CN103860596A - 一种水牛角提取液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药有效成分提取方法技术领域,即水牛角提取液的制备方法。是将水牛角表面刷洗干净后抛片、冷冻粉碎,然后投入胶体磨进行湿法粉碎,研磨液加入人工胃液提取和人工肠液提取,每步后均加热进行酶灭活,合并提取液,调PH值,微孔滤膜过滤、超滤除去加入蛋白酶及大分子杂质的,收集后浓缩成水牛角提取液或喷雾干燥得水牛角提取物。比常规工艺大大提高了浸膏率,总氨基酸得率。
Description
技术领域
本发明属于中药有效成分提取方法技术领域,即水牛角提取液的制备方法。具体设计一种先进的动物角类药物的提取方法,利用冷冻粉碎及胶体磨进行超微粉碎,提高了提取面积,增加了提取收率,充分的利用药材资源,同时模拟药物进入胃肠后的消化吸收环境而进行的水解,并通过膜分离技术进行纯化的,进行难以通过水煎方式进行提取的角类药材新的提取方法。
背景技术
水牛角为牛科动物水牛Bubalus bubalis Linnaeus的角,收载于《中国药典》2010版一部77页,具有清热凉血、解毒定惊的功效,主要用于温病高热,神昏谵语,发斑发疹,吐血、惊风、癫狂等证。为中药犀角的替代品,是常用中药,镑片或搓成粗粉15-30g,先煎3小时以上使用。现代化学成分研究表明,水牛角含多种氨基酸、肤类、蛋白质、角纤维、当醇类、肌类、强心苷类等化学成分。药理作用研究结果证明水牛角水煎液有抗感染、缩短凝血时间以及镇静等作用,但由于角类药材质地坚实,提取比较困难,所以传统角类药物均挫末用药汁兑服,但由于水牛角作为犀角的替代品用量很大,所以人们经常采用水提、酸水解、碱水解、酸碱水解、酶解等方式进行提取,由于水牛角质地致密,提取率非常低,同时,由于不同的酶,酶切位点各异,酶的选择影响了水解解物中肽段的分子量大小及氨基酸组成, 从而导致的酶解产物生物活性的差异. 总提取的成分与机体内自然吸收的成分存在差异性,有的工艺还有钡残留。
冷冻粉碎技术利用了物料在低温状态下的“低温脆性”,即物料随着温度的降低,其硬度和脆性增加,而塑性及韧性降低,在一定温度下,用一个很小的力就能将其粉碎。冷冻粉碎技术可获得更细的粉末,使物料的流动性得到较大改善,等条件时冷冻粉碎的处理能力显著高于常温粉碎并可以保持药材的有效成分。
胶体磨匀浆技术,是一种比较新的湿法粉碎技术,通过胶体磨匀浆,可以把难粉碎的药材进行粉碎,提高了不易被溶剂穿透而进行提取的药材的提取面积。
膜分离技术因操作条件温和,能耗又低, 被认为是分离小肽及氨基酸体系的理想方法。以往方法,提取效果差,收率低。
发明内容
为了改进水牛角的提取方法,更好的提高水牛角药材的利用率,更好的利用水牛角药材,得到纯度较高、更接近机体的吸收的提取液成分,提供了水牛角的提取方法。
采用冷冻粉碎和胶体磨湿法粉碎相结合,配合仿胃肠道环境的仿生态提取技术,结合先进的膜分离技术,提取水牛角中的活性成分,是一个低风险、高产出的项目,具有很高经济效益和社会效益的方式。可以改善节约药材资源,更好的提取和保证水牛角有效成分,增加含水牛角产品的价值和市场竞争力,为中药角类药物的新产品开发开辟了新的道路。
本发明的目的是提供一种水牛角提取液的制备方法,其是将水牛角表面刷洗干净后抛片、冷冻粉碎,然后投入胶体磨进行湿法粉碎,研磨液加入人工胃液提取(酸及胃蛋白酶水解)和人工肠液提取(胰蛋白酶、糜蛋白酶水解),每步后均加热进行酶灭活,合并提取液,调PH值,微孔滤膜过滤、超滤(切割相对分子量分子量20000)除去加入蛋白酶及大分子杂质的,收集后浓缩成水牛角提取液或喷雾干燥得水牛角提取物。
一种水牛角提取液的制备方法,其特征在于步骤如下:
1.将水牛角刷净表面,电刨薄片后放入液氮中冷冻后进行粉碎。
2.将冷冻粉碎得水牛角粉,按料液比1:1-1:10投入胶体磨进行湿法粉碎,得研磨液。
3.将上述研磨液,加热至沸腾,沸腾后微沸状态继续提取2-6h。然后分离提取液,水牛角继续加水(料液比1:1-1:10)重复上述步骤提取2-4次,过滤后合并提取液浓缩后备用;水牛角药渣备用。
