CN102228666A - 来自松花粉与姜黄的组合物及其制备方法和在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明来自松花粉与姜黄的组合物及其制备方法和该组合物在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用涉及一种来自植物的组合物及其制备方法和应用。本发明组合物对病变结肠粘膜有修复作用，炎症性肠病大鼠经组合物治疗后MDA含量降低，SOD的活力增加，可用于制备治疗炎症性肠病的药物。本发明组合物，其按质量份计包括：破壁松花粉1-10份，姜黄提取物1份；其中姜黄提取物由质量比例为(6-8)∶(1.5-2.5)∶(0.7-1.3)的姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素组成。

Description

来自松花粉与姜黄的组合物及其制备方法和在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种来自植物的组合物及其制备方法和应用，特别是指一种来自松花粉与姜黄的组合物及其制备方法和该组合物在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用。

背景技术

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一组病因不明的慢性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)。近年来国内外IBD的发病率呈上升趋势，IBD的病因和发病机制尚未完全明确。已知肠道粘膜免疫系统异常反应所导致的炎症反应在IBD发病中起重要作用，这被认为是由环境、遗传、感染和免疫因素等多因素相互作用所致。IBD发病机制的复杂性给临床根治造成了一定的困难，被世界卫生组织列为现代难治病之一。炎症性肠病的临床症状主要表现为腹泻、腹痛和黏液脓血便，克罗恩病主要表现为腹痛、腹泻、瘘管、肛门病变等。炎症性肠病在西方国家相当常见，溃疡性结肠炎在欧洲和美国的发病率为10/10万～20/10万，克罗恩病的发病率为5/10万～10/10万。随着国民生活水平的提高，炎症性肠病在中国近年报道的病例也明显增多，综合多家医院病例的统计推测，溃疡性结肠炎的患病率为11.6/10万，克罗恩病的患病率为1.4/10万，实际病例可能更多。炎症性肠病已成为中国消化系统常见疾病和慢性腹泻的主要原因，且患者多为青壮年，因此日益受到重视。目前用于治疗IBD的药物有传统的水杨酸类制剂、皮质激素、免疫抑制剂和新兴的生物制剂，因长期服用的不良反应和价格因素，寻找IBD新的治疗方法和药物已经逐渐成为一种热点。

松花粉是松科马尾松(Pinus massoniana Lamb.)、油松(Pinus tabulaeformis Carr.)或同属树种植物的干燥花粉，又名松黄，我国第一部药典《神农本草经》中就有“松黄”的记载，其功用为：“松黄，气味甘平无毒，主治心腹寒热邪气，利小便，消淤血，久服轻身益气力，延年。”将其列为上品【王敏.松花粉的成分及药理作用研究进展[J].安徽医药，2008，12(4)：357-358.】。松花粉药食兼用的历史已逾数千年，我国利用松花粉的历史至少可追溯到2400年前。现广泛应用于保健食品、药品、化妆品等领域。而有关研究表明，松花粉除可以抗疲劳、延缓衰老、提高机体免疫力等功效，还具有调节胃肠功能【罗砚曦，蔡华芳，钟玉森.破壁松花粉的药用功效研究进展[J].中国药房，2009，20(12)：957-958.】。破壁松花粉中含有丰富的维生素B1，可以促进肠道蠕动，增强消化功能，其丰富的膳食纤维特别是木质素含量很高，在治疗便秘，增进食欲，预防十二指肠溃疡、痔疮、溃疡性结肠炎、慢性萎缩性胃炎等疾病方面也起到重要作用。研究表明，松花粉只有破壁后才能有利于人体吸收其有效成分，而松花粉破壁后极易氧化和染菌，姜黄具有抗氧化、抗菌的作用，两者联合用药，相辅相成。

