CN103550706A

CN103550706A - 启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用

Info

Publication number: CN103550706A
Application number: CN201310548117.9A
Authority: CN
Inventors: 司富春
Original assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Current assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Priority date: 2013-11-07
Filing date: 2013-11-07
Publication date: 2014-02-05

Abstract

本发明涉及启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用，可有效解决启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤何种部位具有治疗食管癌之功效和提高疗效的问题，方法是，对启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤水煎物进行梯度洗脱，制备不同浓度乙醇洗脱部分并作用与食管癌细胞，筛选启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同洗脱组分中抑制食管癌细胞增殖的有效作用部位，有效作用部位对食管癌细胞生长的影响，从而实现启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用；本发明原材料丰富，制备方法简单，其产品具有治疗食管癌之功效，疗效高，是中药上的创新。

Description

启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药，特别是一种启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用。

背景技术

食管癌（esophageal carcinoma）是消化系统一种常见的恶性肿瘤，全世界每年新增病例45万人，五年生存率不到10%，在世界范围恶性肿瘤中发病率居第八位，死亡率居第六位。我国是食管癌的高发地区之一，特别是河南的林州和河北的磁县，食管癌的发病率居全国各类恶性肿瘤第五位，死亡率居第4位，其中男女发病率比例为1.3～2.7：1，发病年龄多在40岁以上。手术治疗是可切除食管癌的患病部位，但70%～80%的患者就诊时已属中晚期，失去手术机会。目前食管癌的治疗主要是综合治疗，但总体预后仍然很差，因此寻找新的治疗方法和药物是目前治疗食管癌研究的难点。食管癌属于中医“噎嗝”范畴，临床分痰气交阻、津亏热结、瘀血内结和气虚阳微四型，对应方剂分别启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤，且四方在临床应用中已取得肯定疗效，实验研究也发现四方能够抑制肿瘤细胞生长，但四方的具体作用部位和作用机制目前仍不完全明了。而且，启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤水煎液治疗食管癌效果并不理想，因此如何进一步研究和提高启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤对治疗食管癌的效果是人们关心所要解决的技术问题。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用，可有效解决启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤何种部位具有治疗食管癌之功效和提高疗效的问题。

本发明解决的技术方案是，对启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤水煎物进行梯度洗脱，制备不同浓度乙醇洗脱部分并作用与食管癌细胞，筛选启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同洗脱组分中抑制食管癌细胞增殖的有效作用部位，有效作用部位对食管癌细胞生长的影响，从而实现启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用；所述的启膈散是由北沙参90g、丹参90g、茯苓30g、川贝母45g、郁金15g、砂仁壳12g制成；通幽汤由桃仁泥40g、当归身40g、升麻40g、生地黄20g、熟地黄20g、槟榔20g、红花4g、炙甘草4g制成；沙参麦冬汤由北沙参90g、麦冬90g、玉竹60g、天花粉45g、生扁豆45g、生甘草30g制成；补气运脾汤由白术90g、人参60g、橘红 45g、茯苓45g、黄芪45g、半夏30g、砂仁24g和甘草12g制成。

本发明原材料丰富，制备方法简单，其产品具有治疗食管癌之功效，疗效高，有效解决了启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤何种部位治疗食管癌和提高食管癌疗效的问题，是中药上的创新。