4.将步骤3水提后的水牛角药渣,加入人工胃液进行水解(料液比1:1-1:10),温度39℃,水解4-6小时,加热至85℃灭活蛋白酶,过滤后上清液浓缩备用,水牛角药渣备用;所述人工胃液按《中国药典》附录配制:稀盐酸16.4ml,加水800ml与胃蛋白酶10g,摇匀后,加水衡释至100ml,用量同比例放大;采用人工胃液进行水解,与水牛角粉末服用后进入机体在胃中的pH值、酶的种类和浓度等消化条件一致,通过这种仿生方法,在体外得到与体内一致的水解物,避免以往酸碱酶水解法导致的过度水解或水解不到位,避免由于不同的酶,酶切位点各异,酶的选择影响了水解解物中肽段的分子量大小及氨基酸组成, 从而导致的酶解产物生物活性的差异。
5.将步骤4水牛角药渣,加入人工肠液进行水解(料液比1:1-1:10),温度39℃,水解8小时,加热至85℃灭活蛋白酶,过滤后上清液浓缩备用;所述人工肠液按中国药典附录配制:取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8,取胰酶10g,加水量使溶解,将两液混合后,加水稀释至1000ml,用量同比例放大;采用人工肠液水解,与水牛角粉末服用后进入机体在肠道中的PH值、酶的种类和浓度等消化条件一致,通过这种仿生方法,在体外得到与体内一致的水解物,避免以往酸碱酶水解法导致的过度水解或水解不到位,同时避免由于不同的酶,酶切位点各异,酶的选择影响了水解解物中肽段的分子量大小及氨基酸组成, 从而导致的酶解产物生物活性的差异。
6.将步骤3、4、5所得的浓缩液合并后浓缩,进行透析除盐至透析液(蒸馏水)中电导率与配置人工胃液和肠液的蒸馏水相近,除盐后的提取液过微孔滤膜后进行超滤,切割相对分子量分子量15000-20000(截留至此分子量的原因是水解得到氨基酸和小肽的分子量均低于此分子量,同时,由于加入的人工胃液和人工肠液中的消化酶的分子量均大于20000,未被水解的大分子杂质分子量也大于20000)除去加入酶及大分子杂质的,收集后浓缩成水牛角提取液;超滤操作条件温和不破坏水解物的结构,是分离小肽及氨基酸体系的理想方法。
7. 浓缩液喷雾干燥,称量,计算总提取物收率。
优选,水牛角提取液的制备方法,其步骤如下:
(1)将水牛角刷净表面,电刨薄片后放入液氮中冷冻后进行粉碎;
(2)将冷冻粉碎得水牛角粉,按料液比1:10投入胶体磨进行湿法粉碎,得研磨液;
(3)将上述研磨液,加热至沸腾,沸腾后微沸状态继续提取4h。然后分离提取液,水牛角继续加水重复上述步骤提取4次,过滤后合并提取液浓缩后备用;水牛角药渣备用;
(4)将步骤3水提后的水牛角药渣,加入人工胃液进行水解,温度39℃,水解4小时,加热至85℃灭活蛋白酶,过滤后上清液浓缩备用,水牛角药渣备用;所述人工胃液按《中国药典》附录配制:稀盐酸16.4ml,加水800ml与胃蛋白酶10g,摇匀后,加水衡释至100ml,用量同比例放大;
(5)将步骤4水牛角药渣,加入人工肠液进行水解,温度39℃,水解8小时,加热至85℃灭活蛋白酶,过滤后上清液浓缩备用;所述人工肠液按中国药典附录配制:取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8,取胰酶10g,加水量使溶解,将两液混合后,加水稀释至1000ml,用量同比例放大;
(6)将步骤3、4、5所得的浓缩液合并后浓缩,进行透析除盐,除盐后的提取液过微孔滤膜后进行超滤,截取相对分子量分子量20000,收集后浓缩成水牛角提取液;
(7)浓缩液喷雾干燥,称量,计算总提取物收率。
本发明提取水牛角的特点在于:
1、冷冻粉碎配合胶体磨湿法粉碎获得粒径更小的水牛角粉末,提高提取面积,更有利于下一步的提取,采用人工胃液提取和人工肠液提取,微孔滤膜过滤,水牛角提取液收率比较高,总含氮量为水煎的30倍,酸碱水解的21倍,酶水解的20倍。最终比常规工艺大大提高了浸膏率,总氨基酸得率。
2、本发明采取仿生态的提取方法、条件温和,胃蛋白酶的含量和酸度、胰蛋白酶的含量和PH值以及提取的温度,均与正常水牛角粉末进入机体后的消化环境一致,避免了由于不同的酶,酶切位点不通对水解解物中肽段的分子量大小及氨基酸组成的影响,得到的提取液与机体内自然吸收的成分相似,所得成分状态好、药理活性好。
