CN102309538B - 一种复方地龙提取物及其制备方法和其组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种复方地龙提取物及其制备工艺和其组合物，所述复方地龙提取物中各成分之间的重量配比为：地龙鲜品25份、川芎3.5份、黄芪3份、牛膝2份，其制备步骤包括：1)地龙粉的制备：取组成量的地龙鲜品，清洗，沥干，加等重量水，在37℃搅拌匀浆，离心，取上清液进行膜滤过，浓缩，浓缩液经冷冻干燥，即得；2)川芎、牛膝、黄芪提取物的制备：取组成量的川芎、牛膝和黄芪，加入50-90％乙醇溶液，乙醇溶液的用量为6-10倍，回流提取二次，每次2小时，过滤，合并醇液，回收醇液，将其浓缩至相对密度约为1.1-1.5，干燥，即得；3)复方地龙提取物的制备：将步骤1)制得的地龙粉与步骤2)制得的川芎、牛膝、黄芪提取物均匀混合，即得。

Description

一种复方地龙提取物及其制备方法和其组合物

技术领域

本发明涉及药物领域，特别涉及一种复方地龙提取物及其制备工艺和其组合物。

背景技术

复方地龙胶囊载于《国家药品标准新药转正标准》第37册，由地龙(鲜品)、川芎、黄芪、牛膝四味中药经科学方法提取精制而成的纯中药制剂，其中，各组分的重量份为：地龙鲜品25份、川芎3.5份、黄芪3份、牛膝2份。

复方地龙胶囊具有化瘀通络、益气活血的功能，主治缺血性脑血管疾病，用于缺血性中风中经络恢复期气虚血瘀证的治疗，症见半身不遂、口舌歪斜、言语蹇涩或不语、偏身麻木、乏力、心悸气短、流涎、自汗等。组成中各药材所含有效成分及其药理作用分述如下：

地龙：钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的鲜品或干燥体，主要含有蚯蚓纤溶酶(EFE)、蚯蚓解热碱、蚯蚓素、蚯蚓毒素、黄嘌呤、腺嘌呤、胆碱等成分，具有抗栓溶栓作用，还可修复脑血栓、脑梗塞发生周边坏死组织，改善血栓及中风后遗症，以及溶血、解热、降压、扩张血管等作用。主产于广东、广西、河南、山东、江苏、福建等地。

川芎：伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，主要含有藁本内酯、川芎嗪、中性油等成分，具有扩张血管和降低外周动脉血流阻力作用，增加脑血流量，抑制血小板活性，改善微循环及镇痛、镇静、镇痉、抗炎、安胎等作用，且对突发性耳聋具有很好疗效。主产于四川。

黄芪：豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，主要含有单糖、多糖、蛋白质、黄芪皂苷I-VIII等成分，具有益气行瘀、通络，增强免疫力，增强病毒诱生干扰素的能力，增强机体耐缺氧及应激能力，促进机体代谢，改善心功能，降压，保肝，调节血糖，抗菌和抑制病毒等作用，以及减少脑缺血范围的趋势。主产于山西、黑龙江、内蒙古、甘肃等地。

牛膝：苋科植物牛膝Achyranthes bidentata Blume的干燥根，主要含有皂甙，三萜皂甙及其水解产物(齐墩果酸、葡糖醛酸等)、蜕皮甾酮(ecdysterone)、牛膝甾酮(inokosterone)及有免疫活性的牛膝肽多糖ABAB等，具有散瘀血、补肝肾、强筋骨等作用。主产于河南。

