CN101284031B - 毛冬青提取物、其制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药领域，公开了一种毛冬青提取物、提取物的制备及应用。本发明公开的毛冬青提取物中，毛冬青总皂甙以Ilexsaponin B1计，重量百分含量不低于50％，IlexsaponinA1的重量百分含量不低于4.0％，Ilexsaponin B1的重量百分含量为2.5～7.5％，IlexsaponinB3的重量百分含量为3.0～8.0％。本发明以毛冬青有效成分为技术指标，对毛冬青提取工艺进行了系统筛选，确定了毛冬青提取物生产工艺；引入现代制药的“原料药”概念，建立以毛冬青标准提取物投料的各类新一代中成药制剂生产工艺。

Description

毛冬青提取物、其制备及应用

技术领域

本发明涉及中药领域，尤其涉及毛冬青提取物、提取物的制备及应用。

背景技术

毛冬青(Ilex pubescens Hook.et Arn)是冬青科冬青属下的一种植物，为常绿灌木，高约3米。生于山坡、山谷林中或灌丛中。分布于广东、广西、安徽、福建、浙江、江西、台湾等地。毛冬青的根是我国江南一些省区民间常用药，具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒之功效。毛冬青药材标准是以其根基作为入药部位，并收载于《中华人民共和国药典》77年版(P：107)，毛冬青胶囊和注射液分别收载于卫生部药品标准_中药成方制剂.第七分册(P：23)和第二十分册(P：57)，毛冬青片收载于药监局的国家药品标准_中药成方制剂 心系分册(P：497)。

经近代药理学研究证明，毛冬青提取物及其制剂在循环和血液系统中具有多方面作用。它能显著提高小鼠常压耐缺氧能力，增加大鼠离体冠脉流量，减慢心率，增大心博幅度；显著对抗急性心肌缺血，对抗心电图ST段上移和T波升高(孟广生等，毛冬青地上部分对大鼠冠脉流量的影响及抗心肌缺血作用.中药药理与临床.1996，(3)：34-35)。毛冬青注射液能使麻醉猫和犬静脉血压明显下降，降压作用缓慢但持久(董昆山 等 主编.现代临床中药学.中国中医药出版社.1998，p：504-506)。毛冬青能使兔耳皮下血管及肢体肌肉血管血流量增加，能消除去甲肾上腺素或加压素诱导的血管收缩(中山医学院第一附属医院外科.毛冬青对兔离体器官血管作用的实验及其在断肢再植中的临床应用.中华医学杂志.1974，54(2)：97-100)。口服毛冬青皂苷Ilexsaponin B3能显著降低实验性小鼠高胆固醇血脂(Kazuyuki hidaka et al.New triterpene saponins from Ilex pubescens.Chem.Pharm.Bull.1987，35(2)：524-529)。毛冬青具有抗血栓作用，连续口服10天毛冬青提取物(70％甲醇)能显著地延长实验性大鼠出血试验的时间，但对血浆的凝聚时间影响不大；它还能显著地抑制血小板中丙二醛(malondialhyde)的形成(Yong N.Han et al.Antithromboticactivity of the triterpenoids of Ilex Pubescens and the conversion method of thetriterpenoids of Ilex Pubescens having no antithrombotic activityinto thetriterpenoids having antithrombotic activity.United States Patent 4,987,125)。毛冬青注射液对凝血酶诱导的肌动蛋白聚合、肌球蛋白与肌动蛋白微丝的结合有强烈的抑制作用(黄才等.毛冬青和复方丹参注射液对猪血小板细胞骨架蛋白的影响.湛江医学院学报.1993，11(1-2)：9-11)。毛冬青注射液对甘油诱导的大鼠急性肾功能衰竭(ARF)有预防作用(陈少刚 等.毛冬青预防大鼠甘油致急性肾功能衰竭的初步实验研究.实用医学杂志.1990，6(4)：5-8)。毛冬青注射液对动物S-180肿瘤放射有增敏，且E/O比值达1.4(吴少雄等.毛冬青(IP)作为放射增敏剂的初步动物实验研究.癌症.1990，9(6)：512-513)。另外毛冬青提取物能显著地缩短去势大鼠阴茎勃起起伏期，在交配能力上，能缩短大鼠扑捉和射精潜伏期，增加扑捉和射精次数，提示具有抗ED作用(周国伟 等.治疗勃起功能障碍症的毛冬青提取物制剂及其制备方法.中国发明专利.公开号：CN 1355028A.授权号：ZL00 127593.3)。

