤等途径给药时更容易被吸收，免疫原性更低，更有效。经过试验筛选，单独以胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解动物角，效果均优于原粉直接口服，但都低于本发明的仿生酶解方法，本发明方法在很大程度上增强了动物角等动物药的疗效，而且由于以小分子寡肽的形式入药，口服、非口服及鼻腔粘膜等途径给药应用时可透膜吸收，发挥疗效迅速，增强疗效；而且由于没有引入异蛋白，减小了注射等剂型的毒副作用，值得推广应用。
本领域技术人员可以方便地将本发明酶解产物配合适当的辅料，制备成各种常规制剂，如：
a、将酶解液直接喷雾干燥，加入适量的常规辅料如淀粉、乳糖、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠等制成胶囊剂或片剂。
b、将酶解液滤过浓缩成稠膏，加入适量的糖粉和糊精制成颗粒剂。
c、将酶解液加热至85℃杀酶后，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量5kD以下的溶液，可加入等渗调节剂、pH调节剂、防腐剂等制成小针或输液；也可加入甘露醇、乳糖等冻干制成冻干粉针剂。
d、将酶解液滤过，滤液以超滤膜超滤，截留分子量10kD以下的溶液，或滤液直接加卡波姆、壳聚糖等常规药用辅料，制成凝胶剂或喷雾剂。
本发明提供的动物角酶解产物可以单独使用，也可以与其他药物成分联合使用，即：在药物活性成分中，可以只有该产物，还可以是其与其他药物的混合物，达到配合治疗、辅助治疗的目的。
本发明动物角酶解产物可以在清热解毒，凉血止血，抗炎，抗感染，抗病毒，定惊，镇痛药物中广泛应用，可用于温病高热，神昏谵语，发斑发疹，吐血衄血，惊风，癫狂、镇痛，镇静，抗病毒等，如感冒引起的发热，血热引起的衄血、紫癜，癫痫、急惊风；也可用于治疗银屑病、急性皮炎及变态反应性皮炎、乙型脑炎、黄疸型或无黄疸型肝炎、钩端螺旋体病、痢疾、败血症、急性脑血管疾病及风湿、类风湿性关节炎等疾病。
有益效果
为进一步验证本发明产物的治疗作用，发明人进行了动物药效学实验，实验中的“仿生酶解组”即为按本发明技术方案制得的水牛角酶解产物：
一、解热作用药效比较试验(酵母法)
1、材料
1.1动物 Wister大鼠，购自山东大学动物实验中心。
1.2试剂 胃蛋白酶，购自国药集团化学试剂有限公司，批号：F20070914；胰蛋白酶，购自国药集团化学试剂有限公司，批号：F20071228；胰酶，购自国药集团化学试剂有限公司，批号：F20071130；阿司匹林肠溶片(南京白敬宇制药有限公司)；干酵母(湖北安琪酵母股份有限公司生产)。
1.3供试样品 未酶解组：取黄羊角药材细粉(80目)50g，加入10倍量生理盐水，匀浆30分钟，搅匀，取1/5量，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；
胃蛋白酶酶解组：取1/5匀浆液，加入黄羊角药材量的1％胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为40℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；
胰蛋白酶酶解组：取1/5匀浆液，加入黄羊角药材量的1％胰蛋白酶，同时调节pH至8.0，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；
胰酶酶解组：取1/5匀浆液，加入黄羊角药材量的1％胰酶，同时调节pH至8.0，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；
仿生酶解组：取1/5匀浆液，加入黄羊角药材量的1％胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为40℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，然后调pH至8.0，加入黄羊角药材量的1％胰蛋白酶，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；
空白对照组：即生理盐水组；
阳性对照组：即阿司匹林组。
2、方法与结果
2.1试验方法 选健康大鼠，雄性，体重180～200g，编号，称重。测肛温2次，选用56只体温范围36～38.5℃，且体温波动小于0.3℃者，随机分为7组，分别为空白对照组、未酶解组、胃蛋白酶酶解组、胰蛋白酶酶解组、胰酶酶解组、仿生酶解组、阳性药组(阿司匹林片)，每组8只。造模前测体温作为“基础体温”。大鼠的剂量为：2.75g(生药)/kg。各组大鼠均背部皮下注射20％酵母-NS溶液10mL/kg，造成发热模型。造模后6h，每组大鼠均分别灌胃给药，给药后的0、0.5、1、1.5、2、3h复测大鼠肛温。以各时间点的体温升高值作组间比较，实验结果数据以平均值±标准偏差表示。
