CN102133233A

CN102133233A - 一种具有抗肿瘤活性的蜈蚣提取物及其制备方法

Info

Publication number: CN102133233A
Application number: CN2011100511215A
Authority: CN
Inventors: 田雪飞; 周青; 廖兴华; 孙婧; 艾小佳
Original assignee: Hunan University of Chinese Medicine
Current assignee: Hunan University of Chinese Medicine
Priority date: 2011-03-03
Filing date: 2011-03-03
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2031-03-03
Also published as: CN102133233B

Abstract

本发明涉及一种从中药蜈蚣中分析出抗肿瘤活性的提取物。该提取物是通过将蜈蚣低温粉碎，低温酶解，分离冻干，sephadex G-25凝胶柱分离，所制得的活性组分，其主要有效成分水溶性小分子活性肽。经MTT法检测，该提取物具有较好的抗肿瘤活性。该提取物避免了使用蜈蚣原药材所带来的，大分子蛋白质类药物的临床应用存在一定致敏性、产业化不容易质控的缺点，具有小分子活性肽类药物生产效率高，节省工序，便于质控等优点。

Description

一种具有抗肿瘤活性的蜈蚣提取物及其制备方法

技术领域

本发明属于一种蜈蚣提取物，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的蜈蚣提取物及其制备方法。

背景技术

蜈蚣为蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣的干燥体。主产湖北荆州、宜昌、孝感、郧阳等地市及老河口、襄樊、荆门、枣阳等地。性温，味辛，有毒。归肝、脾、肺经。具有息风镇痉、攻毒散结、通络止痛之功能。用于小儿惊风、抽搐痉挛、中风口眼歪斜、半身不遂、破伤风症、风湿顽痹、疮疡、瘰疬、毒蛇咬伤。《本草纲目》记载，蜈蚣可用于丹毒瘤肿、小儿撮口、小儿急惊、天吊惊风、破伤风、口眼歪斜口内麻木、蝮蛇螫伤、天蛇头疮、瘰疬溃疮、耳出脓、小儿秃疮、痔疮疼痛、腹在如箕、脚吐转筋。

经对现有技术的文献检索发现：周永芹，韩莉MTT法、流式细胞术实验表明中药蜈蚣乙醚、乙醇提取物在体外对宫颈癌Caski细胞的生长有明显地抑制作用，机制与影响癌细胞的DNA合成，阻止瘤细胞的分裂增殖，并促进其凋亡有关。呈现一定的量效和时效相关性(周永芹，韩莉.蜈蚣提取物对官颈癌Caski细胞增殖的抑制效应.中国组织工程研究与临床康复，2007.11(34)：6805-6807)。焦波等用精原细胞法，对蜈蚣的不同溶剂(石油醚、乙醇、水、碱)提取物进行抗肿瘤活性成分的筛选，表明蜈蚣的水提取物和醇提取物均能使小鼠睾丸第7相精细管精原细胞显著减少或消失，提示有一定的抗肿瘤作用。蜈蚣总碱性蛋白对人口腔上皮细胞鳞癌(KB细胞)和人结肠癌细胞(HCT细胞)有明显的抑制作用。其水提取物对肉瘤(S-180)及小鼠肝癌(H22)有明显的抑制活性，抑瘤率分别为24.88％和41.10％；对小鼠肝癌瘤体的抑制率为26％，对人体子宫颈癌细胞TC-26抑制率在90％以上(焦波，篓红祥，王东兴，等.蜈蚣提取物对小鼠精原细胞的作用[J].山东医科大学学报，1999，37(4)：358)。曾红等从少棘蜈蚣中提取出八种抗肿瘤活性成分，结果表明它们对人NCI-H23肺癌细胞、UO-31肾癌细胞、KM-12结肠癌细胞、BEL-7402肝癌细胞和SK-OV-3卵巢癌细胞的生长有抑制作用(曾红，张国刚，程巨龙.蜈蚣中抗癌活性成分的提取.湖北中医杂志，2004，20(5)：57)。李厚伟等研究发现少棘蜈蚣提取物在体外对HepG2细胞的生长有明显地抑制作用，机制与降低细胞内DNA含量，细胞内钙超载有关(李厚伟，张妍，许超千，等.中药HB对喉癌HepG2细胞的抑制作用及其机制研究.哈尔滨医科大学学报，2001，35(4)：261)。