3、避免了酸碱分离工艺钡的残留,避免了钡离子对心脏的毒性。
4、采取了先进的膜分离技术,得到了更纯的具有解热抗炎活性的活性部位群。
5、.所得的提取液和机体正常吸收的成分及比例相似,更易于吸收产生疗效。
6、实验工艺简单易操作,实验结果稳定,可以适用于工业大生产。
具体实施方式
实施例1
水牛角提取液的制备方法:
1.取水牛角100g,刷净表面,电刨薄片后放入液氮中冷冻后进行粉碎。
2.将冷冻粉碎得水牛角粉,按料液比1:10投入胶体磨进行湿法粉碎。得研磨液。
3.将上述研磨液,加热至沸腾,沸腾后微沸状态继续提取4h。然后分离提取液,水牛角继续加水重复上述步骤提取2次,合并提取液浓缩后备用,水牛角粉末备用。
4.将步骤3水提后的水牛角末(药渣),加入人工胃液(《中国药典》附录:稀盐酸16.4ml,加水约800ml与胃蛋白酶10g,摇匀后,加水衡释至100ml)进行水解,温度39℃,水解4小时,加热至85℃灭活蛋白酶,过滤后上清液浓缩备用。水牛角粉末备用。
5.将步骤4水牛角粉末,加入人工肠液(《中国药典》附录:取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节PH值至6.8,取胰酶10g,加水量使溶解,将两液混合后,加水稀释至1000ml)进行水解,温度39℃,水解8小时,加热至85℃灭活蛋白酶,过滤后上清液浓缩备用。
6. 将3、4、5步骤所得的浓缩液合并后浓缩,进行透析除盐,除盐后的提取液过微孔滤膜后进行超滤,截留相对分子量分子量20000以下除去加入蛋白酶及大分子杂质的,收集后浓缩成水牛角提取液。
7. 浓缩,喷雾干燥,称量,计算总提取物收率。
8. 氨基酸含量测定 精密称取各提取物10mg,用蒸馏水配成10 mL,精密吸取0·5 mL置5 mL试管中,加水至2 mL,加茚三酮试剂0·5 mL,摇匀,置沸水浴中15 min,取出以流水冷却,加正丙醇-水(1∶1)混合液至刻度,摇匀,置1 mL比色池中,于570 nm波长处测定吸收度,以丙氨酸溶液为标准溶液绘制标准曲线,计算总氨基酸含量。
计算总氨基酸含量。测得总提取物收率为25.25%,总氨基酸得率为18.98%。
附1:水牛角不同提取方法的比较研究
水牛角刷净表面,刨成薄片后打成细粉,分别用以下方法进行提取并测定总提取物重量及氨基酸(蛋白的含量)。
2.1醇提取法:称取50g水牛角细粉置于5000ml圆底烧瓶中,配制50%乙醇,第一次加入8倍量50%乙醇,即400ml于圆底烧瓶中,连接冷凝回流装置,电热套加热至沸腾,调压至微沸状态,1h。过滤,第二次(同上)第三次(同上)。
滤液用减压回收乙醇装置,回收乙醇,剩余少量滤液置于已烘干至恒重的蒸发皿中,水浴蒸干。 于105℃烘箱内,干燥3h,置干燥器中冷却0.5h,称重。计算总提取物收率。
2.2 酸提取法:称取50g水牛角细粉置于5000ml圆底烧瓶中,配制4mol/L 硫酸溶液400ml,加入圆底烧瓶。连接冷凝回流装置,回流水解6h,放冷后,调整溶液体积至400ml。取出200ml 用50%NaOH,调整至PH4,用抽滤机过滤,再用10%NaOH调整滤液至PH7,取50ml,用透析膜透析后,置于蒸发皿中,水浴锅蒸干,于105℃烘箱内,干燥3h,置干燥器中冷却0.5h,称重。计算总提取物收率。
2.3碱提取法:称取水牛角细粉50g,置5000ml圆底烧瓶中,配制4mol/L的NaOH溶液500ml,加入圆底烧瓶中。连接冷凝回流装置,回流水解6h,放冷后,调节溶液体积至650ml,取出325ml用4mol/L的硫酸溶液,调整到PH4,抽滤,滤液用10%NaOH溶液调整至PH7,取出50ml,用透析膜透析后,置于已恒重的蒸发皿中,水浴蒸干,于105℃烘箱内,干燥3h,置干燥器中冷却0.5h,称重。计算总提取物收率。
2.4 酸碱提取法:将酸水解液及碱水解溶液各取1/2量(即酸水解液200mL碱水解液325ml)混合,再加50%NaOH调至PH4,过滤,滤液用10%NaOH调至PH7, 取50ml,用透析膜透析后,置于蒸发皿中,水浴锅蒸干,于105℃烘箱内,干燥3h,置干燥器中冷却0.5h,称重。计算总提取物收率。
