CN102198124B - 一种治疗类风湿性关节炎的紫草提取物及其软胶囊 - Google Patents
一种治疗类风湿性关节炎的紫草提取物及其软胶囊 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种紫草提取物及其制备方法，该紫草提取物含有乙酰阿卡宁为0.10～25％，异戊酰阿卡宁为0～20％，α-甲基丁酰阿卡宁为0～20％，β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁为0～30％(按高效液相色谱峰面积归一化法计)。本发明还公开了以紫草提取物为原料的软胶囊及软胶囊的制备方法。本发明还公开了所述的紫草提取物在制备治疗类风湿性关节炎药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及中药制药技术领域，具体涉及一种治疗类风湿性关节炎的紫草提取物及其软胶囊，还涉及紫草提取物及其软胶囊的制备方法。
背景技术
类风湿性关节炎属自身免疫性疾病，是因机体免疫系统对自身成分发生免疫反应而导致的疾病状态。其基本特征为：可检测到高效价的自身抗体和/或自身应答性T细胞；自身抗体或应答T细胞作用于自身组织细胞，造成损伤或功能障碍；为一累及周围关节为主的多系统性炎症性自身免疫疾病。在欧美的患病率为1％，我国约为0.32-0.36％。该病发病可见于任何年龄和地区，以35-50岁青壮年居多，女性发病率高，为男性的2-3倍。
类风湿性关节炎目前的治疗药物有(1)非甾体抗炎药(NSAIDs)，这类药物为改善关节炎症状的常用药，不能控制病情。且由于该类药物的作用靶点多为COx酶，结果使体内前列腺素合成受到抑制，长期服用，会致使胃炎、胃溃疡和胃出血等严重的消化道副作用。(2)改善病情的抗风湿药(DMARDs)，这类药物多为免疫抑制剂，这类药物可改善患者的关节症状，阻止关节结构的破坏，但不能消除滑膜炎症反应，且有肝损伤、骨髓抑制等毒副作用。(3)糖皮质激素，这类药物有强大的抗炎作用，迅速消除关节肿胀，减轻疼痛。但不能根治，停药后会复发，长期使用将出现骨质疏松、软骨破坏等副作用。(4)生物制剂，主要为肿瘤坏死因子(TNF-α)拮抗剂，包括依那昔普(Etanercept)和英夫利昔单抗(Infliximab)。TNF-α拮抗剂可明显改善类风湿性关节炎患者的临床指标及生活质量，安全性好。但这类药物的缺点是价格昂贵，普通患者根本用不起。
紫草为常用中药，为紫草科多年生草本植物，因其根呈紫色得名，最早记载于《神农本草经》，具有清热凉血，活血，解毒透疹之功效。
经研究，紫草的主要成分有两大类：一类是水溶性成分，目前研究比较少，初步认为主要是多糖和糖蛋白的混合物；另一类是脂溶性成分，包括紫草萘醌类、酚酸类、生物碱类、苯酚、黄酮类等。其中最值得注意的是紫草萘醌类化合物。研究表明，紫草萘醌类化合物是紫草的主要有效成分，其含量占3-6.5％，具有多种生理和药理活性，如愈伤抗炎、抗菌抗病毒、解热、止血、抗肿瘤、保肝、降血糖、镇静和调节免疫等作用。
紫草萘醌类化合物主要包括阿卡宁衍生物和紫草素衍生物，两者属于同分异构体，它们的结构如下：
阿卡宁衍生物
紫草素衍生物
阿卡宁衍生物是紫草科植物新疆紫草(软紫草Arnebia euchroma(Royle)Johnst)中的主要脂溶性有效成分，近年的研究发现，阿卡宁衍生物具有多种生物活性，包括具有促进伤口愈合、抗炎、抗微生物、抗肿瘤等作用[Vassilios P.Papageorgiou et al，Angew.Chem.Int.Ed.1999，38，270-300；V.P.Papageorgiou et al，Current Organic Chemistry，2006，10，2123-2142]。
公开号为CN101434530A中国专利申请公开了一种从紫草根中提取紫草素的方法，其特征是将紫草根与含醇水溶液按一定料液比混合放入匀浆机中匀浆提取，将匀浆后所得的混合物固液分离，得提取液，将固形物再与含醇水溶液按一定料液比混合放入匀浆机中匀浆提取，将提取液合并后减压浓缩，得到紫草素粗产品。
另外，中国专利ZL200310124125.7等也公开了多种紫草提取物的制备方法，如上同样的原因，由于对设备要求高、工艺繁琐、产量低、成本高等原因，无法在产业上应用。且提取物多为粗提物，基础物质不明确，缺乏对其质量进行有效控制的方法。