附图说明

图1为本发明启膈散水提物量效曲线图。

图2为本发明通幽汤水提物量效曲线图。

图3为本发明沙参麦冬汤水提物量效曲线图。

图4为本发明补气运脾汤水提物量效曲线图。

图5为本发明启隔散30%乙醇洗脱部位量效关系曲线图。

图6为本发明通幽汤50%乙醇洗脱部位量效关系曲线图。

图7为本发明沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位量效曲线图。

图8为本发明补气运脾汤无水乙醇洗脱部位量效曲线图。

图9为本发明食管癌四证方不同洗脱部位对EC9706细胞生长抑制作用时效关系曲线图。

图10为本发明空白对照组×100。

图11为本发明启膈散30%乙醇洗脱相组×100。

图12为本发明通幽汤50%乙醇洗脱相组×100。

图13为本发明沙参麦冬汤50%乙醇洗脱相组×100。

图14为本发明补气运脾汤无水乙醇相组×100。

图15为本发明空白对照组×200。

图16为本发明启膈散30%醇相组×200。

图17为本发明通幽汤50%醇相组×200。

图18为本发明沙参麦冬汤50%醇相组×200。

图19为本发明补气运脾汤50%醇相组×200。

图20为本发明阴性对照组对照组。

图21为本发明启膈散30%乙醇洗脱部位组。

图22为本发明通幽汤50%乙醇洗脱部位组。

图23为本发明沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位组。

图24为本发明补气运脾汤无水乙醇洗脱部位组。

具体实施方式

以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，是由以下技术方案给出。

首先分别选取启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤的原料药物，启膈散是由北沙参90g、丹参90g、茯苓30g、川贝母45g、郁金15g、砂仁壳12g组成；通幽汤由桃仁泥40g、当归身40g、升麻40g、生地黄20g、熟地黄20g、槟榔20g、红花4g、炙甘草4g组成；沙参麦冬汤由北沙参90g、麦冬90g、玉竹60g、天花粉45g、生扁豆45g、生甘草30g组成；补气运脾汤由白术90g、人参60g、橘红45g、茯苓45g、黄芪45g、半夏30g、砂仁24g和甘草12g组成；启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤组成后，分别用超纯水洗去杂质，分别加启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤原料药物重量15倍的超纯水浸泡2小时，煎煮2小时，滤去残渣，滤液浓缩至含生药量为0.5g/ml；再分别5000r/min的转速离心10min，取上清液，过滤，滤液缓慢加入处理好的树脂柱中，上样体积为柱体积的1/5（200ml），以0.5BV/h的速度通过树脂进行缓慢吸附，然后依次应用10BV（8000ml）的超纯水、体积浓度为30%的乙醇（简称30%乙醇，以下同）、体积浓度为50%的乙醇（简称50%乙醇，以下同）、体积浓度为70%的乙醇（简称70%乙醇，以下同）、无水乙醇通过树脂柱，通过树脂柱的前5BV以1BV/h的速度进行洗脱，后5BV以2BV/h速度进行洗脱。分别收集不同洗脱液，回收溶剂，干燥，得启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位，有效用于制备治疗食管癌的药物，实现启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用；

所述的处理好的树脂柱是，大孔吸附树脂D101用无水乙醇浸泡24h，装柱，以2BV/h（1BV=1个柱体积）速度无水乙醇洗冲柱子至洗脱液液与水1︰5不浑浊，同样的洗脱速度水洗至流出液无醇味，4BV的质量浓度为5%的HCl和以质量浓度为2%的NaOH2BV/h的速度依次通过树脂柱，浸泡2h，水洗至中性。

本发明的启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤的启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位，经测试和实验，具有抑制食管癌细胞EC9706生长的作用，有效用于治疗食管癌，其疗效明显优于启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤的水煎液，并经实验得到了有效证明，有关实验资料如下：

1.实验药物

本发明的启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位。

对比药物：启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤的水提物，所述的启膈散水提物、沙参麦冬汤水提物、通幽汤水提物和补气运脾汤水提物是分别按组方称取原料后，分别用超纯水洗去杂质，加30倍超纯水浸泡2小时，煎煮30min，浓缩至100ml，5000r/min离心15min取上清液，用滤纸过滤后浓缩至20ml。

2.主要试剂和仪器

大孔吸附树脂D101（天津市光复精细化工研究所，HG2-885-76）；胰蛋白酶（Sigma）；胎牛血清（PAA）；DMEM培养基干粉（GIBCO）；MTT（Sigma）DMSO（Amresco）；细胞周期检测试剂盒（南京凯基）；Heraeus细胞培养箱（Kendro公司）；倒置显微镜（Zeiss公司）；ELx800型酶标仪（BIO-TEK公司）；BioMate紫外可见分光光度计（Thermo公司）；pH测定仪（HANNA公司）；FACSCalibur流式细胞仪（BD公司）。

