CN100571717C - 一种治疗脉管炎的毛冬青提取物及其制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗脉管炎的中药有效部位及其制剂和制备方法,具体说是从药用植物毛冬青(Ilex pubescens Hook Et Arm)中提取分离的治疗脉管炎的有效部位及其制剂,以及可工业化应用的提取分离方法。本发明特征在于:所公开的中药提取物,其总皂苷含量≥50%;该提取物可与药学上可接受的赋形剂或载体混合,制成各种药剂学上可接受的制剂。本发明的有益效果如下:本发明提取物总皂苷为毛冬青的一个有效部位,其抗血栓、抗血小板聚集及消炎镇痛作用表明在脉管炎尤其是血管闭塞性脉管炎病变的多个环节上都有治疗作用。

Description

一种治疗脉管炎的毛冬青提取物及其制剂
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本发明涉及一种治疗脉管炎的中药有效部位及其制剂和制备方法,具体说是从药用植物 毛冬青(Ilex pubescens Hook etArm)中提取分离的治疗脉管炎的有效部位及其制剂,及其可 工业化应用的提取分离方法。 背景技术
血管闭塞性脉管炎是慢性周围血管性疾病中最常见的一种慢性闭塞性炎症,伴有继发性 神经改变。主要发生于四肢的中、小动、静脉,尤以下肢为多见,极少数发生于脑、心、消 化道等处的血管,临床症状为患肢缺血、疼痛、间歇性跛行、受累动脉搏动减弱或消失,伴 有游走性血栓性浅表静脉炎,严重者有肢端溃疡或坏死。目前关于本病的发病原因还不是十 分清楚,其发病机制和病理学改变又十分复杂,目前治疗药物和治疗手段都比较欠缺。国外 采用交感祌经节切除术,肾上腺合并交感神经节切除术,血管重建手术或高位截肢等手术治 疗,但其治疗价值一直存在着争议。西药治疗常用右旋糖酐、妥拉唑林、烟酸等缓解动脉痉 挛、扩张血管,使血小板解聚或动脉内注射溶栓药物或激素、亚甲蓝、普鲁卡因、前列腺素 E或抗炎镇痛药等近期疗效药物,但以上治疗方法都存在着毒副作用大,疗效不太理想的缺 点。
中医药在古籍中就有关于"脱疽"的治疗记载,临床也常有用中医药或中西医结合治疗 本病的报道,但大多数以中药煎剂为主。
中药毛冬青是冬青科,冬青属多年生植物,广泛生长于我国南方各省,我国民间用其治 疗血栓闭塞性脉管炎,并取得较好疗效,在上世纪八十年代就引起人们广泛关注,我国中山 大学、中科院药物研究所及日本学者对其化学成分进行了较深入的研究,先后分离鉴定了数 种三蔽类皂苷化合物,它们分别为毛冬青皂苷甲(IlexsaponinA)(毛冬青化学成分的研究II 毛冬青皂苷甲的化学结构[J].化学学报,1987, 45: 249-255.), Hexgenin A( A txite卬ene and saponin from roots of /7狄/w力6W朋51 [J].戶力/2^?力柳iMi"/ 1987, 26: 2023-2027.),毛 冬青苷甲(毛冬青甙甲的结构研究(I ) [J].高等学校化学学报,1984, 5(4): 503-507.), 毛冬青阜苷Bi、 B2、 B3 (Ilexsaponin Bi、 B2、 B3) (New triterpene saponins from J7e义 p"6&sc朋s[J] . 户力ar瓜5W丄1987, 35: 524-529.),毛冬青皂苷B (Ilexsaponin B)、 具栖冬青苷(Pedunculoside), Ilexolide A(毛冬青化学成分的研究III.四种三萜皂甙的分离 和鉴定[J〕.