现有技术中，提取蜈蚣蛋白或多肽类成分，采用将蜈蚣粉碎水提后，通过硫酸铵沉淀法沉淀蛋白，然后通过例子交换色谱进行第一步分离，分离后的组分进行活性测定，再对抗肿瘤组分进行疏水色谱分离，将各组分透析、浓缩、冻干后再次进行抗肿瘤活性测定。该发明是通过两部色谱技术从蜈蚣中提取抗肿瘤活性蛋白，并通过SDS-PAGE电泳分析分子量为20kDa(中国专利：CN101747423)，但该技术所提取的蛋白分子量较大。或采用仿生酶解法提取蜈蚣有效部位，酶解完成后于85℃恒温水浴30min作用灭活，收集上清干燥得蜈蚣酶解物，以APTT法、纤维蛋白原平板法为考察指标，对公布了提取的有效部位在抗凝血和溶栓的药物中的应用(中国专利：CN101862349)，所工艺所提取的蜈蚣酶解物未进行进一步的纯化分离，未进行抗肿瘤活性检测。或从蜈蚣毒素中提取抗肿瘤多肽，并用质谱法测定分子量为1296.05Da。该发明证明其抗肿瘤活性是通过作用于人脐静脉内皮细胞来实现，从抑制血管内皮细胞生长角度阐述该多肽的抗肿瘤活性，该发明并未就多肽对肿瘤细胞的增殖抑制作用进行考察(中国专利：CN101899095)。

发明内容

本发明的目的在于从传统中药蜈蚣中提取出一种具有抗肿瘤活性的提取物，该提取物的主要有效成分是水溶性小分子活性肽。鉴于动物类蛋白在人体经过酶解成小分子肽后吸收入血方能发挥药理效应，同时鉴于传统酶解方法，包括仿生酶解方法的高温灭活消化酶的过程可使小分子肽失去活性，本发明采用低温条件下酶解提取蜈蚣蛋白的方法，将蜈蚣蛋白酶解后，经丙酮沉淀，sephadex G-25纯化后获制备成具有活性的小分子肽组分，分子量范围为1000-5000Da；更优选地，分子量范围为1500-3000Da。本发明所提供的蜈蚣抗肿瘤活性的小分子活性肽组分外观为淡白色粉末，经测试具有抗肿瘤作用，对人肝癌HepG2细胞、人肝癌MHCC97-H细胞、人肺癌A549细胞、人前列腺PC-3细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人结肠癌SW480细胞的增殖和生长具有抑制作用，并呈现明显的量效关系。

本发明的蜈蚣抗肿瘤提取物，是通过包括下述步骤的方法提取的：

①将蜈蚣原药材低温粉碎成微粉；

②蜈蚣粉加入超纯水，混匀得混悬液，加入胰蛋白酶低温酶解，反复提取，离心，收集上清液；

③上清液经过丙酮沉淀后离心，所得沉淀经过超纯水溶解后，再使用预冷的丙酮和石油醚沉淀后离心，取沉淀超纯水溶解，-20℃冻存后冻干成粉末；

④冻干粉末使用超纯水溶解，sephadex G-25凝胶柱分离，分离条件为0.1m/LPBS洗脱，流速0.5ml/min；

⑤将各组分进行收集、浓缩冻干，然后经MTT检查进行抗肿瘤活性的测定，其中110min-140min时的洗脱曲线峰所对应的组分为抗肿瘤的蜈蚣提取物。

本发明所述的具有抗肿瘤活性的蜈蚣提取物，其主要有效成分是小分子活性肽组分，其分子量范围在为1000-5000Da，更优选地，分子量范围为1500-3000Da。

本发明所述的抗肿瘤活性测定所采用的方法是MTT法，检测蜈蚣小分子活性肽组分的MTT法采用的肿瘤细胞株如下：人肝癌HepG2细胞、人肝癌MHCC97-H细胞、人肺癌A549细胞、人前列腺PC-3细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和/或人结肠癌SW480细胞。

优选地，本发明所述的具有抗肿瘤活性的蜈蚣提取物，是采用包括下述步骤的方法提取的：

①蜈蚣微粉的制备：将蜈蚣低温粉碎成微粉(粒径为1-75μm)，常温下干燥瓶中保存备用。可以通过BFM-6型贝利微粉机进行粉碎。

②低温酶解：蜈蚣粉加入超纯水(1∶5)，混匀得混悬液，加入胰蛋白酶(终浓度为0.5％)，调节PH值为7.0，4℃低温条件下水解，反复提取5次，每次60分钟，3000g离心5分钟后收集上清液；