3.实验方法

细胞培养

从液氮中取出细胞株EC9706，1min内迅速解冻。将细胞悬液移入15ml离心管，补加10mlDMEM培养基，离心1000r/min，10min。弃上清，加入不含血清的DMEM培养基10ml，吹打混匀，1000rmp10min离心，用含10%胎牛血清的DMEM培养基以1×10⁶个细胞/皿接种于100mm培养皿中，置37℃、5%CO₂饱和湿度的培养箱中培养，每2～3天传代1次。

MTT法测定启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同洗脱部位及其水提物对EC9706细胞的量效关系

以1×10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔平面培养板，200μl/孔，培养24h。分别加入含启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同乙醇洗脱部位的10%小牛血清DMEM培养基200μl，浓度设6.25、12.5、25、50、100、200、400、800μg/ml8个梯度，每个浓度梯度设3个复孔，空白对照组加含10%小牛血清的培养基200μl，继续培养48h。每孔加150μl含10%MTT的无血清DMEM培养基，继续培养4h。每孔加入200μl DMSO，溶解MTT，酶标仪上以570nm/630nm测定光吸收值（OD），按照肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1-用药组OD值/对照组OD值）×100％公式计算各药物组对细胞EC9706增殖的抑制率。找出对细胞抑制作用明显的组分，运用SPSS13.0进行曲线拟合，绘制量效关系曲线图，求出各抑制作用明显组分的半数抑制率IC₅₀值。

按照同样的方法测定测定四方水提物25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1600μg/ml、3200μg/ml8个梯度，对EC9706细胞的量效关系，并计算其IC₅₀值。

MTT法测定启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同洗脱部位对EC9706细胞的时效关系

取抑制作用明显的组分的IC₅₀浓度，同时设4个加药组和对照组，每组3个复孔，通过MTT法检测12h、24h、36h、48h四个时间点药物对细胞的抑制率，确定时间－药效关系，绘制时效关系曲线。

倒置显微镜下观察启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位对细胞EC9706形态的影响

以1×10⁶细胞/ml接种Φ10cm培养皿，于37℃，5%CO₂培养箱培养24h，设空白对照组、启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位5组。24h后，按各治法药物组的IC₅₀值的药物浓度作用细胞，空白对照组加入新的含10%胎牛血清的DMEM培养基。继续培养48小时，倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态。

启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同乙醇浓度洗脱部位对食管癌细胞EC9706周期的影响

以1×10⁶cells/皿细胞密度种细胞EC9706于

100mm培养皿中，培养24h后，弃上清，设空白对照组、启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位5组，每组重复三个皿。各药物组分别加入含各IC₅₀药物浓度的10%小牛血清培养基10ml，空白对照组加等量含血清培养基，继续培养48h。胰酶消化收集细胞，将细胞悬液转至15ml离心管中，2000r/min离心5min，弃上清，4℃PBS（2ml）洗,混匀，2000rpm，5min离心，弃液。4℃PBS（2ml）洗,混匀，计数取1×106个细胞于流式管中,2000rpm，5min离心，弃液；先用4℃PBS悬浮细胞，大约1ml，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞之后，缓慢加入-20℃无水乙醇2.4ml，终浓度为70%乙醇。4℃固定24h以上。离心，1500rpm，5min弃固定液；4℃PBS1ml洗，混匀后，离心1500rpm，5min弃液，4℃PBS1ml洗，混匀，离心，1500rpm，5min弃液。分别加入100μl RNAase，37℃水浴30min；再加入400μl PI，染色液混匀，4℃避光30min。300目的尼龙滤膜直接过滤到流式检测管中，每样本获取10⁴个细胞荧光信号，激发波长488nm，用CellQuest Pro获取、MODFIT软件检测EC9706细胞周期分布。周期分布用GO/G1%，S%，G2/M%表示。