中草药,1991, 22 (7): 291-294.)等,上述化合物化学结构式均已公开。还有 半合成化合物毛冬青甲素(Ilexonin A),化学结构式未公开发表[药学通报19 (2), 1984〗, 大量的基础药理及临床实验表明:它有对抗血栓形成作用,能降低心肌耗氧量,并有一定的 抗炎作用。但自1984年报道以来,至今仍未上市。中国药典(1977年版)记载毛冬青有凉 血活血、通脉、消炎、解毒功能,主治血栓闭塞性脉管炎,冠状动脉硬化性心脏病。毛冬青已 有斜帼剂,如片剂、小针剂、麟剂、糖浆剂等用于临床上治疔冠状病、心肌梗塞、缺血性心脏病、周围血管病、中心性视网膜炎等。经査新结果表明,国内还未见有利用毛 冬青提取物总皂苷含量> 50%制成治疗心血管疾病、血栓闭塞性脉管炎制剂的报 道。目前只有毛冬青粗提取物或与其它中药混合制成制剂用于治疗心血管疾病的 药物。显然已有的这些制剂都比较粗,质量难以控制,与目前中药现代化的要求 相差甚远,对疾病的治疗针对性也不够强。
发明内容
本发明目的是:为脉管炎、尤其是血栓闭塞性脉管炎病人研究出更具备针对 性的治疗药物,以便更加准确地对症治疗,从而提高对脉管炎的治疗效果。本发 明的另一 目的是公开一种治疗脉管炎、尤其是血栓闭塞性脉管炎的高活性成分含 量的毛冬青有效部位及其制剂。
本发明通过药理试验结果,证实总皂苷为毛冬青的一个有效部位,其抗血小 板聚集及抗栓作用表明在脉管炎病变的多个环节上都有治疗作用。
本发明同时采用高效液相色谱法对毛冬青总皂苷提取物中毛冬青皂苷Bi和
IlexgeninA两化合物进行了含量测定,使其质量可控,为本发明向现实生产转化 创造了必要条件。
本发明的毛冬青总皂苷提取物按如下方法制备的,-
取毛冬青药材粉碎,加6-10倍量水或亲水性溶剂回流热提1-3次,每次1~4 小时,合并提取液,回收溶剂至约原药材2〜4倍量,静置0〜36小时,过滤,收 集沉淀,备用;母液继续浓縮,调整相对密度至1~1.3,过滤,收集沉淀,备用。 合并沉淀,加入40-95%亲水性溶剂,使其溶解,干燥,制得浸膏状的毛冬青总 皂苷提取物。
上述制备方法的条件,其特征在于:
(1) 浓縮方法可以是常压下浓縮,也可以是减压浓縮,减压浓縮条件 为:0. Ol-O. 09MPa'40 -90。C:
(2) 回收乙醇方法可以是常压回收,也可以是减压回收,减压回收乙醇条件 为:0. 01-0. 09MPa, 30 -80。C:
(3)干燥方法可以是:接触干燥、气流干燥、隧道式烘箱干燥、真空(减压) 干燥、沸腾干燥、喷雾干燥、冷冻干燥、远红外干燥、微波干燥。
本发明的毛冬青提取物由毛冬青(Ilex pubescens Hook et Arm)中提取分离的
4有效部位组成,其总皂苷含量》50%,可用于脉管炎、尤其是血栓闭塞性脉管炎。 优选,本发明的毛冬青总皂苷中毛冬青皂苷Bi的含量》7Q/。,Ilexgenin A的含 量》9%。
本发明的提取物可与任意药学上可接受的赋形剂或载体混合,制成各种药剂 学上可接受的制剂。其中优选胶囊剂。
本发明药的有益特点是:
(1)、总皂苷的提取工艺一般有水提-有机溶剂萃取法,水提-大孔吸附树脂 法,醇提-水转溶-有机溶剂萃取法,但作为工业化大生产,存在成本过高和树脂 残留物及环保等问题,我们在大量的实验基础上选择了该方法,同时对所得提取 物浸膏中总皂苷进行含量测定,方法和结果如下:
对照品溶液的制备精密称取毛冬青皂苷B,适量,用甲醇溶解制成每lml 含0.11mg的溶液,即得。
供试品溶液的制备取本品适量,精密称定,用甲醇溶解制成每lml中含有 0.16mg的溶液,即得。