2.2试验结果(见表1)：
表1 样品对致热大鼠体温静增减值的影响(X±s，n＝8)
Figure G2008101181583D00051
Figure G2008101181583D00061
注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
上述试验结果表明，仿生酶解工艺大大增加了黄羊角的退热活性，均比其余酶解工艺理想，较未酶解样品具有极显著性差异。
二、止血作用药效比较试验
1、材料
1.1供试样品 未酶解组：取黄牛角药材细粉(80目)50g，加入10倍量生理盐水，匀浆30分钟，搅匀，取1/5量，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；
胃蛋白酶酶解组：取1/5匀浆液，加入黄牛角药材量的1％胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为40℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；
胰蛋白酶酶解组：取1/5匀浆液，加入黄牛角药材量的1％胰蛋白酶，同时调节pH至8.0，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；
胰酶酶解组：取1/5匀浆液，加入黄牛角药材量的1％胰酶，同时调节pH至8.0，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；
仿生酶解组：取1/5匀浆液，加入黄牛角药材量的1％胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为40℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，然后调pH至8.0，加入黄牛角药材量的1％胰蛋白酶，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；
空白对照组：即生理盐水组；
阳性对照组：即立止血组。
1.2试剂 胃蛋白酶，购自国药集团化学试剂有限公司，批号：F20070914；胰蛋白酶，购自国药集团化学试剂有限公司，批号：F20071228；胰酶，购自国药集团化学试剂有限公司，批号：F20071130；立止血：规格:1ku，瑞士巴塞尔素高大药厂，进口产品；注射用生理盐水：规格:250ml，批号：02110504，沈阳志鹰制药厂生产。
1.3动物 昆明种小白鼠，体重20～22g，雌雄各半，动物购自沈阳医学院实验动物中心，动物合格证号：辽实动质字2000[022号]。
1.4仪器 BS 634血小板聚集凝血仪，北京生化仪器厂。
2、方法与结果
2.1对小鼠出血时间的影响采用测定小鼠尾静脉出血时间的方法。实验组分为7组，每组12只小鼠，雌雄各半。小鼠尾静脉给药，实验用药物与立止血均用注射用生理盐水稀释或溶解，给药体积为0.20ml/10g。阳性对照药物采用进口立止血，剂量为0.3ku/kg，阴性对照组给等体积生理盐水。
给药后30min将小鼠尾固定，用手术刀片切开左侧中部尾静脉，每30秒用滤纸轻轻擦拭一次，直到不再出血为止，记录时间即为出血时间。
2.2测定结果见表2：
表2 对小鼠尾静脉出血时间和凝血时间的影响(X±s，n＝12)
  组别   平均出血时间(min)   平均凝血时间(min)
  未酶解样品组   4.81±0.61   2.96±0.76
  胃蛋白酶酶解组   4.48±0.52*   3.06±0.63*
  胰蛋白酶酶解组   3.42±0.42*   2.64±0.67*
  胰酶酶解组   3.38±0.41*   2.56±0.65*
  仿生酶解组   2.35±0.48**   2.32±0.72**
  立止血组   2.26±1.60**   1.95±0.79**
  生理盐水组   5.51±1.42   3.67±0.51
注：与空白对照组比较，**P＜0.01。
上述试验结果表明，本方法直观地反映了仿生酶解工艺得到的产物对压力较低的静脉止血作用效果，止血作用显著，均比其余酶解工艺理想，较未酶解样品具有显著性差异。
三、抗炎作用药效比较试验
1试验材料
1.1试验动物 昆明种小鼠，SPF级，♀，18～22g，安徽省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(皖)2005-0001号。
1.2试验仪器 JNB型精密扭力天平：上海第二天平仪器厂出品。
1.3受试药物 二甲苯：无锡医药采购供应站经销，东湖塘化工厂出品。
供试样品的制备 未酶解组：取黄牛角药材细粉(80目)50g，加入10倍量生理盐水，匀浆30分钟，搅匀，取1/5量，滤过，即得；