统计学分析方法：采用SPSS13.0统计软件，F检验，曲线拟合

4.结果

启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同梯度浓度乙醇洗脱部位分析

经过大量预实验发现，实验中所采用的打孔吸附树脂洗脱条件下，得到的各组出膏率均较大且比较稳定。不同组分洗脱液进行浓缩烘干后得到不同组分的药物干粉，各四方各组分出膏率大小顺序一致：纯水部位＞30%乙醇洗脱部位＞50%乙醇洗脱部位＞70%乙醇洗脱部位＞无水乙醇洗脱部位，见表1。

表1食管癌证方不同乙醇浓度洗脱部位出膏分析

启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同浓度乙醇洗脱部位及其水提物抑制细胞EC9706增殖量效关系

分别以各洗脱部位的浓度为横坐标、对细胞的抑制率为纵坐标，运用SPSS13.0回归分析进行曲线拟合，拟合剂量-效应关系曲线，并按概率（probability）估计求出IC50值。结果显示：启隔散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%的乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位及各方水提醇沉物对细胞生长具有明显抑制作用，且呈剂量-效应依赖性关系。其作用强弱顺序水提物为：启膈散＞通幽汤＞沙参麦冬汤＞补气运脾汤，洗脱部位为：沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位＞补气运脾汤无水乙醇洗脱部位＞启膈散30%乙醇洗脱部位＞通幽汤50%乙醇洗脱部位，结果见表2-7、图1-8。

表2启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤水提物对EC9706细胞增殖的影响

表3启膈散各乙醇浓度洗脱部位不同浓度与细胞抑制率的关系

表4通幽汤各乙醇浓度洗脱部位不同浓度与细胞抑制率的关系

表5沙参麦冬汤各乙醇浓度洗脱部位不同浓度与细胞抑制率的关系

表6补气运脾汤各乙醇浓度洗脱部位不同浓度与细胞抑制率的关系

表7各药物组对细胞EC9706生长的量效关系拟合方程参数及其IC50值

根据曲线概率估计，求出各组IC₅₀值。启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤各组药物IC₅₀分别为1124.06μg/ml、183.12μg/ml、4340.74μg/ml，补气运脾汤水提物对细胞作用较弱，IC₅₀值较大。启膈散30%乙醇浓度洗脱部位、通幽汤50%乙醇浓度洗脱部位、沙参麦冬汤50%乙醇浓度洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇浓度洗脱部位，各组半数抑制率IC₅₀分别为825.09μg/ml、860.66μg/ml、270.43μg/ml、634.60μg/ml。

启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同浓度乙醇洗脱部位抑制EC9706细胞增殖时效关系

启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤50%乙醇洗脱部位、沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位对人食管癌EC9706细胞均有明显抑制作用，各组分对EC9706细胞增殖抑制率随时间的增加而上升，呈现显著的时间-效果依赖性关系（见表8），绘制不同洗脱部位对EC9706细胞生长抑制作用时效曲线的对比图（见图9）。

表8食管癌证方不同洗脱部位抑制人食管癌细胞EC9706增殖时效关系

启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同浓度乙醇洗脱部位对EC9706细胞形态的影响

启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤50%乙醇洗脱部位、沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位IC₅₀值药物浓度作用EC9706细胞48h，倒置显微镜下观察。对照组细胞生长状态良好，细胞膜轮廓清楚，形态饱满，呈多边形，细胞接触紧密，增殖旺盛，分布均匀；药物组对EC9706细胞生长增殖抑制作用明显，细胞数量较对照组少，增长缓慢，且不同药物组对细胞形态影响差异较大。启膈散30%乙醇洗脱部位组细胞间接触松散，细胞汇合率低，细胞固缩呈圆形或卵圆形且透明度降低。通幽汤50%乙醇洗脱部位组细胞生长较分散，对细胞形态影响不大，但细胞数量明显较少；沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位作用组细胞皱缩，细胞细胞膜粗糙，透光度减低；补气运脾汤无水乙醇洗脱部位作用组细胞变圆，细胞间隙增大，漂浮的死细胞较多。见图10-19

3.5启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同浓度乙醇洗脱部位对食管癌EC9706细胞周期的影响