测定法取上述对照品溶液和供试品溶液各lml,分别入具塞试管中,挥去 溶剂,取出,放冷,分别加入新鲜配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸 0.8ml,摇匀,置70。C水浴中加热15分钟,立即取出,入冰水浴冷却后,加入冰 醋酸5ml,摇匀,放置1小时后,以试剂同法操作作为空白。照分光光度法(中 国药典2000年版一部附录VB),在539nm土lnm的波长分别测定吸收度,计算, 即得。
经方法学考察,标准曲线在0.02~0.2mg的范围内呈一近似过零点的直线, 回归方程为A=4.3788C—0.0399,相关系数r=0. 9998 (n=6)。精密度较好,RSD 为O. 14%,回收率为99.68%, RSD为2. 38%,样品测定结果见表1:
表l毛冬青总皂苷的测定结果
批号 总皂苷量《) 平均值 RSD (%)
20010619 77.11 77. 70 77.41 0. 54
20010516 78.31 78. 46 78.39 0.14
20010529 80.19 79. 90 80. 05 0. 26
为使本发明质量可控,从而使本发明顺利过渡到大生产,发明人对毛冬青总
皂苷提取物中毛冬青皂苷和Ilexgenin A两化合物进行了含量测定研究。
(2)、用本发明的毛冬青的总皂苷提取物浸膏进行药理试验,具体结果如下: 0)、抗栓实验*电刺激大鼠颈总动脉致血栓法
取清洁级雄性SD大鼠,雄性,60只,体重250-300g,随机分成5组,每 组10只。连续灌胃给药(lml/100g)9天,第10天取大鼠在25土2。C环境中,灌胃 给药30min后,50mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,固定,分离右侧颈总动脉, 电刺激左侧颈总动脉(1.2mA、 7min),于BT87-3型实验性体内血栓形成测定仪 上,测定血栓形成时间(OT)值,实验数据统计并做组间t检验。
结果:毛冬青制剂具有延长动脉血栓形成时间的作用,其中37.5mg/kg剂量 组与空白组比较,差异有显著意义(PO.05) 75及150mg/kg剂量组与空白组比 较,差异有非常显著意义(PO.Ol)。结果见表2。
表2毛冬青制剂对大鼠颈总动脉血栓形成时间的影响(X:FSD)
组别 药物 剂量(mg/kg) 血栓形成吋间(S)
空白组 生理盐水 / 610.9± 110.2
低剂量组 毛冬青制剂 37.5 733.1 ±121.9*
中剂量组 毛冬青制剂 75 921.9 ±194.2"
高剂量组 毛冬青制剂 150 1013.6± 124.0"
阳性组 通塞脉胶囊 630 873.8 ±165.7*'
与空白组比+P0.05 **P<0.01
*结扎大鼠下腔静脉致血栓法
取雄性清洁级SD大鼠50只,体重为250-300g,随机分为5组,每组10只。 连续灌胃给药(lml/100g)14天,第15天取大鼠在25土2。C环境中,灌胃给药30min 后,50mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,固定,打开腹腔,分离下腔静脉。于左 肾静脉下方结扎下腔静脉。尔后缝合手术伤口。结扎3小时后,重新打开腹腔, 在结扎线下方2cm处,用止血钳夹闭血管,并将此段血管各分枝血管结扎。用 注射器抽干血液,剖开血管,用镊子小心夹出血栓,并在滤纸上吸尽残血,2min 后在电子天秤上称血栓湿重。统计各组数据,并做组间t检验。