复方地龙提取物为制备复方地龙胶囊或其相关制剂的原料。其中，复方地龙提取物中的活性成分蚯蚓纤溶酶(EFE)是一类纤维蛋白水解酶，含有多种纤维蛋白溶解酶及纤维酶原激活物，活性成分的分子量范围约为15000-70000D(反相色谱分离蚯蚓纤溶酶的初步研究：刘芳，等；生物工程学报12(增刊)：289-291，1996)。纤维酶原激活物可以切割碱性氨基酸及小分子量的中性氨基酸，并将纤溶酶原切割为纤溶酶，不仅具有激活纤维酶原的类尿激酶活性，也具有直接水解纤维蛋白的纤溶酶活性，其溶栓作用是多层次的，体内溶栓作用比尿激酶高。并且，具有热不稳定性，遇热易破坏。

复方地龙提取物中的有效成分阿魏酸具有抗血小板聚集，抑制血小板5-羟色胺释放，抑制血小板血栓素a2(txa2)的生成，增强前列腺素活性，具有镇痛、缓解血管痉挛等作用，为生产用于治疗心脑血管疾病及白细胞减少等药品的基本原料。

复方地龙提取物中的有效成分黄芪甲苷具有改善心肺功能，加强心脏收缩力，扩张血管，降低血压，改善皮肤血液循环和营养状况等作用。

CN1726955A公开了一种复方地龙软胶囊及其制备方法，该技术存在下述缺陷：

1)部分黄芪药材采用打粉入药，难以保证其粉碎粒度，且黄芪粉加入到其它提取物中一起干燥，难以保证疗效，且操作繁琐；

2)地龙干品的活性远远低于鲜品，且采用打粉入药，难以保证其疗效；

3)复方地龙提取物的溶解性不好，其内容物微溶于溶剂中，须加入助悬剂等辅料，再经胶体磨均匀混合以完成制备，该方法会因内容物的温度升高而致活性成分的降解而影响复方地龙提取物的活性；

4)采用滴制或压制法制备软胶囊时，胶皮、内容物均需加热，而加热而致活性成分的降解而影响复方地龙提取物的活性；

5)胶囊易散发出药物的腥味等不良气味，患者不容易接受，且胶囊中的有效成分在人体吸收慢，影响复方地龙提取物的生物利用度；

6)复方地龙提取物粉末的吸湿性很强，容易吸水而增加粘性，并导致有效成分的吸潮变质，降低崩解剂的崩解效能，延长崩解时间；复方地龙提取物粉末的流动性较差，较难控制胶囊药物的装量差异；不仅影响制剂的制备，且因吸湿造成提取物中有效成分的降解而影响药物的有效性、稳定性和安全性；

7)工艺不够优化，导致复方地龙提取物中的有效成分含量偏低，如原有的质量标准中仅限定阿魏酸的含量不少于30μg/粒。

发明内容

本发明的另一目的在于提供一种复方地龙提取物的制备方法，所述提取物中各成分之间的重量份为：地龙鲜品25份、川芎3.5份、黄芪3份、牛膝2份，其特征在于，复方地龙提取物的制备步骤包括：

1)地龙粉的制备：取组成量的地龙鲜品，清洗，沥干，加等重量水，在35℃-40℃搅拌匀浆，离心，取上清液进行膜滤过浓缩，浓缩液经冷冻干燥，即得；

2)川芎、牛膝、黄芪提取物的制备：取组成量的川芎、牛膝和黄芪，加入50-90％乙醇溶液，乙醇溶液的用量为6-10倍，回流提取至少一次，每次1-2小时，过滤，合并醇液，减压浓缩回收乙醇，将醇液浓缩至相对密度约为1.1-1.5的浓缩液，干燥，即得；