表9食管癌证方不同乙醇浓度作用细胞周期（FCM）分析

从表9和图20-24看出，与未加药空白对照组比较，启膈散30%乙醇洗脱部位组和补气运脾汤无水乙醇洗脱部位组G0/G1期细胞比率有所上升，其中补气运脾汤无水乙醇洗脱部位组上升显著；而各药物组S期细胞比率均降低；各药物组G2/M期细胞比率升高，其中通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位组G2/M期细胞比率升高显著。从上述各药物组细胞周期检测结果来看，启膈散30%乙醇洗脱部位组和补气运脾汤无水乙醇洗脱部位组G0/G1期细胞比率明显增加，表明这两组药物主要是阻断细胞周期的G0/G1期，而抑制肿瘤细胞的生长。通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位组G2/M期比率较大，说明这两组药物主要将细胞阻断于G2/M而抑制肿瘤细胞生长。

结论

中药复方是中医传统理论中辨证论治的一部分，但长期以来由于中药复方成分复杂，它的作用机制至今仍不能完全阐明，因此是中医药发展的最大障碍。提取分离中药复方成分而从中找出活性部位是中医药发展的关键，也是中医药发展的趋势。目前常用的提取方法有煎煮法、回流法、浸渍法、渗漉法等，而提取新技术超临界萃取(SFE)、超声波法、半仿生提取法、酶化学技术、微波萃取技术(MAE)、高速逆流色谱提取(HSCCC)；分离技术有色谱柱分离法、膜分离、絮凝吸附沉淀法、超滤法、高速离心法等。大孔吸附树脂（macroporous adsorption resin）是近30年发展起来的一种新型不溶于酸、碱及各种有机溶剂的高分子聚合物吸附剂，它同时具有分子筛和吸附作用的双重原理，筛选性是由于多孔性结构使其对分子大小不同的物质具有选择性的，吸附作用其吸附力是范德华力和氢键的作用。近年来，大孔吸附树脂已被广泛应用于临床鉴定及抗生素及生化药物的分离纯化等领域，在我国的中药现代化研究中，应用大孔树脂分离富集中药有效成分及中药复方有效部位已越来越受到重视。其中大孔吸附树脂D101因操作方便，价格便宜、分离成分比较广，因而被广泛的应用。大孔吸附树脂提取工艺中最重要的影响因素为药物上样浓度和洗脱速度。上样浓度过高会造成树脂柱的堵塞，上样浓度太低会造成树脂柱的效价降低；洗脱速度过快会造成成分流失，洗脱速度太慢则造成时间浪费。本研究选用含生药量为0.5μg/ml，药物用0.5BV/h的速度进行吸附速度进行吸附，能够使药物能够充分被树脂吸附。洗脱液采用10BV的洗脱液采用不同的洗脱速度进行洗脱，前5BV以1BV/h进行缓慢洗脱，使有效成分被充分洗脱，后5BV以2BV/h进行快速洗脱，以节约时间。此洗脱条件得到出膏率最大，并且稳定可靠。

在中医传统用药的水煎基础上，将水煎液中不同极性成分进行分离，再进行实验研究，能够更好反映药物作用部位和机制。本研究采用传统水煎提取法制备食管癌证方汤剂用75%乙醇出去多糖而得到水提醇沉提取液。分部提取则用传统水煎法提取启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤水煎液通过树脂柱进行分离，并采用纯水-无水乙醇5个乙醇浓度梯度进行洗脱，根据醇的浓度不同从而将四方中不同极性的组分进行分离，得到5个不同极性的洗脱部位，其大小顺序为纯水洗脱部位＞30%乙醇洗脱部位＞50%乙醇洗脱部位＞70%乙醇洗脱部位＞无水乙醇洗脱部位，此结果表明四方水煎液中极性化合在水煎液中所占比重较大。而非极性的成分所占比重较小。此结果与水煎法的纯水溶剂相关，根据相似相溶原理，因此极性成分所占比重较大，而非极性成分较少。