结果:毛冬青制剂具有对抗静脉血栓形成的作用,其中37.5、 75mg/kg剂量 组与空白组比较,差异有非常显著意义(PO.Ol), 150mg/kg剂量组与空白组比, 差异有显著意义(PO.05),结果见表3。表3毛冬青制剂对大鼠下腔静脉血栓形成的影响(X±SD)
组另u 药物 剂量(mg/kg) 血栓湿重(mg)
空白组 生理盐水 / 5.6±1.5
低剂量组 毛冬青制剂 37.5 2.1 ±1.0"
中剂量组 毛冬青制剂 75 3.6±1.5"
高剂量组 毛冬青制剂 150 4.0 ±1.2'
阳性组 通塞脉胶囊 630 2.7 ±].2"
与空白组比较:*P<0.05 **P<0.01 ②、血浆优球蛋白濱解时间(ELT),血浆凝血酶原时间(PT),部分凝血酶时间 (AKPTT)的测定
取清洁级雄性SD大鼠50只,200-250g,随机分成5组,每组10只,连续 灌胃给药(lml/100g)14天,第15天取已禁食12hr的大鼠于25士2'C环境中,灌 胄给药30min后,50mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,固定,腹主动脉取血4,5ml, 用0.5ml, 3.28%构椽酸钠抗凝。于4。C冰箱内,3000r离心10min,取血浆0.5ml 置于TYXN-91A智能血液凝集仪上,37。C预热5min后,测定PT, AKPTT值。 另取血浆lmi,分成两份,每份0.5ml,分别加入内置4。C, 9ml0.011。/。乙酸液的 锥形离心管中,混匀。静置30miii后,3000r离心5min,倾出上清液,并将离心 管倒置于滤纸上,吸干余液,尔后将离心管置于37X:水浴中加入0.5nil四硼酸钠 液(pH=9),溶解沉淀。再加入0.025MCaCl2液0.5ml,混匀。约2-3min后,管 内液体开始凝固,记录从形成凝块至完全溶解的时间(min),即ELT值。统计 各组数据,并做组间t检验。
结果:毛冬青制剂具有加速纤维蛋白溶解的作用,对内源性及外源性凝血系 统则无作用(P>0.05),结果见表4。 — 表4毛冬青制剂对ELT、 PT、 AKPTT的影响(X土SD)
组别 药物 剂量(mg/kg) PT值(S) AKPTT值(S) ELT值(min)
空白组 生理盐水 / 10.3±1.2 24.6 士 1.3 169.1 ±37.7
低剂量组 毛冬青制剂 37.5 10.4±1.3 24.2 ±2.8 101.3±22.6'*
中剂量组 毛冬青制剂 75 10.3±1.3 24.4±2.5 103.0士14.8"
高剂量组 毛冬青制剂 150 10.2±1.0 24.5 ±2.4 132.3±34.6*
阳性组 通塞脉胶囊 630 lO.l士l.l 24.2 ±2.9 126.1 ±34.3*
与空白组比较: *P<0.05 **P<0.01
③、对血小板聚集性的影响
取清洁级雄性SD大鼠60只,200-250g,随机分成5组,每组10只,连续
7灌胃给药(lml/100g)6天,第7天取己禁食12hr的大鼠于25土2。C环境中,灌胃 给药30min后,50mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,固定,腹主动脉取血4.5ml, 用0.5ml 3.28%枸椽酸钠1:9抗凝,制取PRP及PPP。
将各管血浆,于TYXN-91A型智能血液凝集仪上,测5min内血小板最大聚 集率,所用诱导剂为ADP (5uM),胶原(5ul),花生四烯酸(10ul),统计各组结 果,并做组间t检验。
结果:毛冬青制剂能对抗ADP诱导的大鼠血小板聚集(PO.05及0.01), 起效剂量为37.5mg/kg。不能对抗胶原诱导的大鼠血小板聚集(P>0.05),不能对 抗花生四烯酸诱导的大鼠血小板聚集(P>0.05)。结果见表5-l、 2、 3。