3)复方地龙提取物的制备：将步骤1)制得的地龙粉与步骤2)制得的川芎、牛膝、黄芪提取物均匀混合，即得。

本发明的优选技术方案中，步骤1)所述的搅拌匀浆温度为37℃-38℃。

本发明的优选技术方案中，步骤1)所用高分子超滤膜的截留分子量为10000D。

本发明的优选技术方案中，步骤1)的冷冻干燥条件为-40℃--45℃。

本发明的优选技术方案中，步骤2)所用乙醇浓度为60-80％，优选为70％。

本发明的优选技术方案中，步骤2)所述的乙醇回流提取次数为2-3次。

本发明的优选技术方案中，步骤2)所述乙醇溶液的用量为7-9倍，优选为8倍。

本发明的优选技术方案中，步骤2)中浓缩液的相对密度为1.2-1.4，优选为1.3。

本发明的优选技术方案中，步骤2)中所述干燥选自减压干燥、喷雾干燥的任一种或其组合，优选为喷雾干燥。

本发明选用鲜地龙在低温(35-40℃)条件下搅拌匀浆制备地龙匀浆提取物，并采用高分子超滤设备(如超滤膜)分离、浓缩地龙匀浆提取液，避免了地龙匀浆提取液在加热浓缩过程中有效成分(如蚯蚓纤溶酶等)的热降解，从而很好地保留了地龙匀浆提取物中的蚯蚓纤溶酶(EFE)等有效成分；再将地龙匀浆提取物的膜浓缩物进行冷冻干燥，以有效保留其有效成分，避免有效成分(如蚯蚓纤溶酶)的热分解，并且，制得的地龙提取物具有质地疏松，加水后迅速溶解，复溶性好，含水量低，稳定性好，受污染机会少，产品质量高等优点，且利于地龙提取物的贮存。

本发明采用乙醇溶液提取，结合减压干燥、喷雾干燥浓缩液等方法制备川芎、牛膝、黄芪提取物，很好地保留了其中的有效成分阿魏酸和黄芪甲苷，利于提高复方地龙提取物的有效性、稳定性和安全性。

本发明的目的在于提供一种复方地龙提取物，由本发明所述的制备方法制备得到。

本发明的另一目的在于提供一种含有复方地龙提取物的药物组合物，由复方地龙提取物与药学上可接受的载体组成。

本发明组合物可为本领域熟知的各种剂型，适合于本发明的剂型选自口服制剂、外用制剂或注射剂，优选为口服制剂。口服制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、滴丸、糖浆剂、合剂、露剂、泡腾剂、糊剂、乳剂、茶剂、口服液、悬浮剂(干悬剂或悬浮液)或茶剂等；外用制剂选自凝胶剂、膏剂(贴膏剂、凝膏剂或软膏剂)、搽剂、洗剂、涂抹剂、膏药、霜剂、软膏剂、栓剂等；注射剂选自针剂(注射剂)、输液或冻干粉针等。可采用本领域熟知的制剂技术手段制备得到本发明的组合物。

必要时，本发明组合物中还包含药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体的用量、种类根据组合物中有效成分的理化性质和含量、制剂类型、制剂技术等因素而定。

本发明所述药学上可接受的载体为本领域熟知的用于制备上述制剂的常用赋形剂或辅料。口服制剂或外用制剂常用的赋形剂或辅料包括但不仅限于填充剂(稀释剂)、润滑剂(助流剂或抗粘着剂)、分散剂、湿润剂、粘合剂、调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、崩解剂等。粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素及其衍生物(如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素或羟丙甲基纤维素等)、明胶浆、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂，例如乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、沉降碳酸钙等)、山梨醇或甘氨酸等；润滑剂，例如微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油、聚乙二醇等；崩解剂，例如淀粉及其衍生物(如羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉、玉米淀粉等)、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素等；湿润剂，例如十二烷基硫酸钠、水或醇等。

本发明所述注射剂常用的赋形剂或辅料包括但不仅限于：抗氧剂，例如亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酸等；抑菌剂，例如0.5％苯酚、0.3％甲酚、0.5％三氯叔丁醇；调节剂，例如盐酸、枸橼酸、氢氧化钾(钠)、枸橼酸钠、磷酸二氧钠和磷酸氢二钠组成的缓冲剂等；乳化剂，例如聚山梨酯-80、没酸山梨坦、普流罗尼克F-68，卵磷酯、豆磷脂等；增溶剂，例如吐温-80、胆汁、甘油等。