启膈散源于清代医家程国彭《医学心悟》卷三噎膈篇，针对痰气交阻证，发挥降气化痰的功效，全方由沙参、茯苓、丹参、川贝、郁金、砂仁壳、荷叶蒂和杵头糠组成，诸药共奏开郁化痰，降气润燥之功。通幽汤源于金代医家李杲《兰室秘藏大便结燥门》卷下治大便难，幽门不通之方剂，针对瘀血内结之证，发挥破结散瘀之功，全方由生地黄、熟地黄、桃仁泥、红花、当归、炙甘草、升麻、槟榔组成，方中桃仁、红花破结而行瘀；当归、生地、熟地滋阴养血以润燥；槟榔下行而破气滞；升麻升清而降浊阴，一升一降，其气乃通，噎膈得开；炙甘草和中，诸药共奏破结行瘀，滋阴养血之功。沙参麦冬汤源于清代医家吴瑭《温病条辨卷一·上焦篇》治疗秋燥之方剂，针对津亏热结证，发挥滋养津液，泻热散结之功，全方由沙参、麦冬、玉竹、桑叶、生甘草、天花粉和生扁豆组成，方中沙参、麦冬、玉竹滋养津液；桑叶、天花粉养阴泻热；甘草、扁豆安中和胃，诸药共奏养阴生津，泻热散结之功。补气运脾汤明代医家王肯堂《证治准绳二类方反胃》卷三引明·叶文龄撰，刊于1535年《医学统旨》，针对气虚阳微，发挥补气升阳之功效，全方由人参、白术、茯苓、甘草、黄芪、陈皮、砂仁、半夏曲、生姜、大枣组成。方中以人参、白术、茯苓、甘草、黄芪、大枣补脾益气为主；陈皮、砂仁、半夏、生姜和胃降逆为辅，诸药合用共奏温补脾肾，益气回阳之功。

本发明将食管癌证方水提醇沉提取物和分部提取得到的不同组分分别作用于食管癌细胞，而筛选食管癌证方的有效作用部位。本研究发现启隔散30%乙醇洗脱部位、通幽汤50%乙醇洗脱部位、沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位四个组分，对细胞生长的抑制作用远大于对应证方水提物的抑制作用。各组的IC₅₀值分别为启隔散1227μg/ml、通幽汤1900.74μg/ml、沙参麦冬汤4340.74μg/ml、补气运脾汤作用较弱、启隔散 30%乙醇洗脱部位825.09μg/ml、通幽汤50%乙醇洗脱部位860.66μg/ml、沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位270.43μg/ml、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位634.60μg/ml，由这些结果我们可以看出与药物水煎提取物相比，分部提取能够将药物有效成分进行分离提取出来，从而大大增强药物疗效，尤其是水煎液提取物作用较弱的沙参麦冬汤和补气运脾汤。说明此四部位是食管癌证方发挥药效的有效部位，四部位含有抗肿瘤的活性成分，各证方抗肿瘤的活性部位，其中沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位两个组药物的研究可为抗肿瘤药物的研究提供新的借鉴。通过对隔30%乙醇洗脱部位、通幽汤50%乙醇洗脱部位、沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位四个组分的深入研究有可能为抗肿瘤药物研制提供新的治疗策略和手段

启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位以及补气运脾汤无水乙醇提取部位对EC9706细胞生长增殖抑制作用明显，增长缓慢，且对细胞形态影响差异较大。启膈散30%乙醇洗脱部位组细胞间接触松散，细胞汇合率低，细胞固缩呈圆形或卵圆形且透明度降低。通幽汤50%乙醇洗脱部位组细胞生长较分散，对细胞形态影响不大，但细胞数量明显较少；沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位作用组细胞皱缩，细胞细胞膜粗糙，透光度减低；补气运脾汤无水乙醇洗脱部位作用组细胞变圆，细胞间隙增大，漂浮的死细胞较多。四组有效部位说明以上四个组分抑制人食管癌EC9706细胞生长作用机制可能不同，提示痰气交阻、瘀血内结、津亏热结，气虚阳微四证型病机在食管癌发发生发展过程中可能存在不同的病变机制。