从紫草中研制开发出疗效确切，毒副作用小，质量可控，使用方便的紫草中药剂型，具有可行性和必要性。
发明内容
本发明提供一种治疗类风湿性关节炎的紫草提取物，其中乙酰阿卡宁为0.10～25％，异戊酰阿卡宁为0～20％，α-甲基丁酰阿卡宁为0～20％，β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁为0～30％(按高效液相色谱峰面积归一化法计)。
高效液相色谱条件为流动相：乙腈-水-甲酸(700∶300∶0.5)，流速：1ml/min，检测波长：518nm，柱温：30℃。
本发明提供的紫草提取物优选为，其中乙酰阿卡宁为10～20％，异戊酰阿卡宁为10～15％，α-甲基丁酰阿卡宁为10～15％，β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁为15～25％(按高效液 相色谱峰面积归一化法计)。
本发明的提取物通过以下提取方法获得：取新疆紫草药材饮片，50-60℃条件下10-20倍量(体积∶质量，ml∶g)石油醚(60-90℃)浸提2-4次，每次浸提1-3小时，提取液浓缩回收溶剂，得浸膏，再以浸膏10-20倍重量的硅胶进行柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯体系洗脱，薄层色谱检查，合并萘醌类成分，即得紫草提取物。
制备紫草提取物方法最佳为：取新疆紫草药材饮片，55℃条件下15倍量(体积∶质量，ml∶g)石油醚(60-90℃)浸提3次，每次浸提3小时，提取液浓缩回收溶剂，得浸膏，再以15倍量硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯体系洗脱，薄层色谱检查，合并萘醌类成分，即得紫草提取物。
将有效剂量的本发明提取物和药学上可接受的口服药物载体可做成软胶囊剂。
本发明软胶囊具体的组方为：紫草提取物25-50g、大豆油475g、明胶100g、甘油40g、对羟基苯甲酸甲酯0.16g、对羟基苯甲酸丙酯0.04g、蒸馏水适量。
制备方法为：
1)、制胶：取明胶加入适量蒸馏水使其吸水膨胀，另将甘油、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和剩余蒸馏水置煮胶锅中加热至70-80℃，混合均匀，加入膨胀的明胶搅拌，熔融，保温1-2小时，静置，刮去上浮的泡沫，用纱布过滤，保温待用；
2)、配液：取紫草提取物溶于大豆油中，制备药液；
3)、压丸：将已制备好的囊壳液和药液在软胶囊成型机中制成软胶囊；
4)、定型：将软胶囊放入转笼中冷却定型；
5)、干燥：将软胶囊放入软胶囊定型机中干燥；
6)、洗丸：将干燥好的软胶囊放入三足离心机中清洗；
7)、拣丸：通过目测对半成品进行筛选，剔除产品中的异形产品；
8)、包装：采用高密度聚乙烯瓶包装，增加包装的密闭性及不透光性。
相关试验显示，本发明提供的紫草提取物体外对内毒素激活小鼠腹腔巨噬细胞、分泌炎症细胞因子TNF-α和IL-1具有显著的抑制作用。在体内在类风湿性关节炎模型----佐剂性关节炎模型和胶原性关节炎中明显抑制大鼠关节肿胀度，降低多发性关节炎指数评分。病理可见，紫草总萘醌可明显减少大鼠滑膜中炎性细胞浸润，抑制滑膜细胞的增殖，表现对滑膜和关节软骨组织的保护作用。免疫方面，紫草总萘醌可降低大鼠增高的胸腺指数和脾脏指数，增强对胸腺、脾脏免疫器官的保护作用。
本品与临床常用药物泼尼松(10mg/kg)、雷公藤多甙(30mg/kg)、注射用重组人II型 肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(商品名：益赛普)(0.8mg/kg)药效对比结果显示，在AA模型中紫草10、20mg/kg剂量组具有明显抑制大鼠原发和继发足肿胀，降低关节炎指数评分。其中10mg/kg剂量组药效强度与雷公藤多甙相当，20mg/kg剂量组药效强度明显优于阳性对照药-雷公藤多甙；20mg/kg剂量组药效强度与泼尼松相当。在CIA模型中，紫草总萘醌各剂量组都有明显抑制大鼠原发和继发足肿胀，降低关节炎指数评分作用，药效强度都强于益赛普组。其中5mg/kg剂量组药效强度与雷公藤多甙相当，10mg/kg剂量组药效强度明显优于阳性对照药-雷公藤多甙。