③分离冻干：上清液两倍体积丙酮沉淀后5000g离心，取沉淀超纯水溶解，加入两倍体积预冷的丙酮和石油醚(1∶1)沉淀后5000g离心，取沉淀超纯水溶解，-20℃冻存后冻干成粉末；

④纯化：冻干粉超纯水溶解，sephadex G-25凝胶柱分离，分离条件为0.1m/LPBS洗脱，流速0.5ml/min；

⑤将各组分进行收集、浓缩冻干后再次进行抗肿瘤活性测定，最终得到本发明所提供的抗肿瘤小分子活性肽组分。

2)采用MTT法，检测蜈蚣小分子活性肽组分的抗肿瘤活性：

①肿瘤细胞株：人肝癌HepG2细胞、人肝癌MHCC97-H细胞、人肺癌A549细胞、人前列腺PC-3细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人结肠癌SW480细胞。

②接种细胞：取对数生长期的细胞，消化制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml，每孔200μl细胞悬液，接种于96孔培养板中。

③培养细胞：在37℃、5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养24h至贴壁，分为实验组和对照组。

④药物干预：吸去培养液，根据预实验结果设置起始浓度，以1∶2的浓度倍比稀释，实验组分别加入不同浓度药液160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml。同时设置阴性对照组只加完全培养基，调零孔加入相应浓度的药物工作液和完全培养基(无细胞)，实验组和对照组每个浓度均设5个重复孔。

⑤呈色：在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养48h后，每孔加入5mg/mlMTT工作液20μl，孵育4h，去上清，加入DMSO150μl/孔，旋涡振荡器振荡10min充分溶解结晶。

⑥比色：酶标仪492nm波长测定每孔的吸光光度值(OD)，记录结果。

⑦增殖抑制率计算公式：细胞增殖抑制率＝(对照组OD值-药物组OD值)/对照组OD值×100％。药物组、对照组OD值均减去调零孔OD值校正。

有益效果

由于大分子蛋白质类药物的临床应用存在一定致敏性，而且大分子量蛋白类药物研发对产业化的要求较高，因此开发小分子活性肽类药物具有提高生产效率，节省工序，便于质控等优点。虽然仿生酶解法等方法可成功从动物类中药中提取小分子肽，但后续的蛋白酶80℃以上灭活步骤可使大量小分子肽可能失去活性。因此，本发明采用低温酶解的方法，能在提取过程中最大限度保证小分子肽的活性，经sephadex G-25凝胶柱分离后可获得纯化的高活性小分子肽组分，可有效解决以上问题。通过抗肿瘤活性的检测，证明以该方法提取的蜈蚣小分子活性肽组分具有抗肿瘤活性。

附图说明

附图1：蜈蚣酶解提取物经Sephadex G-25分子筛分离纯化后的洗脱曲线图。

具体实施方式

实施例1

蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分的提取：称取蜈蚣微粉4g，加入5倍体积的超纯水，初混合后振荡混匀器中混匀制成混悬液。向混悬液中加入胰蛋白酶使终浓度为0.5％，调节PH值7.0，保持温度4℃低温条件下水解，反复提取5次，每次60分钟，过滤，合并各次滤液，3000g离心5分钟后收集上清液。取其上清液，4℃下5000转离心10分钟。取其上清液，加入两倍体积预冷的丙酮(此过程在冰上进行)，振摇，4℃下5000g离心10分钟。取其沉淀，用水溶解，加入两倍体积预冷的丙酮(此过程在冰上进行)振摇，4℃下5000g离心10分钟。取其沉淀，用水溶解，加入两倍体积预冷的丙酮和石油醚(1∶1)，振摇，4℃下5000g离心10分钟。取其沉淀，用水溶解，-20℃冻存，最后冻干成粉末。称取冻干粉100mg，2mlPBS溶解并过滤，上样于填装好的sephadex G-25凝胶层析柱，0.1m/L PBS洗脱，流速为0.5ml/min，得到3个洗脱组分。洗脱组分丙酮沉淀两次，取其沉淀，超纯水溶解，-20℃冻存，最后冻干成粉末。各洗脱组分进行抗肿瘤活性检测，第二个峰为本发明所公布的蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分。