另外，还可将活性成分与药学上可接受的缓控释载体按其制备要求加以混合，再按照本领域熟知的缓控释制剂的制备方法加以制备，如加入阻滞剂包衣或将活性成分微囊化后再制成微丸，如缓释微丸或控释微丸；所述的缓控释载体包括但不仅限于油脂性掺入剂、亲水胶体或包衣阻滞剂等，所述的油脂性掺入剂选自单硬脂酸甘油酯、氢化蓖麻油、矿油、聚硅氧烷或二甲基硅氧烷的任一种或其组合；所述的亲水胶体选自羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、PVP、阿拉伯胶、西黄耆胶或卡波普等的任一种或其组合；所述的包衣阻滞剂选自乙基纤维素(EC)、羟丙甲基纤维素(HMPC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、丙烯酸类树脂等的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述药物组合物的制剂形式选自片剂、混悬液、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、滴丸剂、糖浆剂、合剂、露剂、泡腾剂、糊剂、乳剂、茶剂、粉剂、针剂(注射剂)、输液、凝胶剂、贴膏剂、膏药、霜剂、软膏剂、搽剂、洗剂、栓剂、涂抹剂、膏剂、凝膏剂的任一种。

本发明的另一目的在于提供一种含有复方地龙提取物的药物组合物的制备方法，由复方地龙提取物与药学上可接受的载体均匀混合而成。

本发明的另一目的在于提供复方地龙提取物或含有复方地龙的药物组合物用于制备治疗缺血性脑血管疾病或缺血性中风中经络恢复期气虚血瘀证的药物中的应用。

本发明的优选技术方案中，所述的缺血性中风中经络恢复期气虚血瘀证的症见半身不遂、口舌歪斜、言语蹇涩或不语、偏身麻木、乏力、心悸气短、流涎、自汗的任一种或其组合。

为了清楚地表述本发明的保护范围，本发明对下述术语进行如下定义：

本发明所述的“地龙鲜品”又称鲜地龙，是指未经干燥的地龙鲜品。

本发明所述的“地龙提取物”是指取组成量的鲜地龙，清洗，沥干，加等重量水，在35℃-40℃(优选37℃-39℃)搅拌匀浆，离心，取上清液进行膜滤过浓缩，浓缩液经冷冻干燥，即得。

本发明所述的“川芎、牛膝、黄芪提取物”是指取组成量的川芎、牛膝和黄芪，加入50-90％乙醇溶液，乙醇溶液的用量为6-10倍，回流提取至少一次(优选2-3次)，每次1-2小时，过滤，合并醇液，减压浓缩回收乙醇，将醇液浓缩至相对密度约为1.1-1.5的浓缩液，干燥，即得。

本发明所述的生物活性(u/g生药)是指地龙提取物的生物活性，其中，测定生物指标为纤溶酶活性，再按照每克生药换算而得。

本发明所述固形物的测定方法为：将提取液置于干燥箱中，105℃干燥至恒重，即得。

本发明所述的生物活性的测定方法包括下述步骤：

1)纤维蛋白原溶液的制备：取牛血纤维蛋白原1支，用硼砂缓冲液(取四硼酸钠32.42g和氯化钠5.84g，加蒸馏水500ml，加热溶解，用7mol/l盐酸调节pH值至7.8)制成每1ml含2mg的溶液，即得；

2)纤维蛋白标准板的制备：取已消毒的培养皿2只，分别加入纤维蛋白原溶液10ml，快速加入凝血酶溶液(用上述硼砂缓冲液制成每1ml含牛凝血酶40单位)0.5ml，混匀，室温静置10分钟，即成纤维蛋白标准板；