目前毛冬青制剂主要应用于冠心病、高胆固醇血症、高血压、血栓闭塞性脉管炎、缺血性脑中风、中心性视网膜炎、慢性盆腔炎、输卵管炎性阻塞、萎缩性鼻炎以及外科感染性外伤等治疗，效果良好(董昆山 等 主编.现代临床中药学.中国中医药出版社.1998，p：504-506)。

有关毛冬青提取物或上述提到的胶囊、注射液和片剂有效成分，文献普遍认为是黄酮化合物(中国药科大学 主编.中药辞海 第一卷.中国医药科学出版社.1998，p：1100；江苏新医学院 编 中药大辞典(下册)上海科学技术出版社.1998，p：441)，在毛冬青胶囊或注射液质量标准的含量测定项目中还使用芦丁为对照的分光光度法测定制剂中总黄酮量，在片剂标准中含量测定指标换成了原儿茶醛，但此标准批件中仍有增设总黄酮含测建议。其实毛冬青提取物或制剂的有效成分并不是黄酮，而是三萜皂甙和木脂素甙。据调查，到目前为止国内外尚无一篇有关从毛冬青根部中分离获得黄酮类单体的报道，至于出现毛冬青含有黄酮成分报道，那可能是早期的化学成分预试验的结果。在我们的有效成分研究中，曾分离到木脂素甙类成分丁香树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖甙，该化合物含有酚羟基结构，这在成分预试验中也能表现出与黄酮化合物类似的反应特征。

在国内，有不少毛冬青制剂专利获得公开，曲韵智(CN 1686362)、孙民富(CN 1759847先后公开了滴丸处方和制备方法，范友灵等(CN 1686251)公开了软胶囊处方和制备方法，刘露(CN 1733013)公开了注射液处方和制备方法；张平(CN 1628832)和王伟(CN 1813829)先后公开了冻干粉针制备方法，前者的毛冬青提取物经聚酰氨柱纯化处理，后者经大孔树脂处理，但样品标示的有效成分都称黄酮。袁海龙等(CN 1772020)公开的用大孔树脂纯化毛冬青制备冻干粉针的方法，粉针所用的提取物皂甙含量大于80％，但其皂甙含量以何物计不明确。在袁氏发明中，冻干粉针剂与市售毛冬青注射液质量比较的关键项目含量测定是以“新毛冬青素”计折算，然而“新毛冬青素”究竟是指何物未作任何说明，即使它是毛冬青中的成分之一，用它作对照测定总皂甙在技术上是否可行，也是需要通过实验来论证。综上所述可以了解，国内目前公开的毛冬青提取物或制剂都未能涉及到具体皂甙或皂甙成分组合的概念，即使是袁氏专利(CN 1772020)提到皂甙，但因其皂甙含量测定用对照物质不明或公开不充分等原因，使得对专利所声称的皂甙含量数值难以作出正确与否的判断。

目前，国内市场上毛冬青制剂无论是片剂、胶囊还是注射液，他们的生产工艺大多采用传统提取方法，即为水提醇沉，而该工艺其实对皂甙成分的损失较大，同时杂质仍较多，并不是理想的毛冬青类中药生产工艺。另外这些毛冬青制剂的质量体系也不尽相同，如毛冬青胶囊或注射液仍保留以芦丁作对照测定总黄酮含量，毛冬青片则以原儿茶醛为对照测定微量原儿茶醛，虽然比起测总黄酮有进步，但其仍未能够客观反映毛冬青制剂内在质量。鉴于上述背景和情况，研制质量稳定可控的毛冬青新一代制剂就显得非常重要。

发明内容

本发明的目的是公开一种毛冬青提取物、提取物的制备及应用。

本发明一方面，在比较深入研究毛冬青有效成分基础上，通过对毛冬青提取工艺的系统筛选，根据其主要有效成分特点，提出了一种比较客观反映实际状况的含毛冬青皂甙Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1和Ilexsaponin B3有效成分组合的提取物、提取物质量标准。