胃蛋白酶酶解组：取1/5匀浆液，加入黄牛角药材量的1％胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为40℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，滤过，即得；
胰蛋白酶酶解组：取1/5匀浆液，加入黄牛角药材量的1％胰蛋白酶，同时调节pH至8.0，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，滤过，即得；
胰酶酶解组：取1/5匀浆液，加入黄牛角药材量的1％胰酶，同时调节pH至8.0，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，滤过，即得；
仿生酶解组：取1/5匀浆液，加入黄牛角药材量的1％胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为40℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，然后调pH至8.0，加入黄牛角药材量的1％胰蛋白酶，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，滤过，即得；
空白对照组：即生理盐水组。
2试验方法
参照文献方法，取昆明种小鼠60只，随机分成6组，分组及给药剂量同上，分别灌胃给予0.1ml/10g相应供试液，连续7天，末次给完药后30min时做试验。末次给药后30min每鼠用乙醚麻醉，将二甲苯致炎液涂在小鼠左耳前后两面，每面约0.025ml，共0.05ml/每耳，右耳作对照，1h后，将小鼠断头处死，沿耳廓基线剪下两耳，用9mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片，用扭力天平称重。每鼠的左耳片重量减去右耳片重量的增加百分率即为肿胀程度。计算各组肿胀度之均值与标准差，并作t检验，比较组间差异显著性。
3试验结果，见下表。
表3 对小鼠因二甲苯所致耳廓肿胀度的影响结果表(X±SD)
  组别   动物数(只)   耳廓肿胀度(％)
  空白对照组   10   124.04±53.22
  未酶解组   10   95.66±29.41*
  胃蛋白酶酶解组   10   90.92±39.83*
  胰蛋白酶酶解组   10   80.66±29.41*
  胰酶酶解组   10   78.47±33.06*
  仿生酶解组   10   61.69±38.05**
注：经t检验，各组与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
上述试验结果表明，小鼠耳廓给予二甲苯后，可以造成耳廓肿胀炎症模型。与空白对照组比较，仿生酶解组可显著减轻小鼠耳廓肿胀炎症，具有显著性差异(P＜0.01)；单酶酶解组同样存在明显差异(P＜0.05)，提示本发明仿生酶解产物和单酶酶解产物均具有优于未酶解组的抗炎作用，且仿生酶解组的药理作用好于单酶酶解组。
四、抗病毒作用药效比较试验
1、药品与试剂
供试样品的制备 未酶解组：取黄牛角药材细粉(80目)50g，加入10倍量生理盐水，匀浆30分钟，搅匀，取1/5量，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；
胃蛋白酶酶解组：取1/5匀浆液，加入黄牛角药材量的1％胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为40℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；
胰蛋白酶酶解组：取1/5匀浆液，加入黄牛角药材量的1％胰蛋白酶，同时调节pH至8.0，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；
胰酶酶解组：取1/5匀浆液，加入黄牛角药材量的1％胰酶，同时调节pH至8.0，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；
仿生酶解组：取1/5匀浆液，加入黄牛角药材量的1％胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为40℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，然后调pH至8.0，加入黄牛角药材量的1％胰蛋白酶，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得；
胎牛血清；DMEM培养基(Gibco公司产品)；HBeAg检测试剂盒；HBV-DNA克隆转染的人肝癌细胞细胞株HepG2-2.2.15。
2、试验方法