姜黄(Rhizoma Curcumae Longae)是一种常用的中药，收载于历版《中华人民共和国药典》其来源于姜科姜黄属植物姜黄(Curcuma longaL.)的干燥根茎。姜黄素是中药材姜黄(RhizomaCurcumae Longae)的有效成分之一，姜黄素具有破血行气、通经止痛的功能，传统中医用于胸胁刺痛，闭经，风湿肩臂疼痛，跌打肿痛，抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血脂等广泛的药理作用，而且毒性很低【张洪英.中药姜黄的研究进展中药姜黄的研究进展[J].菏泽医专学报2001，13(4)：84-87.】，越来越多受到国内外的重视。从中药材姜黄(Rhizoma Curcumae Longae)中提取分离得到以姜黄素为主的分子结构略有差异的三种酚性单体，即姜黄素(I，curcumin)、脱甲氧基姜黄素(II，Demethoxycurcumin)和双脱甲氧基姜黄素(III，Bisdemethoxycurcumin)，分子式分别为C₂₁H₂₀O₆、C₂₀H₁₈O₅和C₁₉H₁₆O₄，化学结构式如下：

炎症性肠病的发生原因和致病机制迄今尚未完全阐明，多年研究证实该病与自身免疫反应有关，异常的免疫反应或正常免疫调节的破坏是其发病的重要环节。破壁松花粉中所含多糖具有免疫调节功能，能改善由免疫功能异常所导致的肠粘膜功能下降或丧失；其中所含有效成分多糖及多种营养成分(氨基酸、微量元素及维生素C等)，对受损肠粘膜有修复和营养作用。破壁松花粉中的纤维素能够可以减少胆汁酸的吸收量，改变食物的消化速度和消化液的分泌量。而姜黄素具有显著的抗炎、抗菌的作用，可以在溃疡面抑制炎症因子的表达，对粘膜细胞具有保护作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来自破壁松花粉、姜黄的组合物及其制备方法和该组合物在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用。

一种组合物，其按质量份计包括：

破壁松花粉    1-10份

姜黄提取物    1份；

其中姜黄提取物由质量比例为(6-8)∶(1.5-2.5)∶(0.7-1.3)的姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素组成。

本发明组合物，其中所述姜黄提取物姜黄提取物由质量比例为7∶2∶1的姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素组成。

本发明组合物，其中所述破壁松花粉的粒径为3-5μm。

本发明组合物，其按质量份计的优选配比为：

破壁松花粉    5份

姜黄提取物    1份。

一种制备上述姜黄提取物的方法，包括以下步骤：

A、将干燥的中药材姜黄(Rhizoma CurcumaeLongae)粉碎后过40目筛；

B、取过筛所得粉末，每次用所取粉末8倍量的80％乙醇加热回流2h进行提取，共提取三次。每次提取后过滤提取液并合并提取液；

C、浓缩并干燥至姜黄提取物浸膏无乙醇味；

D、样品处理：用乙酸乙酯溶解姜黄提取物浸膏至其可完全溶解，加入质量为姜黄提取物浸膏质量2-5倍的、粒径为80-120目的硅胶，使硅胶充分吸附姜黄提取物，并于真空状态下，60℃干燥，得到硅胶拌样；

E、柱层析分离：选用层析柱的柱长：直径＝9∶1；选用粒径为200-300目的硅胶，其用量为姜黄提取物浸膏质量的40-50倍；洗脱条件：先用姜黄提取物浸膏质量的500倍(体积质量比，即1g姜黄提取物浸膏对应500ml氯仿)的氯仿洗脱掉杂质、再用体积比为(90-99)∶(10-1)的氯仿-甲醇为洗脱液进行洗脱，从有亮黄色溶液流出时，开始收集流出的溶液，以TLC检测，至无洗脱物流出；

F、减压浓缩，得到姜黄提取物。

本发明制备上述姜黄提取物的方法，其中所述TLC检测所用展开剂为：按体积比计CHCl₃∶CH₃OH∶HCOOH＝96∶4∶0.7的混合液。

本发明制备上述姜黄提取物的方法，其中所述氯仿-甲醇的优选体积比为99∶1。

一种上述组合物的口服固体保健品，其可通过将上述组合物与一种或多种药学上可接受的固体赋形剂或辅剂按一定比例结合制备。

本发明组合物的口服固体保健品，其中所述口服固体保健品的剂型包括：片剂、胶囊剂或丸剂，其中所述固体赋形剂或辅剂包括：微晶纤维素、淀粉、植物油和/或预胶化淀粉。

一种上述组合物在制备治疗炎症性肠病药物方面的应用。

本发明组合物对病变结肠粘膜有修复作用；炎症性肠病大鼠经组合物治疗后MDA含量降低，SOD的活力增加，以中、高剂量组的治疗效果为佳；组合物中、高剂量组对炎症性肠病的治疗效果优于单用破壁松花粉或姜黄提取物(详见实施例6)。