3)供试品溶液的制备：取地龙提取物适量，精密称定，加无菌水制成含本品每1ml含0.6mg的溶液，振摇20分钟，离心，取上清液作为供试品溶液；

4)测定法：取纤维蛋白板2只，吸取供试品溶液点于板上，每只点两个点，每点10μl，置37℃电热恒温箱中放置18小时，取出，分别测出每个点溶斑的长径和短径。计算，每个点溶斑面积(长径×短径)mm²，即为纤溶酶活性。

本发明所述的阿魏酸的测定方法包括下述步骤：

1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-1％冰醋酸(30∶70)为流动相；检测波长为313nm。理论板数按阿魏酸计算应不低于2000；

2)对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品8mg，精密称定，置20ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取1ml，置50ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得(每1ml含阿魏酸8μg的溶液)；

3)供试品溶液的制备：取本品，研细，称取约0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密闭，称定重量，超声处理(功率220W，频率50KHz)20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密取续滤液25ml，蒸干，残渣用流动相溶解，转移到10ml容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明所述的黄芪甲苷的测定方法包括下述步骤：

1)色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(32∶68)为流动相；蒸发光散射检测器。理论塔板数以黄芪甲苷峰计算应不低于4000；

2)对照品溶液的制备：精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含0.25mg和每1ml含0.5mg的溶液，即得；

3)供试品溶液的制备：取细粉约3g，精密称定，加甲醇100ml，加热回流2小时，放冷，过滤提取液，回收溶剂并浓缩至干，残渣加水15ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次30ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次30ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.1cm，柱高10cm)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

4)测定法：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。

除非另有说明，本发明所述的百分比为液体与液体之间的百分比时为体积/体积百分比，当百分比为液体与固体之间的百分比时为体积/重量百分比，当百分比为固体与液体之间的百分比时为重量/体积百分比，其余为重量/重量百分比。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

1、本发明选用鲜地龙在低温(35-40℃)条件下搅拌匀浆制备地龙匀浆提取物，并采用高分子超滤设备(如超滤膜)分离、浓缩地龙匀浆提取液，避免了地龙匀浆提取液在加热浓缩过程中有效成分(如蚯蚓纤溶酶等)的热降解，从而很好地保留了地龙匀浆提取物中的蚯蚓纤溶酶(EFE)等有效成分；再将地龙匀浆提取物的膜浓缩物进行冷冻干燥，以有效保留其有效成分，避免有效成分(如蚯蚓纤溶酶)的热分解，并且，制得的地龙提取物具有质地疏松，加水后迅速溶解，复溶性好，含水量低，稳定性好，受污染机会少，产品质量高等优点，且利于地龙提取物的贮存，并提高复方地龙提取物的有效性、稳定性和安全性；

2、本发明采用乙醇溶液提取，结合减压干燥、喷雾干燥浓缩液等方法制备川芎、牛膝、黄芪提取物，很好地保留了其中的有效成分阿魏酸和黄芪甲苷，利于提高复方地龙提取物的有效性、稳定性和安全性；

3、本发明制得的复方地龙提取物具有有效成分含量高，生物活性优异等优点。经检测，本发明制得所得的复方地龙提取物中阿魏酸的含量不低于0.2mg/g、黄芪甲苷的含量不低于0.4mg/g、蚯蚓纤溶酶(EFE)活性不低于30000u/g，且具有显著改善地抗血栓形成作用；

4、本发明优选复方地龙提取物制剂的组成，改善并提高其起效速度，显著提高其生物利用度。

附图说明

图1本发明制备所得的复方地龙提取物中阿魏酸含量测定色谱图(干燥前)；

图2本发明制备所得的复方地龙提取物中阿魏酸含量测定色谱图(喷雾干燥后)；

图3本发明制备所得的复方地龙提取物中阿魏酸含量测定色谱图(减压干燥后)；

图4本发明制备所得的复方地龙提取物中阿魏酸含量测定色谱图(常压干燥后)；

图5本发明制备所得的复方地龙提取物中黄芪甲苷含量测定色谱图。

具体实施方式

以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。

实施例1膜过滤对地龙提取物活性成分含量的影响

取20kg地龙鲜品，清洗，沥干水，加入等重量的水，37℃±1℃搅拌匀浆，离心，取上清液，在固定操作压力(0.1MPa)、料液温度(20℃)、料液浓度(即含地龙生药1.5g/ml)等工艺参数的情况下，使地龙匀浆液通过截留分子量为10000D的超滤膜，超滤浓缩至每ml含地龙生药10g，并比较超滤前后药液中活性成分的变化。