表5-l毛冬青制剂对胶原诱导的大鼠血小板聚集率的影响(X士SD)
<table>table see original document page 8</column></row> <table>
与空白组比较:p>0.05
表5-2毛冬青制剂对ADP诱导的大鼠血小板聚集率的影响(X士SD)
<table>table see original document page 8</column></row> <table>
与空白组比较:*P<0.05 **P<0.01表5-3毛冬青制剂对花生四烯酸诱导的大鼠血小板聚集率的影响(X±SD)
组别 动物数 (只) 药物 剂量 (mg/kg) 血小板聚集率 (%) 抑制率 (%)
空白组 10 - / 61.5±32.0 -
高剂量组 •10 毛冬青制剂 150 45.2±36.8 26.5
中剂量组 9 毛冬青制剂 75 44.0±37.8 28.5
低剂量组 11 毛冬青制剂 37.5 61.8±38.8 -0.5
阳性组 9 通塞脉胶囊 630 57.6±35.5 6.3
与空白组比较:p>0.05
沙、对动脉壁前列环素(PGI2)活性的影响
取清洁级雄性SD大鼠50只,250-300g。随机分成5组,每组10只。麻醉, 固定,舌静脉注射给药(0.2ml/100g) 30min后,迅速开胸剪下胸主动脉置于冰 冷-中剥离周围结缔组织,切成约2mm小段,称重,加入磷酸缓冲液(lml/4mg), 于37'C水浴中温育30min后,取出组织,放入冰浴中终止反应。尔后取10ul温 育液,采用放免法测定PGl2代谢产物6-Keto-PGF,a含量以此作指标,统计,并 做组间t检验。
结果:毛冬青制剂具有增强PGl2活性的作用(P<0.05),起效剂量为
37.5mg/kg,结果见表6。
表6毛冬青制剂对大鼠胸主动脉壁PGl2活性的影响(X土SD)
组另U 药物 剂量(mg/kg) 6-Keto-PGF,q含量(pg/ml)
空白组 - / 9183.5±2385.8
低剂量组 毛冬青制剂 37.5 11689.5 ±1675.1'
中剂量组 毛冬青制剂 75 12910.6土2356.9"
高剂量组 毛冬青制剂 150 16888.4±7455.8*
阳性组 通塞脉胶囊 630 12651.7土2583.r
与空白组比:*P<0.05 **P<0.01
③、小鼠耳肿胀试验
取雄性清洁级昆明种鼠60只,体重为18-20g,按体重随机分为6组,每组10只。连续灌胃给药(0.2ml/10g)2天,第3天取小鼠在25土2'C环境中,灌胃给 药30min后,在小鼠左耳涂抹二甲苯25ul,待30min后处死小鼠,剪下双耳, 用直径为8mm的子弹壳沿耳缘切迹打孔,分别称重,以每只小鼠的左耳重量减 去右耳重量的差值作为肿胀度,统计,并做组间t检验。
结果:与模型组比较,阿司匹林组及毛冬青制剂75, 150mg/kg剂量组有减 轻小鼠耳肿胀度的作用,差异有显著性意义(pO.05及0.01)。结果见表7。 表7毛冬青制剂对小鼠耳肿胀的影响(X土SD)
组另ij 药物 剂量(mg/kg) 小鼠耳肿胀度(g)
模型组 蒸馏水 / 16.0±3.6
低剂量组 毛冬青制剂 75 14.6±5.7
中剂量组 毛冬青制剂 150 12.7±3.0*
高剂量组 毛冬青制剂 300 11.5 ±3.2**
阳性组 通塞脉胶囊 630 13.1±3.7
阿司匹林组 阿司匹林片 300 8.5 ±5.6"
与模型组比:*P<0.05 **P<0.01.