HBV-DNA克隆转染的人肝癌细胞HepG2-2.2.15细胞培养于含10％胎牛血清及双抗(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的DMEM培养液中，于37℃、5％CO2条件下培养。取对数生长期的癌细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液稀释成5×107/mL单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100μL，贴壁培养24h后弃去上清液，加入不同体积药物，样品用3％二甲亚砜溶解配制成1mg/mL的母液，补加DMEM培养液至终体积为200μL。每个浓度平行6孔，对照组加入等体积的DMEM培养液。吸取培养板上清液5μL，按HBeAg检测试剂盒方法检测e抗原的吸光度(A)值，按下式计算细胞增殖抑制率。
细胞抑制率＝(1-加药细胞的A值/对照细胞的A值)×100％
3试验结果，见下表。
表4 对HepG2-2.2.15细胞的抑制率结果表
  组别   抑制率(％)
  未酶解组   62.44*
  胃蛋白酶酶解组   66.13*
  胰蛋白酶酶解组   72.40*
  胰酶酶解组   73.22*
  仿生酶解组   79.84**
注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
上述试验结果表明，仿生酶解产物具有较强的抗HBV作用，与不加药物仅加等体积DMEM培养液的对照组比较，在10μg/mL的药物浓度显示出显著差异，较其他单酶酶解产物的作用强，提示本发明仿生酶解产物具有较好的抗病毒作用。
五、抗戊四氮惊厥作用药效比较试验
1、材料
1.1动物 昆明种小白鼠，体重20～22g，雌雄各半，动物购自沈阳医学院实验动物中心，动物合格证号：辽实动质字2000[022号]。
1.2药品 未酶解样品组、胃蛋白酶酶解组、胰蛋白酶酶解组、胰酶酶解组、仿生酶解组供试品溶液的制备方法同上；空白对照组：即生理盐水组。
1.3试剂 胃蛋白酶，购自国药集团化学试剂有限公司，批号：F20070914；胰蛋白酶，购自国药集团化学试剂有限公司，批号：F20071228；胰酶，购自国药集团化学试剂有限公司，批号：F20071130；戊四氮注射液(上海新亚制药厂)；注射用生理盐水：规格:250ml，批号：02110504，沈阳志鹰制药厂生产。
2、方法与结果
2.1试验方法 选取活泼无受孕的小白鼠60只，雌雄均可，体重18～22g。随机分成6组，每组10只，分别ip未酶解组供试品、胃蛋白酶酶解组供试品、胰蛋白酶酶解组供试品、胰酶酶解组供试品、仿生酶解组供试品和生理盐水(N.S)0.25ml/10g，15min后ip 0.5％戊四氮0.2ml/10g，观察惊厥发生的时间及生存时间，采用t检验法统计处理。
2.2结果见表3：
表5 对小鼠抗惊厥作用的影响(X±S，n＝10)
  组别   平均惊厥发生时间(min)   平均生存时间(min)
  空白对照组   1.07±0.22   10.12±4.29
  未酶解组   1.14±0.33   12.21±5.09
  胃蛋白酶酶解组   1.45±0.35   12.67±5.25
  胰蛋白酶酶解组   1.75±0.41*   14.09±6.01*
  胰酶酶解组   1.81±0.53*   14.51±5.61*
  仿生酶解组   2.49±0.92**   17.61±6.34**
注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
以上试验结果表明，仿生酶解组的抗惊厥效果明显优于其他组，且平均生存时间明显延长，与未酶解组比较仿生酶解组明显增强了小鼠的抗惊厥作用。
六、镇痛作用药效比较试验
1试验材料
1.1试验动物 昆明种小鼠，SPF级，♀，18～22g，安徽省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(皖)2005-0001号。
1.2试验仪器 热板仪：自制；电热恒温水浴锅：上海医疗器械厂生产。
1.3受试药物
供试样品的制备 未酶解组：取黄牛角药材细粉(80目)50g，加入10倍量生理盐水，匀浆30分钟，搅匀，取1/5量，滤过，即得；
胃蛋白酶酶解组：取1/5匀浆液，加入黄牛角药材量的1％胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为40℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，滤过，即得；
胰蛋白酶酶解组：取1/5匀浆液，加入黄牛角药材量的1％胰蛋白酶，同时调节pH至8.0，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，滤过，即得；
胰酶酶解组：取1/5匀浆液，加入黄牛角药材量的1％胰酶，同时调节pH至8.0，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，滤过，即得；