本发明公开了一种毛冬青提取物，该提取物中，毛冬青总皂甙以Ilexsaponin B1计，不低于50％，Ilexsaponin A1的重量百分含量不低于4.0％，Ilexsaponin B1的重量百分含量为2.5～7.5％，优选3.5％-6％，Ilexsaponin B3的重量百分含量为3.0～8.0％，优选3.5％-6.5％。较佳的，提取物中，Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1和Ilexsaponin B3重量比例为1∶(0.6～1.9)∶(0.7～2.0)之间，优选1∶(0.7-1.4)∶(0.8-1.5)。

上述含量均为以毛冬青提取物总重量为基础计的重量百分比含量。

本发明第二方面，公开了上述毛冬青提取物的制备方法，其过程包括先用稀醇提取，然后用大孔树脂纯化制备毛冬青提取物。

提取工艺过程是用5-10倍药材重量倍数的5％-50％乙醇水溶液，优选20％-30％乙醇水溶液回流提取2次，每次1-5小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.06-1.07(70±10℃下)的浓缩液，静置，取上清液供上大孔树脂柱纯化处理。

提取工艺改进的关键点在于采用了稀醇替代了传统的水提，在研究中发现，如用水提取，皂甙成分的实际转移率并不是很高，同时因水提产生大量泡沫，使提取液的浓缩成为困难；然而如采用常规的醇提工艺，则提取液中容易产生难以方便处理的絮状物(过滤或离心均较难去除)，影响后续纯化工艺的正常开展。现经过大量的实验，发现只要保持乙醇水溶液的浓度在50％以下，产生絮状物的现象就能得到较好的控制，尤其是采用20％-30％乙醇水溶液提取，效果比较理想，有效成分转移率既高，又无絮状物干扰，同时无大量泡沫，浓缩能顺利进行。

纯化工艺过程是取上述澄清的浓缩液上清液过一装有大孔树脂(药材重量的1/2-1/4)的水相层析柱，经3-6BV(树脂床体积倍数)量的水洗涤，用1-4BV量20％-80％乙醇水溶液如20％、40％、60％和80％乙醇溶液梯度洗脱(每种浓度的乙醇水溶液均采用1-4BV量的清洗)，收集40-60％乙醇流份，减压浓缩，真空干燥，得到浸膏粉。

上述乙醇的百分比含量均为体积百分比浓度。

第三方面，本发明公开了一种毛冬青制剂，含有上述毛冬青提取物与药用辅料，其中，毛冬青提取物与药用辅料的重量比为(4～8)∶(6～2)，优选(3-4)∶3。

上述毛冬青制剂包括颗粒剂、片剂(包括速释和缓释片剂)、胶囊(包括缓释胶囊)、软胶囊、干糖浆、滴丸、注射液以及冻干粉针剂等。

上述药用辅料可选用各种常用药用辅料，如：淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、低取代羟丙纤维素、羧甲基淀粉纳、乙基纤维素、聚乙二醇、丙二醇、大豆油、卵磷脂、蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘氨酸、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、滑石粉、可溶性淀粉、麦芽糊精、微粉硅胶和矫味剂等。

第四方面，本发明还公开了用上述方法制备的符合质量标准的毛冬青提取物、或上述各类毛冬青制剂在制备治疗心脑血管和血液系统疾病的药物或制备治疗勃起功能障碍症的药物上的应用。

具体的，上述方法制备的符合质量标准的毛冬青提取物可用于制备提高动物常压耐缺氧能力、降压、降血脂、抗血栓、抗血小板聚集或对心脑血管缺血性再灌注损伤有较好的保护作用的药物；制备治疗冠状动脉硬化性心脏病、缺血性脑中风、血栓闭塞性脉管炎、中心性视网膜炎外科感染性外伤或改善男性性功能的药物。

本发明以毛冬青有效成分为技术指标，对毛冬青提取工艺进行了系统筛选，确定了毛冬青提取物提取和纯化生产工艺；引入现代制药的“原料药”概念，建立以毛冬青标准提取物投料的各类新一代中成药制剂生产工艺。在质量方面，建立以毛冬青皂甙为指标的毛冬青标准提取物及其各类制剂的质量标准。使用这种科学、合理的标准提取物作为原料，制备毛冬青各类制剂，其质量稳定、有效成分重现性良好，优势显著，为确保毛冬青各类制剂在临床上安全和有效使用打下更坚实基础。