具体实施方式

实施例1：姜黄提取物的制备

1、将干燥的中药材姜黄粉碎后过40目筛；

2、取过筛得到的粉末500g，每次用其8倍量的80％乙醇加热回流2h进行提取，共提取三次，每次提取后过滤提取液，并合并提取液；

3、减压浓缩并减压干燥至姜黄提取物浸膏无醇味，得到姜黄提取物浸膏40g。

4、用乙酸乙酯溶解姜黄提取物浸膏40g至其可完全溶解，加入80-120目的硅胶100g，使硅胶充分吸附总姜黄素，并于真空状态下，60℃烘干，得到硅胶拌样(红棕色)，备用。

5、称取1800g(200-300目)硅胶，干法装于层析柱(直径100mm，柱长900mm)中，先用纯氯仿为洗脱液洗脱，每1000ml一瓶，用20瓶纯氯仿洗脱以后，再以氯仿-甲醇(99∶1v/v)混合液为洗脱液洗脱，从有亮黄色溶液流出时，开始收集流出的溶液，以TLC检测(按体积比计CHCl₃∶CH₃OH∶HCOOH＝96∶4∶0.7的混合液作为展开剂)，至无洗脱物流出。减压浓缩，得到姜黄提取物。

6、对得到的姜黄提取物进行HPLC检测，使用HPLC检测姜黄提取物的条件：色谱柱：Alltima C18，粒径5μm，柱长250mm，直径4.6mm；流动相：0.2％乙酸水溶液-乙腈(40∶60)；检测波长：420nm；进样量：20μl；柱温：30℃。步骤5所得姜黄提取物由按质量比为7∶2∶1的姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素组成。

实施例2-5中所述破壁松花粉可从多处市购，本破壁松花粉购自烟台新时代健康产业有限公司，所述破壁松花粉的粒径为3-5μm，所述姜黄提取物来自实施例1。

实施例2：来自松花粉与姜黄提取物组合物的制备方法

破壁松花粉和姜黄提取物混合，用0.9％生理盐水配成混悬液。

实施例3：

称取破壁松花粉150g，实施例1中得到的姜黄提取物30g，混匀，过80目筛，加入微晶纤维素200g、淀粉90g作为稀释剂组成制剂配方，混匀，喷入75％乙醇为粘合剂制软材，用24目筛制粒，干燥后整粒，混匀，压片，制成1000片，包衣，即得，每片含破壁松花粉和姜黄提取物的混合物180mg。

实施例4：

称取破壁松花粉50g，实施例1中得到的姜黄提取物50g，混匀，过80目筛，混悬于大豆油400g中，经胶体磨研磨均匀，作为料液，以500mg/粒压制，制成1000粒，经干燥、定型、包装即得，每片含破壁松花粉和姜黄提取物的混合物100mg。

实施例5：

称取破壁松花粉100g，实施例1中得到的姜黄提取物10g，混匀，过80目筛，在所得粉末中，加入预胶化淀粉280g，微晶纤维素80g，作为稀释剂组成制剂配方，混匀，喷入75％乙醇为粘合剂制软材，用24目筛制粒，干燥后整粒，混匀，装胶囊，制成1000粒，即得，每粒含破壁松花粉和姜黄提取物的混合物110mg。

实施例6

1.材料

实验动物：健康3级SD大鼠，随机分为8组，每组10只，雌雄各半，体重200～220g。

实验药物：柳氮磺胺吡啶；破壁松花粉与姜黄提取物(质量比5∶1，姜黄提取物由实施例1制备)的组合物(以下简称组合物)；姜黄提取物由实施例1制备。

试剂与器材：无水乙醇(分析纯)，2，4，6-三硝基苯磺酸(美国，Sigma公司)；SOD、MDA检测试剂盒(北京邦定生物医学公司)。TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，Aglient1200高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，TDL-5-A离心机(上海安亭科学仪器厂)。