真核细胞周期（cell dividing cycle）是指能持续分裂的真核细胞从有丝分裂完成到下一次分裂结束所经历的一个有序的过程，分为DNA合成前期（G₁/G₀期），DNA合成期（S期），DNA合成后期（G₂期）和有丝分裂期（M期），其中G1期发生于M期以后S期之前，G2期发生于S期以后M期之前。恶性肿瘤中细胞周期调节失控，细胞呈无限制的自主增殖与分裂，整个细胞周期中的G₁期细胞不断进入S期，使S期细胞数增加，DNA含量增加。细胞周期分析是细胞生物学、肿瘤学等学科中重要的检测手段及研究指标，利用流式细胞术(flow cytometry，FCM)进行DNA含量测定是细胞周期分析的重要手段，是目前最广泛使用的方法之一,用流式细胞术检测DNA结合PI的荧光强度反映出胞内DNA的含量。

FCM检测结果显示，用启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤50%乙醇洗脱相组分、沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位IC₅₀浓度作用EC9706细胞48h，对细胞周期各时相均有影响。与未加药空白对照组相比较，启膈散30%乙醇洗脱部位组和补气运脾汤无水乙醇洗脱部位组组G0/G1期细胞比率有所上升，其中补气运脾汤无水乙醇洗脱部位组上升显著；通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位作用的EC9706细胞G0/G1期比率降低，其中沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位组G0/G1期细胞比率显著降低；而各药物组S期细胞比率均降低，其中补气运脾汤无水乙醇洗脱部位下降比率较大；各药物组G2/M期细胞比率升高，其中沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位部位组G2/M期细胞比率升高显著。

G₁期细胞是制造产生rRNA、mRNA、tRNA和核蛋白体，启膈散30%乙醇洗脱部位组和补气运脾汤无水乙醇洗脱部位组G0/G1期细胞比率明显增加，两组药物抑制G₁期细胞的进程，造成G₁期细胞停滞，难以进入S期合成DNA从而抑制肿瘤细胞增殖。通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位组G2/M期比率较大，这表明EC9706细胞被阻止于G₂/M期，更多的细胞损伤过重，超过了自身修复能力，难以通过G₂期限制点，而使有丝分裂受阻，抑制肿瘤细胞生长。

本发明采用中药复方分离提取方法对食管癌四个证方进行分部提取，筛选出了启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤50%乙醇洗脱部位、沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位和补气运脾汤无水乙醇洗脱部位四个组分是食管癌四证方抑制肿瘤细胞增殖的活性部位，能够抑制食管癌EC9706细胞增殖是肯定的，其效果明显优于口服的水煎汤剂，提高了启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤的药用价值，是中药上的创新，有效用于治疗食管癌，有实际的临床意义和应用价值。

Claims

1.一种启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用，所述的启膈散由北沙参90g、丹参90g、茯苓30g、川贝母45g、郁金15g和砂仁壳12g组成；所述的通幽汤由桃仁泥40g、当归身40g、升麻40g、生地黄20g、熟地黄20g、槟榔20g、红花4g和炙甘草4g组成；所述的沙参麦冬汤由北沙参90g、麦冬90g、玉竹60g、天花粉45g、生扁豆45g和生甘草30g组成；所述的补气运脾汤由白术90g、人参60g、橘红45g、茯苓45g、黄芪45g、半夏30g、砂仁24g和甘草12g组成；启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤组成后，分别用超纯水洗去杂质，分别加启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤原料药物重量15倍的超纯水浸泡2小时，煎煮2小时，滤去残渣，滤液浓缩至含生药量为0.5g/ml；再分别以5000r/min的转速离心10min，取上清液，过滤，滤液缓慢加入处理好的树脂柱中，上样体积为柱体积的1/5，以0.5BV/h的速度通过树脂进行缓慢吸附，然后依次应用10BV的超纯水、体积浓度为30%的乙醇、体积浓度为50%的乙醇、体积浓度为70%的乙醇、无水乙醇通过树脂柱，通过树脂柱的前5BV以1BV/h的速度进行洗脱，后5BV以2BV/h速度进行洗脱，分别收集不同洗脱液，回收溶剂，干燥，得启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位。