表1超滤对地龙匀浆提取液中固形物和生物活性的影响

由表1可见，地龙匀浆提取液经过超滤浓缩后，其中的固形物含量显著降低，但活性成分变化不大，说明超滤是过滤浓缩地龙匀浆提取液的有效方法。

实施例2冷冻干燥对地龙提取物活性成分含量的影响

取30kg地龙鲜品，清洗，沥干水，加入等重量的水，37℃±1℃搅拌匀浆，离心，取上清液，在固定操作压力(0.1MPa)、料液温度(20℃)、料液浓度(每ml含地龙生药1.5g)等工艺参数的情况下，使地龙匀浆液通过截留分子量为10000D的超滤膜，超滤浓缩至每ml含地龙生药10g，干燥，即得地龙提取物干燥品，其中，所述干燥方法选自冷冻干燥、常压干燥、减压干燥的任一种，所述冷冻干燥条件为-40℃；常压干燥条件为65℃；减压干燥条件为干燥温度50℃，真空度为0.05mp。

表2干燥方法对地龙匀浆提取液中固形物和生物活性的影响

由表2可见，地龙匀浆提取液经过超滤浓缩、冷冻干燥后，活性成分变化不大，但是，常压干燥和减压干燥后的生物活性明显下降甚至无，说明冷冻干燥是保留地龙匀浆提取液活性的有效方法。

实施例3干燥方法对川芎、牛膝、黄芪提取物中阿魏酸含量的影响

本实施例研究干燥方法对川芎、牛膝、黄芪提取物中阿魏酸含量、黄芪甲苷含量的影响。

1、川芎、牛膝、黄芪提取物的制备

取川芎280g、牛膝160g和黄芪240g，加入浓度为70％的乙醇溶液，乙醇溶液的用量为7倍，回流提取二次，每次2小时，合并醇液，减压浓缩回收乙醇，将醇液浓缩至相对密度约为1.3的浓缩液，干燥，粉碎，即得，其中，所述干燥方法分选自常压干燥、减压干燥、喷雾干燥的任一种：

①常压干燥：将川芎、牛膝、黄芪提取物浓缩液置于不锈钢方盘中，再将不锈钢方盘置于干燥箱中，常压干燥(干燥温度105℃)，收集干浸膏，备用；

②减压干燥：将川芎、牛膝、黄芪提取物浓缩液置于不锈钢方盘中，再将不锈钢方盘置于真空干燥箱中，减压干燥(干燥温度70℃，真空度为0.05mp)，收集干浸膏，备用；

③喷雾干燥：将川芎、牛膝、黄芪提取物浓缩液进行喷雾干燥，收集喷雾干燥，备用。

2、川芎、牛膝、黄芪提取物中的阿魏酸含量、黄芪甲苷含量的检测

按照本发明所述的方法检测川芎、牛膝、黄芪提取物中的阿魏酸含量、黄芪甲苷含量，结果见表3。

表3干燥方法对阿魏酸含量、黄芪甲苷含量的影响

由表3可见，与干燥前相比，常压干燥严重破坏川芎、牛膝、黄芪提取物中阿魏酸的质量，几乎测不出阿魏酸的含量；减压干燥后阿魏酸含量下降约30％；喷雾干燥则很好地保证了川芎、牛膝、黄芪提取物中阿魏酸的质量，其阿魏酸含量保留高达98％。对黄芪甲苷的影响呈现类似的趋势，但程度要小一些。