实施例2：

蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分的人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用：取对数生长期的人肝癌HepG2细胞，消化制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml，每孔200μl细胞悬液，接种于96孔培养板中。37℃、5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养24h至贴壁，分为实验组和对照组。蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml五个梯度药物浓度，同时设置阴性对照组只加完全培养基，调零孔加入相应浓度的药物工作液和完全培养基，实验组和对照组每个浓度均设5个重复孔。37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养48h后，每孔加入5mg/ml MTT工作液20μl，孵育4h，去上清，加入DMSO 150μl/孔，旋涡振荡器振荡10min充分溶解结晶。酶标仪492nm波长测定每孔的吸光光度值(OD)，记录结果。增殖抑制率计算公式：细胞增殖抑制率＝(对照组OD值-药物组OD值)/对照组OD值×100％。药物组、对照组OD值均减去调零孔OD值校正。

结果

蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml五个梯度药物浓度干预后，增殖抑制率分别为83.1％，64.2％，41.3％，21.4％，18.3％；

试验结果表明：蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分能抑制人肝癌HepG2细胞增殖，并呈现明显量效关系。

实施例3：

蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分的人肝癌MHCC97-H细胞的增殖抑制作用：取对数生长期的人肝癌MHCC97-H细胞，消化制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml，每孔200μl细胞悬液，接种于96孔培养板中。37℃、5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养24h至贴壁，分为实验组和对照组。蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml五个梯度药物浓度，同时设置阴性对照组只加完全培养基，调零孔加入相应浓度的药物工作液和完全培养基，实验组和对照组每个浓度均设5个重复孔。37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养48h后，每孔加入5mg/ml MTT工作液20μl，孵育4h，去上清，加入DMSO 150μl/孔，旋涡振荡器振荡10min充分溶解结晶。酶标仪492nm波长测定每孔的吸光光度值(OD)，记录结果。增殖抑制率计算公式：细胞增殖抑制率＝(对照组OD值-药物组OD值)/对照组OD值×100％。药物组、对照组OD值均减去调零孔OD值校正。

结果

蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml五个梯度药物浓度干预后，增殖抑制率分别为94.1％，84.2％，61.8％，36.4％，30.1％；

试验结果表明：蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分能显著抑制人肝癌MHCC97-H细胞增殖，并呈现明显量效关系。

实施例4：

蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分的人肺癌A549细胞的增殖抑制作用：取对数生长期的人肺癌A549细胞，消化制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml，每孔200μl细胞悬液，接种于96孔培养板中。37℃、5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养24h至贴壁，分为实验组和对照组。蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml五个梯度药物浓度，同时设置阴性对照组只加完全培养基，调零孔加入相应浓度的药物工作液和完全培养基，实验组和对照组每个浓度均设5个重复孔。37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养48h后，每孔加入5mg/ml MTT工作液20μl，孵育4h，去上清，加入DMSO 150μl/孔，旋涡振荡器振荡10min充分溶解结晶。酶标仪492nm波长测定每孔的吸光光度值(OD)，记录结果。增殖抑制率计算公式：细胞增殖抑制率＝(对照组OD值-药物组OD值)/对照组OD值×100％。药物组、对照组OD值均减去调零孔OD值校正。

结果

蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml五个梯度药物浓度干预后，增殖抑制率分别为70.0％，53.3％，32.6％，11.8％，8.2％；

试验结果表明：蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分能抑制人肺癌A549细胞增殖，并呈现明显量效关系。

实施例5：

蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分的人前列腺PC-3细胞的增殖抑制作用：取对数生长期的人前列腺PC-3细胞，消化制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml，每孔200μl细胞悬液，接种于96孔培养板中。37℃、5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养24h至贴壁，分为实验组和对照组。蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml五个梯度药物浓度，同时设置阴性对照组只加完全培养基，调零孔加入相应浓度的药物工作液和完全培养基，实验组和对照组每个浓度均设5个重复孔。37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养48h后，每孔加入5mg/ml MTT工作液20μl，孵育4h，去上清，加入DMSO 150μl/孔，旋涡振荡器振荡10min充分溶解结晶。酶标仪492nm波长测定每孔的吸光光度值(OD)，记录结果。增殖抑制率计算公式：细胞增殖抑制率＝(对照组OD值-药物组OD值)/对照组OD值×100％。药物组、对照组OD值均减去调零孔OD值校正。