附图说明

图1.Ilexsaponin A1化学结构式

图2.Ilexsaponin B1和Ilexsaponin B3化学结构式

R1                          R2

ilexsaponin B1：Glc-Xyl-    H

ilexsaponin B3：Glc-Xyl-    Glc

图3.丁香树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖甙化学结构式

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如《中国药典》2005版中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

部分试验方法：

一：毛冬青总皂甙含量检测方法：

以Ilexsaponin B1为对照的分光光度法测定毛冬青总皂甙含量。

毛冬青总皂甙含量测定采用香草醛-硫酸法，具体操作过程是：对提取物样品，使用甲醇溶解，对药材样品，则须用甲醇索氏提取5小时；然后在被测样品溶液中，加入8％香草醛无水乙醇溶液0.5ml、72％硫酸5.0ml，摇匀后置60℃水浴中加温10分钟，然后立即置冰浴冷却10分钟，取出后放置5分钟；以对应的试剂作空白，在536nm下测定吸收值，然后根据标准曲线，计算总皂甙含量。

二：单一皂甙鉴别及含量测定方法：

用薄层层析鉴别，用高效液相色谱法测定单一皂甙含量。

薄层层析鉴别：取毛冬青提取物或制剂适量，用甲醇配制成每1ml含相当于提取物5mg的溶液，作为供试品溶液。另取Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1和Ilexsaponin B3对照品，加甲醇制成每1ml含1mg溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述四种溶液各1-2ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

高效液相色谱法的皂甙含量测定中，其成分的检测可以使用紫外或蒸散发光或视差仪中的一种，色谱柱采用C₁₃反相柱，柱温40℃，流动相采用0.2％甲酸溶液∶乙睛∶甲醇(47∶10-15∶45-40)；流速1.0ml/min。采用紫外检测时，检测波长为205nm；采用蒸散发光检测时，T_N＝120℃，T_E＝130℃，空气流速1.2SLM；采用视差仪检测时，视差仪温度设置在45℃。

实施例1毛冬青提取物中皂甙单体的分离

毛冬青中单体成分分离：取适量毛冬青提取物，用2-5倍量水溶解分散，与等体积的正丁醇萃取三次，合并正丁醇相，浓缩，得黄色粗总皂甙。再经大孔树脂层析、硅胶柱层、RP-18反相柱层和凝胶柱层反复分离、精制(具体方法由下列文献记载：Kazuyuki Hidaka et al NewTriterpens Saponins from Ilex pubescens Chem.Pharm.Bull.35(2)：524-529，1987)，分别获得单体I、II、III和IV。

单体I：FAB-MS(m/z)：1351.72(2M+Na)，1005.52(2M-Glu+Na)，687.25(M+Na)，663.49(M-1)；HRMS(m/z)：687.3723(M+Na)，理论值：687.3720，分子式为C₃₆H₅₆O₁₁。¹H NMR(Py-d₆)δ：1.05(3H，d，30Me)，1.17(3H，s，25Me)，1.22(3H，s，26Me)，1.40(3H，s，29Me)，1.71(3H，s，27Me)，1.73(3H，s，23Me)，2.91(1H，s，H-18)，3.07(1H，m，H-19)，3.35(1H.brd，H-3)，4.03(1H，brs，G-3)，4.19(1H，t，G-2)，4.27(2H，d，G-4，5)，4.34(1H，dd，G-6)，4.43(1H，d，G-6)，5.14(1H，brs，19-OH)，5.56(1H，s，H-12)，6.24(1H，d，G-1)。¹³C NMR(Py-d₆)δ：39.812(C-1，39.7(文献值))，29.149(C-2，29.0)，78.425(C-3，78.3)，49.295(C-4，49.1)，57.058(C-5，56.9)，21.110(C-6，21.0)，33.928(C-7，33.8)，40.470(C-8，40.3)，47.245(C-9，47.1)，37.921(C-10，37.8)，24.307(C-11，24.4)，128.582(C-12，128.4)，139.297(C-13，139.2)，42.254(C-14，42.1)，29.287(C-15，29.1)，26.197(C-16，26.0)，48.711(C-17，48.6)，54.573(C-18，54.4)，72.690(C-19，72.6)，42.169(C-20，42.1)，26.728(C-21，26.6)，37.688(C-22，37.8)，24.455(C-23，24.4)，181.054(C-24，181.0)，14.006(C-25，13.9)，17.383(C-26，17.3)，24.795(C-27，24.7)，177.050(C-28，177.1)，27.079(C-29，27.0)，16.724(C-30，16.7)；95.862(G-1，95.7)，74.007(G-2，73.8)，78.903(G-3，78.7)，71.246(G-4，71.1)，79.243(G-5，79.1)，62.347(G-6，62.2)。经上述综合的光谱分析和文献(Kazuyuki hidaka et al.Atriterpene and saponin from roots of Ilex pubescens，Phytochemistry 1987，26(7)：2023-2027)数据对比，确认单体I为毛冬青皂苷甲(Ilexsaponin A1 or Ilexsaponin A)，化学结构见图1。