雷公藤多甙和泼尼松具有免疫抑制作用，我们的药效学实验结果可见明显降低大鼠脾指数，病理切片下可见大鼠胸腺皮质髓质明显变薄。脾淋巴细胞稀疏，脾小节明显减少。而紫草总萘醌各剂量组大鼠平均体重及脏器指数均高于雷公藤多甙和泼尼松组，而且其进食量、外观毛色及活动状态均优于雷公藤多甙和泼尼松组大鼠。病理切片胸腺和脾脏结果可见紫草总萘醌各剂量组无明显影响。
药效学实验结果说明了紫草总萘醌对大鼠实验性关节炎的免疫性炎症有治疗作用，且还具有良好的调节免疫和抗炎作用。
另外，本发明提供的软胶囊基础物质明确、有效成分质量稳定可控、服用方便、吸收好。
附图说明
图1紫草提取物对AA大鼠致炎侧足肿胀度的影响
图2紫草提取物对AA大鼠继发侧足肿胀度的影响
图3紫草提取物对AA大鼠体重变化的影响
图4紫草提取物对AA大鼠关节炎指数评分的影响
图5紫草提取物对AA大鼠胸腺、脾指数的影响
图6紫草提取物对CIA大鼠致炎侧足肿胀度的影响
图7紫草提取物对CIA大鼠继发侧足肿胀度的影响
图8紫草提取物对CIA大鼠体重变化的影响
图9紫草提取物对CIA大鼠关节炎指数评分的影响
具体实施方式
以下实施例更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
紫草提取物的制备
实施例1
取新疆紫草(软紫草Arnebia euchroma(Royle)Johnst)药材饮片100Kg(购自烟台医药商城，批号：20080911)，55℃条件下1500L石油醚浸提3次，每次3小时，提取液浓缩回收溶剂，得到约4.72Kg浸膏，以70kg硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯体系洗脱，薄层检查得紫草提取物约3Kg。
经HPLC分析，高效液相色谱条件为流动相：乙腈-水-甲酸(700∶300∶0.5)，流速：1ml/min，检测波长：518nm，柱温：30℃。
乙酰阿卡宁的含量为15.1％；异戊酰阿卡宁的含量为12.7％；α-甲基丁酰阿卡宁的含量为10.2％；β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁的含量为24.2％。
实施例2
取新疆紫草(软紫草Arnebia euchroma(Royle)Johnst)饮片50Kg(购自新疆石河子，批号：20090213)，50℃条件下500L石油醚浸提2次，每次2小时，提取液浓缩回收溶剂，得到约2.01Kg浸膏，40kg硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯体系洗脱，得紫草提取物约1.2Kg。
经HPLC分析，高效液相色谱条件为流动相：乙腈-水-甲酸(700∶300∶0.5)，流速：1ml/min，检测波长：518nm，柱温：30℃。
乙酰阿卡宁的含量为24.1％；异戊酰阿卡宁的含量为18.2％；α-甲基丁酰阿卡宁的含量为19.4％；ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁的含量为28.5％。
实施例3
取新疆紫草(软紫草Arnebia euchroma(Royle)Johnst)药材50Kg(购自新疆石河子，批号：20090213)，50℃条件下2000L石油醚浸提1次，3小时，提取液浓缩同收溶剂，得到约1.92Kg浸膏，20kg硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯体系洗脱，乙醇除去所含蜡质，得紫草提取物约1.08Kg。
经HPLC分析，高效液相色谱条件为流动相：乙腈-水-甲酸(700∶300∶0.5)，流速：1ml/min，检测波长：518nm，柱温：30℃。
乙酰阿卡宁的含量为10.4％；异戊酰阿卡宁的含量为10.6％；α-甲基丁酰阿卡宁的含量为10.9％；ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁的含量为15.2％。
软胶囊的制备
实施例4
取明胶100g加入适量蒸馏水使其吸水膨胀，另将甘油40g、对羟基苯甲酸甲酯0.16g、对羟基苯甲酸丙酯0.04g和剩余蒸馏水置煮胶锅中加热至70-80℃，混合均匀，加入膨胀的明胶搅拌，熔融，保温1-2小时，静置，刮去上浮的泡沫，用纱布过滤，保温待用；取25g 紫草提取物溶于475g大豆油中，制备药液；将已制备好的囊壳液和药液在软胶囊成型机中制成软胶囊，再进行定型、干燥、洗丸、拣丸、包装，制成软胶囊粒。