通过动物实验观察,本品经灌胃给药后,可见其有抗栓作用,这与其抗血小
板聚集、促进纤溶及促进PGI2的释放有关,同时本品还具有减轻急性炎症的发 生。由此可见,本品在脉管炎病变的多个环节上都有治疗作用,综上所述,本品 不失为治疗脉管炎的良药。 实施例1
取毛冬青药材粉碎,加6倍量60%乙醇回流热提1次,时间2小时,合并提 取液,回收溶剂至约原药材2倍量,静置24小时,过滤,收集沉淀,备用;母 液继续浓縮,调整相对密度至1.05 (25-28°C),过滤,收集沉淀,备用。合并沉 淀,加入60%乙醇,使其溶解,干燥,制得总皂苷含量为75%的浸膏,其中毛 冬青皂苷Bl和IlexgeninA的含量分别为7.35%、 9.47%。 实施例2
取毛冬青药材粉碎,加8倍量80%乙醇回流热提2次,每次2小时,合并提 取液,回收溶剂至约原药材2倍量,静置24小时,过滤,收集沉淀,备用;母 液继续浓缩,调整相对密度至1.05 (25-28°C),过滤,收集沉淀,备用。合并沉淀,加入80%乙醇,使其溶解,干燥,制得总皂苷含量为79%的浸膏,其中毛 冬青皂苷Bl和IiexgeninA的含量分别为9.45%、 12.72%。
实施例3
取毛冬青药材粉碎,加10倍量80%乙醇回流热提3次,每次2小时,合并 提取液,回收溶剂至约原药材2倍量,静置24小时,过滤,收集沉淀,备用; 母液继续浓縮,调整相对密度至1.05 (25-28°C),过滤,收集沉淀,备用。合并 沉淀,加入80%乙醇,使其溶解,干燥,制得总皂苷76%的浸膏,其中毛冬青 皂苷Bl和IiexgeninA的含量含量分别为8.89%、 12.55%。 实施例4
取毛冬青提取物浸膏l份,聚乙二醇1.5份,加10倍量80%乙醇,加热回 流2〜4小时,回收溶剂干燥,粉碎,制成胶囊。 实施例5:
取毛冬青提取物浸膏l份,聚乙二醇2份,加15倍量95%乙醇,加热回流 1~3小时,减压回收溶剂,干燥,粉碎,制成胶囊。 实施例6:
取毛冬青提取物浸膏1份,聚乙二醇3份,加20倍无水乙醇,加热回流1~5 小时,回收溶剂,干燥,粉碎,制成胶囊。

Claims (6)

1、一种治疗脉管炎的毛冬青提取物,其特征在于该提取物含总皂苷≥50%。 它是由以下方法制备而成的:取毛冬青药材粉碎,加6-10倍量60-80%乙醇回流热提1-3次,每次1~4小时,合并提取液,回收溶剂至约原药材2~4倍量,静置24小时,过滤,收集沉淀,备用;母液继续浓缩,调整相对密度至1~1.3,过滤,收集沉淀,备用,合并沉淀,加入60-80%乙醇,使其溶解,干燥,制得浸膏状的毛冬青提取物。
2、 根据权利要求l所述的毛冬青提取物,其中总皂苷中毛冬青皂苷Bi的含量》7c/。。
3、 根据权利要求l所述的毛冬青提取物,其中总皂苷中IlexgeninA的含量》9y。。
4、 一种治疗脉管炎的毛冬青制剂,其特征在于由权利要求l-3所述的任一毛冬青提取物 与药学上可接受的载体或赋形剂混合而成。
5、 根据权利要求4所述的毛冬青制剂,其特征在于该制剂为胶囊。
6、 权利要求5所述制剂的制备方法,其特征在于包括以下步骤:取毛冬青提取物和聚乙 二醇3份,加入乙醇,加热回流1〜5小时,回收溶剂,干燥,粉碎,制成胶囊。
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