仿生酶解组：取1/5匀浆液，加入黄牛角药材量的1％胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为40℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，然后调pH至8.0，加入黄牛角药材量的1％胰蛋白酶，温度为50℃±2℃，保温同时搅拌酶解4h，85℃保温20min，放冷，滤过，即得；
空白对照组：即生理盐水组。
2试验方法
参照文献方法，取♀性昆明种小鼠60只，给药前将小鼠放入热板上(将恒温水浴调节至55±0.5℃，放入1000ml的薄铁皮烧杯，底部接触水面)，用秒表记录小鼠自投入热板至出现舔后足的时间(s)作为该鼠的给药前痛阈值，应挑选5～30s以内者为合格。取测痛阈值后筛选出痛阈值符合要求的小鼠54只，按痛阈值和体重随机分成6组。分别为空白对照组、未酶解组、胃蛋白酶酶解组、胰蛋白酶酶解组、胰酶酶解组和仿生酶解组，给药剂量均为10ml/kg，空白组灌胃给予同体积的生理盐水。连续给药5天，于末次给药后30min、60min将小鼠放入热板上，测定痛阈值以及痛阈值提高百分率，并作t检验，比较组间差异显著性。
3试验结果
具体实验结果见下表。
表6 对小鼠因热板所致痛阈值的影响结果表(X±SD，n＝9)
组别   给药前痛阈值(s) 30min(s)   30min痛阈提高率(％)   60min(s)   60min痛阈提高率(％)
  空白对照组   17.7±2.2   19.8±4.5   12.3±33.31   19.9±4.7   12.9±28.9
  未酶解组   19.7±3.9   24.7±6.8*   25.9±30.4*   25.2±7.3*   27.6±26.1*
  胃蛋白酶酶解组   19.4±4.0   25.6±7.8*   32.5±27.2*   26.0±8.6*   34.3±30.7*
  胰蛋白酶酶解组   18.4±5.9   27.6±8.8*   48.9±27.6*   27.9±9.0*   51.0±31.3*
  胰酶酶解组   18.6±5.9   28.2±8.8*   51.9±27.6*   28.4±9.0*   52.6±31.3*
  胰酶酶解组   19.2±2.5   31.6±7.4**   65.3±40.8*   32.2±6.7**   67.9±37.0**
注：经t检验，各组与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
上述试验结果表明，在给药后30min和60min时，与空白对照组比较，仿生酶解组可显著提高因热板所致小鼠的痛阈值和痛阈值提高百分率，具有显著性差异(P＜0.01)；其他单酶酶解组同样存在明显差异(P＜0.05)，提示本发明仿生酶解产物和单酶酶解产物均具有较好的镇痛作用，且仿生酶解组的药理作用好于单酶酶解组。
具体实施方式
下面列举实施例，进一步说明本发明，各实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明：
实施例1
取山羊角500g，粉碎成细粉，加10倍量水匀浆，调节pH至2.0，加入山羊角量的1％的胃蛋白酶于40℃保温酶解2小时，调节pH至8.0，加入山羊角量的1％的胰酶于50℃保温酶解4小时，喷雾干燥，加入适量的淀粉，制粒，干燥，整粒，填装胶囊。
实施例2
取牦牛角500g，粉碎成细粉，加8倍量水匀浆，调节pH至2.6，加入牦牛角量的2％的胃蛋白酶于37℃保温酶解3小时，调节pH至7.5，加入牦牛角量的2％的胰蛋白酶于40℃保温酶解6小时，喷雾干燥，加入适量的微晶纤维素，制粒，干燥，整粒，压制成片。
实施例3
取羚羊角500g，粉碎成细粉，加15倍量水匀浆，调节pH至3.0，加入羚羊角量的5％的胃蛋白酶于40℃保温酶解2小时，调节pH至8.5，加入羚羊角量的5％的胰蛋白酶于45℃保温酶解5小时，加热至85℃保温15分钟，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量5kD以下的溶液，制成注射液。
实施例4
取犀角500g，粉碎成细粉，加15倍量水匀浆，调节pH至1.5，加入犀角量的0.5％的胃蛋白酶于40℃保温酶解1小时，调节pH至8.0，加入犀角量的1.5％的胰蛋白酶于50℃保温酶解3小时，加热至95℃保温30分钟，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量5kD以下的溶液，加入甘露醇，冷冻干燥，制成冻干粉针剂。
实施例5
取黄牛角250g、地龙50g，加15倍量水匀浆，调节pH至2.0，加入总药量的1％的胃蛋白酶于40℃保温酶解2小时，调节pH至8.0，加入总药量的1％的胰酶于50℃保温酶解4小时，加热至85℃保温15分钟，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量10kD以下的溶液，加卡波姆，润胀12小时，调PH增加粘度，加入200g生地提取浓缩液，混匀，制成凝胶剂。