实施例5
取明胶100g加入适量蒸馏水使其吸水膨胀，另将甘油40g、对羟基苯甲酸甲酯0.16g、对羟基苯甲酸丙酯0.04g和剩余蒸馏水置煮胶锅中加热至70-80℃，混合均匀，加入膨胀的明胶搅拌，熔融，保温1-2小时，静置，刮去上浮的泡沫，用纱布过滤，保温待用；取50g紫草提取物溶于450g大豆油中，制备药液；将已制备好的囊壳液和药液在软胶囊成型机中制成软胶囊，再进行定型、干燥、洗丸、拣丸、包装，制成软胶囊粒。
紫草提取物中紫草提取物的分离与鉴定
试验例1
1.1材料
受试样品：紫草提取物，按实施例1制备。
1.2分离
总紫草提取物经过硅胶柱层析，分别用石油醚∶乙酸乙酯＝100∶1；100∶1；100∶2；100∶4比例洗脱，所得洗脱液蒸干溶剂后再分别用石油醚或石油醚、乙酸乙酯和甲醇以一定的比例重结晶，分别得到化合物1红褐色颗粒状结晶-乙酰阿卡宁、化合物2鲜红色鳞片状结晶-去氧阿卡宁、化合物3红褐色片状状结晶-ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁。而色谱图一上的峰4经过检验是一对同分异构体，因此我们又通过制备液相进行分离，分离条件是：流动相：THF∶H2O＝45∶55；流速：1ml/min；检测波长：515nm。分离得到的化合物4红色粘稠物α-甲基丁酰阿卡宁和化合物5红色粘稠物异戊酰阿卡宁。
1.3鉴定
1)乙酰阿卡宁的鉴定：
1H-NMR谱(CDCl3，400MHz，δ)低场信号δ12.58(1H，s)、δ12.43(1H，s)是活泼氢信号，表示可能有酚羟基结构。芳香区的质子信号δ7.19(2H，s，)、说明苯环取代后是一个对称的结构6.99(1H，s，)另一个不饱和氢信号、6.02(H，dd，J＝4.8Hz，6.68Hz)、5.12(1H，t，J＝7.28Hz)，说明为烯键氢或者氢与氧相连、2.62，2.47(2H，m)推测有-CH2-结构、2.14(3H，s)、1.69(3H，s)、1.60(3H，s)推测该化合物有三个-CH3信号。
13C-NMR谱(CDCl3，400MHz，δ)δ178.2(C-4)，176.7(C-1)，169.7(C-1′)，167.5(C-8)，167(C-5)，148.2(C-3)，136.1(C-14)，132.9(C-6)，132.7(C-7)，131.5(C-2)，117.7(C-13)，111.8(C-9)，111.6(C-10)，69.5(C-11)，32.8(C-12)，25.7(C-18)，20.9(C-15)，17.9(C-16) 以上波谱数据与文献[Chien-Chang Shen，Wan-Jr Syu；Antimicrobial Activities ofNaphthazarins from Arnebia euchroma；J.Nat.Prod 2002，65，1857-1862]报道的乙酰阿卡宁数据对比，基本一致，故鉴定化合物为乙酰阿卡宁，其结构如下：
2)ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁的鉴定：
1H-NMR谱(CDCl2，400MHz，δ)低场信号δ12.60(1H，s)、δ12.44(1H，s)是活泼氢信号表示可能有酚羟基结构。芳香区的质子信号δ7.18(2H，s，)、说明苯环取代后是一个对称的结构，6.98(1H，s，)另一个不饱和氢信号、6.01(H，dd，J＝4.60Hz，6.68Hz)说明此碳旁有两个不同的氢信号，5.78(H，s)可能是烯键氢信号，5.15(1H，t，J＝7.24Hz)推测有-CH-CH2-结构，2.63，2.48(2H，m，)，2.16(3H，s)、1.94(3H，s，)、1.69(3H，s)、1.58(3H，s)，推测该化合物有4个-CH3信号。
13C-NMR谱(CDCl3，400MHz，δ)δ179.0(C-4)，177.5(C-1)，166.9(C-8)，166.3(C-5)，165.3(C-1′)，158.9(C-3′)，149.1(C-2)，135.8(C-14)，132.6(C-6)，132.5(C-7)，131.6(C-3)，118.0(C-13)，115.3(C-2′)，111.9(C-9)，111.6(C-10)，68.6(C-11)，32.9(C-12)，27.5(C-5′)，25.7(C-15)，20.4(C-4′)，17.9(C-16).