2.5 酶水解法:称取50g水牛角+0.0125g胰酶+40ml缓冲液(PH7.5、酶底比1:80、料液比1:40)置震荡培养箱中,42℃,3h,置烘箱中105℃灭酶15min取出过滤,滤液用透析膜透析后,置恒重蒸发皿中,水浴蒸干,于105℃烘箱内,干燥3h,置干燥器中冷却0.5h,称重。计算总提取物收率。
2.6本发明提取方法:取水牛角50g,刷净表面,电刨薄片后放入液氮中冷冻后进行粉碎。将冷冻粉碎得水牛角粉,按料液比1:2投入胶体磨进行湿法粉碎得研磨液。将研磨液,加热至沸腾,沸腾后微沸状态继续提取4h。然后分离提取液,水牛角继续加水重复上述步骤提取2次,合并提取液浓缩后备用,水牛角粉末备用。将步骤2水提后的水牛角末,加入人工胃液(《中国药典》附录:稀盐酸16.4ml,加水约800ml与胃蛋白酶10g,摇匀后,加水衡释至100ml)进行水解,温度39℃,水解4小时,加热至85℃灭活蛋白酶,过滤后上清液浓缩备用。水牛角粉末备用。将步骤4水牛角粉末,加入人工肠液(《中国药典》附录:取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节PH值至6.8,取胰酶10g,加水量使溶解,将两液混合后,加水稀释至1000ml)进行水解,温度39℃,水解8小时,加热至85℃灭活蛋白酶,过滤后上清液浓缩备用。将以上2步所得的浓缩液合并后浓缩,进行透析除盐,除盐后的提取液过微孔滤膜后进行超滤,截取相对分子量分子量20000以下除去加入的蛋白酶及大分子杂质的,收集后浓缩成水牛角提取液。浓缩,喷雾干燥,称量,计算总提取物收率。进行氨基酸分析。
截留的氨基酸成分分析:水牛角提取物中含有氨基酸为:甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天门冬氨酸 (Asp)、胱氨酸(Cly)、丙氨酸(Ala)、苏氨酸(Thr)、鸟氨酸 (Orn)、谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(γ-Aba)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His) 精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、异亮氨酸( Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe), 蛋氨酸(Met),其中酪氨酸,丙氨酸、颉氨酸的含量相对较高。
总氨基酸含量测定 精密称取各提取物10mg,用蒸馏水配成10 mL,精密吸取0·5 mL置5 mL试管中,加水至2 mL,加茚三酮试剂0·5 mL,摇匀,置沸水浴中15 min,取出以流水冷却,加正丙醇-水(1∶1)混合液至刻度,摇匀,置1 mL比色池中,于570 nm波长处测定吸收度,以丙氨酸溶液为标准溶液绘制标准曲线,计算总氨基酸含量。
实验结果
水提浸膏率为0.58%,总氨基酸得率为0.38%。醇提浸膏率为0.79%,总氨基酸得率为0.61%。酸提浸膏率为0.97%,总氨基酸得率为0.76%。碱提浸膏0.29%,总氨基酸得率为1.96%。酸碱提浸膏率为1.51%,总氨基酸得率为1.18%。酶提浸膏率为10.22%,总氨基酸得率为7.98%。本法提浸膏率为25.25%,总氨基酸得率为18.98%。明显具有优势。
附2:水牛角不同提取方法解热作用的比较研究
采用皮下酵母致热法评价了水牛角不同提取方法的解热作用。结果表明水牛角水提液、酸提水牛角、碱提液、酶解液均可降低酵母致热大鼠体温,具有明显的解热作用。但本发明的仿生态提取方法解热最用最佳。
实验方法:
将选取的健康大鼠随机分为8组,分别为空白对照组、阿司匹林阳性对照组、水牛角水提液、酸提水牛角、碱提液、酸碱提取液、酶解液、仿生态提取液,皮下注射酵母诱导发热,5小时后开始给药,空白组给予等容积生理盐水,以各时间点的体温变化值作组间比较,实验结果数据以平均值±标准偏差表示。结果见表1,表1结果表明水牛角仿生态解热作用最好。
表一 水牛角不同提取方法解热作用的比较研究(X±SD,n=10)
Claims (2)