实施例4复方地龙提取物的制备

1、复方地龙提取物的组成，包括

鲜地龙2000g   川芎280g    黄芪240g   牛膝160g

2、复方地龙提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)取组成量的地龙，清洗，沥干，加等重量水，在37℃±1℃搅拌匀浆24小时，离心，取上清液，采用截留分子量为10000D的超滤膜滤过、浓缩，浓缩液经冷冻干燥，制得地龙粉，其中，所述冷冻干燥条件为-45℃；

2)取组成量的川芎、牛膝和黄芪，加入浓度为75％的乙醇溶液，乙醇溶液的用量为8倍，回流提取二次，每次2小时，合并醇液，回收醇液，浓缩至相对密度约为1.2，喷雾干燥，制得川芎、牛膝、黄芪提取物；

3)将步骤1)制得的地龙粉与步骤2)制得的川芎、牛膝和黄芪提取物均匀混合，即得复方地龙提取物。

按照本发明所述的方法检测，其生物活性为37000u/g，阿魏酸的含量为0.342mg/g，黄芪甲苷的含量为0.65mg/g。

实施例5复方地龙提取物对大鼠体内血栓形成的影响

分别以CN1726955A的实施例1-8制备所得的复方地龙提取物为对比例1-8，比较研究本发明制备所得的复方地龙提取物、对比例1-8制备所得的复方地龙提取物、市售的复方地龙胶囊对大鼠体内血栓形成的影响。

实验方法：参照《中药药理研究方法学》(人民卫生出版社，1993，510页)。

动物试验：SD大鼠，110只，随机分成11组，其中，1组为空白组，给予等量的生理盐水；8组为CN1726955A的实施例1-8制备所得的复方地龙提取物；1组为市售的复方地龙胶囊(恒生公司生产)，按照其标示量折算用药量；1组为本发明制备所得的复方地龙提取物。10组动物分别灌胃给药7天，于末次给药后1小时进行体内血栓形成试验，测定每组10只大鼠堵塞形成时间，结果见表4。

表4复方地龙提取物对大鼠体内血栓形成的影响

说明：与空白对照组相比，*表示P＜0.05，料表示P＜0.01

由表4可见，与空白组相比，对比例1-8、市售复方地龙胶囊、本发明的复方地龙提取物均存在显著差异；与对比例1-8、市售复方地龙胶囊相比，本发明的复方地龙提取物的有效成分保留良好，不仅具有更好的生物活性、更高的阿魏酸含量和黄芪甲苷含量，而且具有较好的抗血栓形成作用。

实施例5复方地龙片的组成筛选

表5复方地龙片的组成筛选结果

由表6可见，随着崩解剂用量的增加，崩解时间逐步缩短，本发明选择优化组成3，采用粉末压片制备复方地龙的片剂。

实施例7复方地龙片的制备

地龙(鲜)2000g   川芎280g    黄芪240g   牛膝160g

羧甲基淀粉钠80g  微晶纤维素40g   欧巴代30g

制成1000片

复方地龙提取物的制备方法同实施例1。

将复方地龙提取物中加入组成所示辅料，混匀，压片，包衣，即得。

实施例8复方地龙胶囊的制备

地龙(鲜)2000g   川芎280g   黄芪240g   牛膝160g

淀粉60g   硬脂酸镁1g

复方地龙提取物的制备方法同实施例1。

将复方地龙提取物中加入淀粉、硬脂酸镁，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。

实施例9复方地龙提取物制剂形式的影响考察

将复方地龙片与胶囊除去外包装，分别置于高湿(相对湿度RH75％)条件下10天，考察其吸湿增重、崩解时间、阿魏酸和黄芪甲苷含量；将复方地龙片与胶囊用PTP-PVC泡罩包装后，分别置于加速试验(温度：40℃，相对湿度RH75％)条件下6个月，考察其吸湿增重、崩解时间、阿魏酸和黄芪甲苷含量。