结果

蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml五个梯度药物浓度干预后，增殖抑制率分别为77.4％，56.3％，41.8％，26.0％，19.7％；

试验结果表明：蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分能抑制人前列腺PC-3细胞增殖，并呈现明显量效关系。

实施例6：

蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分的人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用：取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞，消化制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml，每孔200μl细胞悬液，接种于96孔培养板中。37℃、5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养24h至贴壁，分为实验组和对照组。蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml五个梯度药物浓度，同时设置阴性对照组只加完全培养基，调零孔加入相应浓度的药物工作液和完全培养基，实验组和对照组每个浓度均设5个重复孔。37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养48h后，每孔加入5mg/ml MTT工作液20μl，孵育4h，去上清，加入DMSO 150μl/孔，旋涡振荡器振荡10min充分溶解结晶。酶标仪492nm波长测定每孔的吸光光度值(OD)，记录结果。增殖抑制率计算公式：细胞增殖抑制率＝(对照组OD值-药物组OD值)/对照组OD值×100％。药物组、对照组OD值均减去调零孔OD值校正。

结果

蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml五个梯度药物浓度干预后，增殖抑制率分别为52.3％，38.1％，12.1％，9.3％，7.5％；

试验结果表明：蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分对人乳腺癌MCF-7细胞增殖具有一定抑制作用，并呈现明显量效关系。

实施例7：

蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分的人结肠癌SW480细胞的增殖抑制作用：取对数生长期的人结肠癌SW480细胞，消化制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml，每孔200μl细胞悬液，接种于96孔培养板中。37℃、5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养24h至贴壁，分为实验组和对照组。蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml五个梯度药物浓度，同时设置阴性对照组只加完全培养基，调零孔加入相应浓度的药物工作液和完全培养基，实验组和对照组每个浓度均设5个重复孔。37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养48h后，每孔加入5mg/ml MTT工作液20μl，孵育4h，去上清，加入DMSO 150μl/孔，旋涡振荡器振荡10min充分溶解结晶。酶标仪492nm波长测定每孔的吸光光度值(OD)，记录结果。增殖抑制率计算公式：细胞增殖抑制率＝(对照组OD值-药物组OD值)/对照组OD值×100％。药物组、对照组OD值均减去调零孔OD值校正。

结果

蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml五个梯度药物浓度干预后，增殖抑制率分别为70.5％，52.6％，33.8％，16.5％，14.3％；

试验结果表明：蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分能抑制人结肠癌SW480细胞增殖，并呈现明显量效关系。

Claims

1.一种抗肿瘤提取物的制备方法，包括下述步骤：

①将蜈蚣原药材低温粉碎成微粉；

2.根据权利要求1所述的制备方法，特征在于包括以下步骤：

①蜈蚣微粉的制备：将蜈蚣低温粉碎成粒径为1-75μm的微粉，常温下干燥瓶中保存备用；

②低温酶解：蜈蚣粉加入5倍重量的超纯水，混匀得混悬液，加入胰蛋白酶使得终浓度为0.5％，调节PH值为7.0，4℃低温条件下水解，反复提取5次，每次60分钟，3000g离心5分钟后收集上清液；

③分离冻干：上清液两倍体积丙酮沉淀后5000g离心，取沉淀超纯水溶解，加入两倍体积预冷的丙酮和石油醚等体积混合液，沉淀后5000g离心，取沉淀超纯水溶解，-20℃冻存后冻干成粉末；

⑤将各组分进行收集、浓缩冻干后再次进行抗肿瘤活性测定，最终得到一种抗肿瘤蜈蚣提取物。

3.一种具有抗肿瘤活性的蜈蚣提取物，其特征在于是通过权利要求1或2所述的制备方法提取的。

4.权利要求3所述的具有抗肿瘤活性的蜈蚣提取物，其特征在于该提取物的主要有效成分是小分子活性肽组分，其分子量范围在1000-5000Da。

5.权利要求4所述的具有抗肿瘤活性的蜈蚣提取物，其特征在于该提取物的主要有效成分是小分子活性肽组分，其分子量范围在1500-3000Da范围。

6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中特征在于抗肿瘤活性测定所采用的方法是MTT法，检测蜈蚣小分子活性肽组分的MTT法采用的肿瘤细胞株如下：人肝癌HepG2细胞、人肝癌MHCC97-H细胞、人肺癌A549细胞、人前列腺PC-3细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和/或人结肠癌SW480细胞。