1. 一种水牛角提取液的制备方法,其特征在于步骤如下:
(1)将水牛角刷净表面,电刨薄片后放入液氮中冷冻后进行粉碎;
(2)将冷冻粉碎得水牛角粉,按料液比1:1-1:10投入胶体磨进行湿法粉碎,得研磨液;
(3)将上述研磨液,加热至沸腾,沸腾后微沸状态继续提取2-6h,然后分离提取液,水牛角继续加水重复上述步骤提取2-4次,过滤后合并提取液浓缩后备用;水牛角药渣备用;
(4)将步骤3水提后的水牛角药渣,加入人工胃液进行水解,温度39℃,水解4-6小时,加热至85℃灭活蛋白酶,过滤后上清液浓缩备用,水牛角药渣备用;所述人工胃液按《中国药典》附录配制:稀盐酸16.4ml,加水800ml与胃蛋白酶10g,摇匀后,加水衡释至100ml,用量同比例放大;
(5)将步骤4水牛角药渣,加入人工肠液进行水解,温度39℃,水解8小时,加热至85℃灭活蛋白酶,过滤后上清液浓缩备用;所述人工肠液按中国药典附录配制:取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8,取胰酶10g,加水量使溶解,将两液混合后,加水稀释至1000ml,用量同比例放大;
(6)将步骤3、4、5所得的浓缩液合并后浓缩,进行透析除盐,除盐后的提取液过微孔滤膜后进行超滤,截取相对分子量分子量15000-20000,收集后浓缩成水牛角提取液;
(7)浓缩液喷雾干燥,称量,计算总提取物收率。
2.按照权利要求1所述的水牛角提取液的制备方法,其特征在于步骤如下:
(1)将水牛角刷净表面,电刨薄片后放入液氮中冷冻后进行粉碎;
(2)将冷冻粉碎得水牛角粉,按料液比1:10投入胶体磨进行湿法粉碎,得研磨液;
(3)将上述研磨液,加热至沸腾,沸腾后微沸状态继续提取4h,然后分离提取液,水牛角继续加水重复上述步骤提取4次,过滤后合并提取液浓缩后备用;水牛角药渣备用;
(4)将步骤3水提后的水牛角药渣,加入人工胃液进行水解,温度39℃,水解4小时,加热至85℃灭活蛋白酶,过滤后上清液浓缩备用,水牛角药渣备用;所述人工胃液按《中国药典》附录配制:稀盐酸16.4ml,加水800ml与胃蛋白酶10g,摇匀后,加水衡释至100ml,用量同比例放大;
(5)将步骤4水牛角药渣,加入人工肠液进行水解,温度39℃,水解8小时,加热至85℃灭活蛋白酶,过滤后上清液浓缩备用;所述人工肠液按中国药典附录配制:取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8,取胰酶10g,加水量使溶解,将两液混合后,加水稀释至1000ml,用量同比例放大;
(6)将步骤3、4、5所得的浓缩液合并后浓缩,进行透析除盐,除盐后的提取液过微孔滤膜后进行超滤,截取相对分子量分子量20000,收集后浓缩成水牛角提取液;
(7)浓缩液喷雾干燥,称量,计算总提取物收率。
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刘国杰: "《中成药学》", 30 June 1991, 中国医药科技出版社 * |
李宝国等: "正交实验优选水牛角酶解的提取工艺研究", 《中国当代医药》 * |
杜雪等: "水牛角粉酶解提取方法探讨", 《药用植物化学与中药有效成分分析研讨会论文集(上)》 * |
林超等: "蜈蚣的酶解工艺研究", 《中医药学术发展大会论文集》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN105012967A (zh) * | 2015-07-21 | 2015-11-04 | 通化金马药业集团股份有限公司 | 一种芩石利咽口服制剂的制备方法 |
CN107320493A (zh) * | 2017-07-07 | 2017-11-07 | 西藏月王藏药科技有限公司 | 一种牦牛角藏药饮片的炮制方法 |
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CN103860596B (zh) | 2017-01-18 |
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