表6复方地龙提取物制剂形式的影响考察

由表7可见，采用复方地龙提取物粉末与适量的羧甲基淀粉钠、微晶纤维素直接粉末压片，可以降低复方地龙提取物的比表面积，从而降低其引湿性，显著减少有效成分的吸潮变质；同时，采用防潮性包衣材料，进一步降低药物的引湿性。本发明的复方地龙片剂很好地解决了复方地龙提取物的吸湿、有效成分降解、制剂崩解时间延长等问题，从而保证了药物的有效性、安全性和稳定性。

Claims (18)

1.一种复方地龙提取物的制备方法，所述提取物中各成分之间的重量份为：地龙鲜品25份、川芎3.5份、黄芪3份、牛膝2份，其特征在于，复方地龙提取物的制备步骤包括：

1)地龙粉的制备：取组成量的地龙鲜品，清洗，沥干，加等重量水，在37℃搅拌匀浆，离心，取上清液进行膜滤过，浓缩，浓缩液经冷冻干燥，即得；

2)川芎、牛膝、黄芪提取物的制备：取组成量的川芎、牛膝和黄芪，加入50-90％乙醇溶液，乙醇溶液的用量为6-10倍，回流提取二次，每次2小时，过滤，合并醇液，回收醇液，将其浓缩至相对密度为1.1-1.5，干燥，即得；

3)复方地龙提取物的制备：将步骤1)制得的地龙粉与步骤2)制得的川芎、牛膝、黄芪提取物均匀混合，即得。

2.根据权利要求1所述的制备方法，步骤1)所述膜滤过中所用高分子超滤膜的截留分子量为10000D。

3.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，步骤1)的冷冻干燥条件为-40℃。

4.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，步骤2)所用乙醇浓度为60-80％。

5.根据权利要求4所述的制备方法，步骤2)所用乙醇浓度为70％。

6.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，步骤2)所述乙醇溶液的用量为7-9倍。

7.根据权利要求6所述的制备方法，步骤2)所述乙醇溶液的用量为8倍。

8.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，步骤2)中浓缩液的相对密度为1.2-1.4。

9.根据权利要求8所述的制备方法，步骤2)中浓缩液的相对密度为1.3。

10.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，步骤2)中所述干燥选自减压干燥、喷雾干燥的任一种或其组合。

11.根据权利要求10所述的制备方法，步骤2)中所述干燥为喷雾干燥。

12.一种复方地龙提取物，由权利要求1-11任一项所述的制备方法制备得到。

13.一种含有复方地龙提取物的药物组合物，由权利要求1-11任一项所述的制备方法制备得到的复方地龙提取物与药学上可接受的载体组成。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，所述药物组合物的制剂形式选自片剂、混悬液、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、滴丸、糖浆剂、合剂、露剂、泡腾剂、糊剂、乳剂、茶剂、粉剂、针剂、输液、凝胶剂、霜剂、搽剂、洗剂、栓剂、涂抹剂、膏剂的任一种。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，所述膏剂选自凝膏剂、贴膏剂、软膏剂的任一种。

16.一种含有复方地龙提取物的药物组合物的制备方法，由权利要求1-11任一项所述的制备方法制备得到的复方地龙提取物与药学上可接受的载体均匀混合而成。

17.权利要求1-11任一项所述的制备方法制备得到的复方地龙提取物或权利要求13-15任一项所述的含有复方地龙提取物的药物组合物用于制备治疗缺血性脑血管疾病或缺血性中风中经络恢复期气虚血瘀证的药物中的应用。

18.根据权利要求17所述的应用，所述的缺血性中风中经络恢复期气虚血瘀证的症见半身不遂、口舌歪斜、言语蹇涩或不语、偏身麻木、乏力、心悸气短、流涎、自汗的任一种或其组合。