实施例6
取广角500g，粉碎成细粉，加15倍量水匀浆，调节pH至2.5，加入广角量的4％的胃蛋白酶于40℃保温酶解2小时，调节pH至8.5，加入广角量的5％的胰蛋白酶于45℃保温酶解6小时，加热至85℃保温15分钟，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量5kD以下的溶液，制成喷雾剂。
实施例7
取黄羊角500g，粉碎成细粉，加10倍量水匀浆，调节pH至2.0，加入黄羊角量的2％的胃蛋白酶于40℃保温酶解2.5小时，调节pH至8.0，加入黄羊角量的2％的胰酶于50℃保温酶解5小时，喷雾干燥，加入适量的淀粉，制粒，干燥，整粒，填装胶囊。
实施例8
取藏羚羊角500g，粉碎成细粉，加12倍量水匀浆，调节pH至2.5，加入藏羚羊角量的2.5％的胃蛋白酶于39℃保温酶解2.5小时，调节pH至8.0，加入藏羚羊角量的3％的胰蛋白酶于40℃保温酶解6小时，喷雾干燥，加入适量的微晶纤维素，制粒，干燥，整粒，压制成片。
实施例9
取水牛角500g，粉碎成细粉，加15倍量水匀浆，调节pH至2.0，加入水牛角量的2.5％的胃蛋白酶于40℃保温酶解3小时，调节pH至8.5，加入水牛角量的2.5％的胰酶于50℃保温酶解6小时，喷雾干燥，加入适量的糖粉和糊精，制粒，干燥，整粒，制成颗粒剂。
实施例10
取鹿角500g，粉碎成细粉，加12倍量水匀浆，调节pH至2.0，加入鹿角量的3％的胃蛋白酶于38℃保温酶解2.5小时，调节pH至8.0，加入鹿角量的4％的胰蛋白酶于42℃保温酶解6小时，加热至85℃保温15分钟，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量5kD以下的溶液，制成喷雾剂。
实施例11
取实施例9所制颗粒治疗过敏性紫癜患者36例。36例均为住院患儿，其中男16例，女20例，年龄2～14岁，病程为3～15d；诊断标准参照《实用儿科学》有关标准进行，全部病例有不同程度的皮肤紫癜，其中腹痛14例，关节痛23例，血尿12例，粪潜血阳性12例，全部病例检查血小板计数、出凝血时间均正常。口服给药，每次10g，每天2次。根据国家中医药管理局《中医病症诊断疗效标准》制定疗效标准，临床治愈：紫斑紫癜及全身症状消失，实验室指标恢复正常；好转：皮肤青紫斑点明显减少，全身症状减轻，实验室指标有改善；未愈：皮肤青紫斑点、全身症状及实验室指标均无变化。本组36例，治愈28例(77.78％)，好转7例(19.44％)，未愈1例(2.78％)，总有效率97.22％。

Claims (10)

1、一种动物角的仿生酶解产物，其特征在于该产物是按以下方法制备的：
取动物角，粉碎成细粉，加水，调节pH至1.0～3.0，加入胃蛋白酶于35～45℃保温酶解0.5～4小时，再调节pH至7.5～8.5，加入胰酶或胰蛋白酶于40～50℃保温酶解2～8小时，即得。
2、根据权利要求1所述的动物角酶解产物，其特征在于该产物是按以下方法制备的：
取动物角，粉碎成细粉，加水匀浆，调节pH至1.5～2.5，加入动物角量的0.5％～5％的胃蛋白酶于35～45℃保温酶解1～3小时，再调节pH至7.5～8.5，加入动物角量的0.5％～5％的胰酶或胰蛋白酶于40～50℃保温酶解3～6小时，即得。
3、根据权利要求2所述的动物角酶解产物，其特征在于该产物是按以下方法制备的：
取动物角，粉碎成细粉，加水，调节pH至2.0，加入动物角量的1％～2％的胃蛋白酶于40℃保温酶解1～3小时，再调节pH至8.0，加入动物角量的1％～2％的胰酶或胰蛋白酶于50℃保温酶解3～6小时，即得。
4、根据权利要求1至3中任一所述的动物角酶解产物，其特征在于将动物角粉碎成细粉后加水先加热至80～100℃并保温15～30分钟后，再降温至所需温度进行酶解。
5、根据权利要求1至3中任一所述的动物角酶解产物，其特征在于所用的胃蛋白酶的酶活力不低于1200U/g，胰蛋白酶的酶活力不低于2500U/mg，胰酶的酪蛋白转化力不低于25.0。
6、权利要求1至5中任一所述的动物角酶解产物的动物角可以是犀角、广角、藏羚羊角、羚羊角、山羊角、黄羊角、鹿角、黄牛角、牦牛角、水牛角。
7、根据权利要求1至5中任一所述的动物角酶解产物，其特征在于加入常规药用辅料制成注射剂、口服制剂或外用制剂。
8、权利要求1至5中任一所述的动物角酶解产物在制备用于治疗发热以及由血热引起的出血、渗血的药物中的应用。
9、权利要求1至5中任一所述的动物角酶解产物在制备用于抗炎，抗感染，抗病毒的药物中的应用。
10、权利要求1至5中任一所述的动物角酶解产物在制备用于镇痛，抗惊厥的药物中的应用。
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