2.大鼠实验性炎症性肠病模型的建立：

采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)法造模：将大鼠禁食24h后麻醉，一次性将TNBS(100mg/kg)和50％乙醇溶液0.25ml用橡胶输液管缓慢注入距肛门约8cm处的肠腔内。造模后第3天治疗组开始给药。

3.实验分组及给药：

正常组及模型组，予以生理盐水灌胃，每天一次，共5周；阳性药物对照组(以下称阳性药物组)选用柳氮磺胺吡啶(SASP)按相当于人的中等治疗剂量，灌胃给予300mg/kg SASP，每天一次，共治疗5周；破壁松花粉组给予150mg/kg灌胃，每天一次；姜黄提取物组给予30mg/kg灌胃，每天一次；组合物分别按低剂量组(100mg/kg)、中剂量组(200mg/kg)和高剂量组(300mg/kg)灌胃，每天一次，共治疗5周。

4.观察指标及测定方法：

5周后各组大鼠经10％水合氯醛(400mg/kg)麻醉，立即开腹分离结肠，沿肠系膜缘剪开肠腔，取病变处结肠1～2cm速冻于液氮中，后转至-70℃保存，留待测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，以两者含量作为观察指标。结肠组织匀浆SOD含量测定使用SOD检测试剂盒，采用黄嘌呤氧化酶法测定，结果用U/mg表示。MDA含量测定使用MDA检测试剂盒，采用硫代巴比妥酸反应产物比色法测定，结果用μmol/g表示。

有关炎症性肠病的临床和实验研究均发现自由基及其触发的脂质过氧化反应在其发生、发展中有重要作用。而SOD能有效地清除氧自由基，催化超氧化自由基分解成H₂O₂，进而在过氧化氢酶的作用下分解成H₂O和氧分子，从而抑制肠组织中的脂质过氧化反应。SOD活性可反映机体的脂质过氧化反应和抗脂质过氧化反应的能力。

机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物以及新的氧自由基等。因而测试MDA的量常常可以反映机体内脂质过氧化的程度，反映细胞损伤的程度。

统计学处理：

实验数据用

表示，各组间进行t检验。

6.结果

表1各组结肠组织中SOD和MDA含量变化(n＝10，

)

注：^△△△表示与正常组比较，P＜0.001；^*表示与模型组比较P＜0.05，^**表示与模型组比较P＜0.01，^***表示与模型组比较P＜0.001；⁺表示与破壁松花粉组比较P＜0.05，；^#表示与姜黄提取物组比较P＜0.05。

表2各组大鼠结肠大体形态和组织学损伤评分比较(n＝10，

分)

注：^**表示与模型组比较P＜0.01，⁺表示与破壁松花粉组比较P＜0.05，^#表示与姜黄提取物组比较P＜0.05。

(肠组织损伤大体形态和组织学形态评分方法【朱峰，钱家鸣，潘国宗.细胞免疫反应性炎症性肠病动物模型的建立[J].中国医学科学院学报，1998，20(4)：271.】大体形态损伤评分指标包括粘连、局部充血、溃疡及炎症。粘连及充血按有无及轻重分别计0，1，2分，出现炎症、溃疡数目增加1个、溃疡面＞2cm时，范围每增加1cm，计分均加1。组织学指标包括溃疡、炎症、肉芽肿、纤维化及病变深度，按有无及轻重分别计0，1，2分，病变深度达粘膜下层肌层、浆膜层分别计1，2，3分。各项相加得总分。)

7.结论

实验结果表明，模型组的SOD活力与正常组比较有显著性降低(P＜0.001)；阳性药物组的SOD活力与模型组比较有显著性升高(P＜0.001)；破壁松花粉组的SOD活力和姜黄提取物组与模型组比较则有显著性升高(P＜0.05)，说明单用破壁松花粉或者姜黄素均可提高机体抑制肠组织中的脂质过氧化反应；组合物低、中、高剂量组的SOD活力与模型组比较则有升高(分别为P＜0.05，P＜0.001，P＜0.01)，且中、高剂量组的SOD活力与单用破壁松花粉组和单用姜黄提取物组相比有显著性差异(P＜0.05)，说明联合用药比单一给药具有更为显著的疗效。