以上波谱数据与文献[Chien-Chang Shen，Wan-Jr Syu；Antimicrobial Activities ofNaphthazarins from Arnebia euchroma；J.Nat.Prod 2002，65，1857-1862]报道的ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁数据对比，其核磁数据基本一致，故鉴定化合物为ββ-二甲基丙烯酰阿卡宁，其结构如下：
3)α-甲基丁酰阿卡宁的鉴定：
1H-NMR谱(CDCl2，400MHz，δ)低场信号δ12.59(1H，s)、δ12.42(1H，s)是活泼氢信号表示可能有酚羟基结构。芳香区的质子信号δ7.18(2H，s，)说明苯环取代后是一个对称的结构，7.00(1H，s，)另一个不饱和氢信号、6.03(H，dd，J＝4.48Hz，7.16Hz)说明此碳旁有两个不同的氢信号，5.13(1H，t，J＝7.32Hz)推测是-CH-CH2-结构、2.62，2.48(H，m，)2.44(H，m，)1.49、1.69(H，m，)、1.69(3H，s)、1.57(3H，s)、1.17(3H，d)、0.95(3H，d)，推测该化合物有4个-CH3信号。
13C-NMR谱(CDCl3，400MHz，δ)δ178.3(C-4)，176.8(C-1)，175.4(C-1′)，167.4(C-8)，166.9(C-5)，148.6(C-2)，135.9(C-14)，132.8(C-6)，132.7(C-7)，131.4(C-3)，118.0(C-13)，111.9(C-9)，111.6(C-10)，69.0(C-11)，41.0(C-2′)，33.0(C-12)，26.7(C-3′)，25.7(C-15)，17.9(C-16)，16.4(C-5′)，11.5(C-4′).
以上波谱数据与文献[Chien-Chang Shen，Wan-Jr Syu；Antimicrobial Activities ofNaphthazarins from Arnebia euchroma；J.Nat.Prod.2002，65，1857-1862]报道的α-甲基丁酰紫草素对比，其核磁数据基本一致，故鉴定化合物为α-甲基丁酰紫草素，其结构如下：
4)异戊酰阿卡宁的鉴定：
1H-NMR谱(CDCl2，400MHz，δ)低场信号δ12.59(1H，s)、δ12.43(1H，s)是活泼氢信号表示可能有酚羟基结构。芳香区的质子信号δ7.19(2H，s，)、说明苯环取代后是一个对称的结构，6.99(1H，s，)，芳香区另一个不饱和氢信号，6.14(1H，dd，J＝4.48Hz，J＝7.20Hz)，说明此碳旁有两个不同的氢信号、5.13(1H，t，J＝7.16Hz)推测有-CH-CH2-结构2.62，2.48(H，m)，2.44(2H，m)，2.13(H，m，)、1.69(3H，s)、1.58(3H，s)、0.97(3H，d，J＝1.24Hz)，0.98(3H，d，J＝1.36Hz)，推测该化合物有4个-CH3信号。
13C-NMR谱(CDCl3，400MHz，δ)δ178.2(C-4)，176.7(C-1)，171.8(C-1′)，167.5(C-8)，166.9(C-5)，148.5(C-2)，136.0(C-14)，132.9(C-6)，132.7(C-7)，131.5(C-3)，117.9(C-13)，111.8(C-9)，111.6(C-10)，69.2(C-11)，43.4(C-2′)，33.0(C-12)，25.8(C-3′)，25.7(C-15)，22.4(C-5′)，22.3(C-4′)，17.9(C-16).