模型组的MDA含量与正常组比较有显著性升高(P＜0.001)；阳性药物组的MDA含量与模型组比较则有显著性降低(P＜0.01)；破壁松花粉组的MDA含量和姜黄提取物组与模型组比较则有显著性降低(P＜0.01)，说明单一给药均可降低机体细胞损伤的程度；组合物低、中、高剂量组的MDA含量与模型组比较则有降低(分别为P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)，且中、高剂量组的MDA含量与单用破壁松花粉组和姜黄提取物组有显著性差异(P＜0.05)，说明联合用药比单一给药对降低机体细胞的损伤程度更有效果。

大鼠结肠大体形态和组织学损伤评分显示，破壁松花粉、姜黄提取物及组合物(中高剂量组)大体损伤及组织学损伤评分均与模型组有显著性降低(P＜0.01)，说明破壁松花粉、姜黄提取物及组合物均对结肠炎有治疗作用；组合物中、高剂量组与单用破壁松花粉或姜黄提取物比较有显著性降低(P＜0.05)，说明联合用药比单一给药具有更为显著的疗效。

综上所述，本实验证明：1)组合物对病变结肠粘膜有修复作用；2)炎症性肠病大鼠经组合物治疗后MDA含量降低，SOD的活力增加，以中、高剂量组的治疗效果为佳。3)组合物中、高剂量组对炎症性肠病的治疗效果优于单用破壁松花粉或姜黄提取物。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于按质量份计包括：

破壁松花粉    1-10份

姜黄提取物    1份；

其中姜黄提取物由质量比例为(6-8)∶(1.5-2.5)∶(0.7-1.3)的姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素组成。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述姜黄提取物由质量比例为7∶2∶1的姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素组成。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于破壁松花粉的粒径为3-5μm。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于按质量份计的优选配比为：

破壁松花粉    5份

姜黄提取物    1份。

5.一种制备上述姜黄提取物的方法，其特征在于包括以下步骤：

A、将干燥的中药材姜黄粉碎后过40目筛；

B、取过筛所得粉末，每次用所取粉末8倍量的80％乙醇加热回流2h进行提取，共提取三次，每次提取后过滤提取液并合并提取液；

C、浓缩并干燥至姜黄提取物浸膏无乙醇味；

D、样品处理：用乙酸乙酯溶解姜黄提取物浸膏至其可完全溶解，加入质量为姜黄提取物浸膏质量2-5倍的、粒径为80-120目的硅胶，使硅胶充分吸附姜黄提取物，并于真空状态下，60℃干燥，得到硅胶拌样；

E、柱层析分离：选用层析柱的柱长：直径＝9∶1；选用粒径为200-300目的硅胶，其用量为姜黄提取物浸膏质量的40-50倍；洗脱条件：先用姜黄提取物浸膏质量的500倍的氯仿洗脱掉杂质、再用体积比为(90-99)∶(10-1)的氯仿-甲醇为洗脱液进行洗脱，从有亮黄色溶液流出时，开始收集流出的溶液，以TLC检测，至无洗脱物流出；其中姜黄提取物浸膏质量的500倍的氯仿是体积质量比，即1g姜黄提取物浸膏对应500ml氯仿；

F、减压浓缩，得到姜黄提取物。

6.根据权利要求5所述的制备上述姜黄提取物的方法，其特征在于：所述TLC检测所用展开剂为：按体积比计CHCl₃∶CH₃OH∶HCOOH＝96∶4∶0.7的混合液。

7.根据权利要求6所述的制备上述姜黄提取物的方法，其特征在于：所述氯仿-甲醇的优选体积比为99∶1。

8.一种上述组合物的口服固体保健品，其特征在于：可通过将上述组合物与一种或多种药学上可接受的固体赋形剂或辅剂按一定比例结合制备。

9.根据权利要求8所述的上述组合物的口服固体保健品，其特征在于：所述口服固体保健品的剂型包括：片剂、胶囊剂或丸剂，所述固体赋形剂或辅剂包括：微晶纤维素、淀粉、植物油和/或预胶化淀粉。

10.一种上述组合物在制备治疗炎症性肠病药物方面的应用。