以上波谱数据与文献[Chien-Chang Shen，Wan-Jr Syu；Antimicrobial Activities ofNaphthazarins from Arnebia euchroma；J.Nat.Prod.2002，65，1857-1862]报道的异戊酰紫草素数据对比，其核磁数据基本一致，故鉴定化合物为异戊酰紫草素，其结构如下：
紫草提取物的药效学试验
试验例2.紫草提取物对大鼠佐剂关节炎的影响
2.1材料
受试样品：紫草提取物，按实施例1制备。
2.2方法与结果
80只雄性SD大鼠按体重随机分为8组，分别为：正常组、模型组、空白基质组、醋酸泼尼松组(10mg/kg)、雷公藤多甙组(30mg/kg)、紫草低剂量组(5mg/kg)、紫草中剂量组(10mg/kg)、紫草高剂量组(20mg/kg)，每组10只。在造模前用足趾容积测量仪测所有大鼠左右足的足趾容积后，每只大鼠左足垫皮内注射完全弗式佐剂0.1ml造膜。造模后1h开始给药，连续给药28d；造模后每天测量AA大鼠左足容积(原发肿胀)，并同时于第9d、11d、13d、15d、19d、23d、27d测对侧足容积；致炎后第15d开始关节炎指数评分，每天一次。末次给药后1h，称取大鼠的体质量，腹主动脉取血测TNF-α。
实验结果显示，紫草提取物可明显降低AA大鼠关节肿胀度(图1、2)，改善大鼠体重降低(图3)及关节炎指数评分(图4)，可以有效地改善关节炎的症状。可降低血清中TNF-α含量(表1)，具有抗炎消肿、调节免疫的作用。可明显减少AA大鼠滑膜中炎性细胞浸润，抑制滑膜细胞的增殖，表现对滑膜和关节软骨组织的保护作用。
表1紫草提取物对AA大鼠血清中TNF-α含量的影响( n＝10)
与正常组比较ΔP＜0.01；与模型组比较*P＜0.05,**P＜0.01
结论：紫草提取物对大鼠佐剂关节炎有明显的治疗作用。
试验例3.紫草提取物对胶原诱导大鼠关节炎的影响
3.1材料
受试样品：紫草提取物，按实施例1制备。
3.2方法与结果
70只雄性Wistar大鼠按体重随机分为7组，分别为：正常组、模型组、益赛普组(0.8mg/kg)、雷公藤多甙组(30mg/kg)、紫草低剂量组(5mg/kg)、紫草中剂量组(10mg/kg)、紫草高剂量组(20mg/kg)，每组10只。造模时于每只大鼠左足足垫皮内注射牛II型胶原乳剂0.1ml；初次免疫10天后每只大鼠距尾根部2-3cm处皮下同等剂量加强免疫一次；14d后造模成功开始给药，连续给药28d；造模前用足趾容积测量仪测所有大鼠左右足的足趾容积，造模后每天测量CIA大鼠左足容积(原发肿胀)，并同时于造模后10d开始隔天测对侧足足趾容积；造模后12d开始关节炎指数评分，每隔2d评分1次，连续32d；末次给药后1h，称取大鼠的体质量，腹主动脉取血。
实验结果表明，紫草提取物可抑制CIA大鼠的足爪肿胀(图5、6)，改善大鼠体重降低(图7)，降低多发性关节炎指数评分(图8)，减轻CIA大鼠的炎症表现。
结论：紫草提取物对胶原诱导大鼠关节炎有明显的治疗作用。
试验例4.紫草提取物对PDE4活性的抑制作用
4.1材料
受试样品：紫草提取物，按实施例1制备。
4.2方法与结果
PDE4酶的提取方法参照文献方法获得[陈武，姜代勋，杨柳，等.猪嗜中性粒细胞cAMP磷酸二酯酶的提取与活性检测[J].北京农学院学报，2003，18(4)：242-244.]，即参照上述文献方法制备猪嗜中性粒细胞，粒细胞用Ca/Mg PBS稀释至约1011个/L，再将该稀释液在冰浴中用玻璃匀浆器制成匀浆，显微镜下确认细胞被粉碎均匀，即得富含PDE4的酶样。
首先测定酶的活性：cAMP用Ca/Mg PBS配成100μmol.L-1，酶样设4个取样量，用Ca/Mg PBS定容至100μL，加样过程在冰浴中进行，具体加样量见表2.加样后各管置35℃中恒温孵育30min，然后于100℃水浴中2-3min终止反应，各管于4℃15000r/min离心30min，取上清70μL，用超纯水稀释5倍(加入280μlddH2O)，HPLC进样20μL，254nm波长下检测，流动相为甲醇∶磷酸缓冲液＝10∶90。实验结果详见图9。
表2：酶反应的加样量
PDE活性以底物的水解百分率表示：
其次是测定紫草提取物对PDE活性的影响：酶反应在Ca/Mg PBS中进行，cAMP用缓冲液配成100μmol.L-1，反应时取65μL，酶样量30μL，药物分五个不同浓度，用量为1μL，对照管和样品管加入提取的PDE4酶样，空白对照管加入灭活的酶样，用缓冲液定容至100μL，加样顺序见表3。
表3酶反应加样顺序及剂量
加样后各管置35℃中恒温孵育30min，然后于100℃水浴中2-3min终止反应，各管于4℃15000r/min离心30min，取上清70μL，用超纯水稀释5倍(加入280μlddH2O)，HPLC进 样20μL，254nm波长下检测，流动相为甲醇∶磷酸缓冲液＝10∶90。结果详见表4。
表4紫草提取物对PDE4活性的影响
4.3试验结论：紫草提取物对PDE4具有抑制活性，当紫草提取物的浓度达到5000μg/ml时，对PDE4的抑制活性达到了91.2％。
试验例5.紫草提取物抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞TNF-α和IL-1释放的实验
5.1材料
受试样品：紫草提取物，按实施例1制备。
5.2方法与结果
取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞密度为5×105cells/ml，将细胞悬液加入到96孔培养板中)(200μl/孔)，放入二氧化碳培养箱中培养1小时，后加入LPS终浓度为1μg/ml和不同浓度的紫草提取物(终浓度为0.15，0.3，0.6，1.2，2.4μg/ml)，加药完成后，将96孔培养板放入CO2培养箱中培养6h，取细胞上消按照TNF-α和IL-1βELISA试剂盒说明书测定细胞上清中TNF-α和IL-1β的活性。结果详见表5、6。
实验结果表明在0.15～2.4μg/ml紫草提取物对LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7的炎症因子TNF-α和IL-1β的分泌具有抑制作用。
表5紫草提取物对LPS诱导小鼠巨噬细胞分泌的TNF-α抑制结果
表6紫草提取物对LPS诱导小鼠巨噬细胞分泌的IL-1β抑制结果
Claims (6)
1.一种治疗类风湿性关节炎的紫草提取物，其特征为该提取物中按高效液相色谱峰面积归一化法计，含有乙酰阿卡宁为10～20％，异戊酰阿卡宁为10～15％，α-甲基丁酰阿卡宁为10～15％，β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁为15～25％。
2.权利要求1所述的紫草提取物的制备方法，其特征在于包括下列步骤：取新疆紫草药材饮片，50-60℃条件下10-20倍量(体积∶质量，ml∶g)石油醚(60-90℃)浸提2-4次，每次浸提1-3小时，提取液浓缩回收溶剂，得浸膏，再以浸膏10-20倍重量的硅胶进行柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯体系洗脱，薄层色谱检查，合并萘醌类成分，即得紫草提取物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征为该提取物通过以下方法制备，取新疆紫草药材饮片，55℃条件下15倍量(体积∶质量，ml∶g)石油醚(60-90℃)浸提3次，每次浸提3小时，提取液浓缩回收溶剂，得浸膏，再以15倍量硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯体系洗脱，薄层色谱检查，合并萘醌类成分，即得紫草提取物。
4.含有权利要求1所述的紫草提取物的口服制剂，其特征为该提取物的剂型为软胶囊。
5.根据权利要求4所述的紫草提取物的口服制剂，其特征为该提取物的软胶囊剂型的组方为：紫草提取物25-50g、大豆油450-475g、明胶100g、甘油40g、对羟基苯甲酸甲酯0.16g、对羟基苯甲酸丙酯0.04g、蒸馏水适量；制备方法为：取明胶加入适量蒸馏水使其吸水膨胀，另将甘油、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和剩余蒸馏水置煮胶锅中加热至70-80℃，混合均匀，加入膨胀的明胶搅拌，熔融，保温1-2小时，静置，刮去上浮的泡沫，用纱布过滤，保温待用；取紫草提取物溶于大豆油中，制备药液；将已制备好的囊壳液和药液在软胶囊成型机中制成软胶囊，再进行定型、干燥、洗丸、拣丸、包装，制成软胶囊。
6.权利要求1所述的紫草提取物在制备治疗类风湿性关节炎药物中的用途。
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