单体II：FAB-MS(m/z)：789.38(M+Na)，1555.75(2M+Na)；HRMS(m/z)：789.4413(M+Na)，理论值：789.4401，分子式为C₄₁H₆₆O₁₃。¹H NMR(Py-d₆)δ：0.768(3H，s，24Me)，0.955(3H，s，26Me)，0.969(3H，s，25Me)，1.001(3H，d，30Me)，1.132(3H，s，23Me)，1.304(3H，s，29Me)，1.610(3H，s，27Me)，3.103(1H，d，3-H)，3.156(1H，d，18-H)，3.554(1H，t，X-1-H)，3.785(1H，brd，G-5-H)，5.214(1H，d，X-1-H)，5.420(1H，s，12-H)。¹³C NMR(Py-d₆)δ：38.792(C-1，38.8(文献值))，27.057(C-2，27.0)，88.800(C-3，88.9)，39.567(C-4，39.5)，55.922(C-5，55.9)，18.604(C-6，18.6)，33.546(C-7，33.5)，40.236(C-8，40.2)，47.723(C-9，47.7)，36.997(C-10，36.9)，24.880(C-11，24.8)，127.254(C-12，127.2)，139.456(C-13，139.5)，41.116(C-14，42.0)，29.224(C-15，29.2)，26.707(C-16，26.6)，47.904(C-17，47.8)，47.394(C-18，47.3)，73.434(C-19，73.4)，42.997(C-20，42.8)，23.956(C-21，23.9)，32.410(C-22，32.3)，28.109(C-23，28.0)，15.524(C-24，15.5)，16.108(C-25，16.1)，17.255(C-26，17.2)，24.360(C-27，24.3)，180.610(C-28，180.7)，29.808(C-29，29.8)，16.724(C-30，16.6)；3-O-Sugar：105.664(X-1，105.7)，83.225(X-2，82.8)，77.936(X-3，77.8)，71.628(X-4，71.5)，66.637(X-5，66.5)，106.004(G-1，105.8)，77.012(G-2，76.8)，78.202(G-3，78.1)，70.938(G-4，70.8)，77.936(G-5，77.8)，62.644(G-6，62.6)。经上述综合的光谱分析和文献(Kazuyuki hidaka et al.New triterpene saponins from Ilex pubescens，Chem.Pharm.Bull.198735(2)：524-529)数据对比，确认单体II为Ilexsaponin B1，化学结构见图2。

单体III：¹³C NMR(Py-d₆)δ：38.834(C-1，38.8(文献值))，26.754(C-2，26.8)，88.798(C-3，88.8)，39.584(C-4，39.6)，55.918(C-5，55.9)，18.678(C-6，18.7)，33.480(C-7，33.5)，40.426(C-8，40.3)，47.167(C-9，47.7)，36.991(C-10，36.9)，24.646(C-11，24.6)，127.637(C-12，127.5)，138.807(C-13，138.8)，42.094(C-14，42.1)，29.196(C-15，29.1)，26.754(C-16，26.7)，48.320(C-17，48.3)，47.167(C-18，47.1)，73.382(C-19，73.4)，42.792(C-20，42.6)，24.001(C-21，23.8)，31.842(C-22，31.7)，28.119(C-23，28.1)，15.660(C-24，15.6)，16.017(C-25，16.0)，17.457(C-26，17.4)，24.297(C-27，24.3)，177.002(C-28，177.1)，29.196(C-29，29.7)，16.707(C-30，16.7)；3-O-Sugar：106.056(X-1，105.8)，83.255(X-2，83.0)，77.977(X-3，77.5)，71.600(X-4，71.5)，66.671(X-5，66.7)，105.708(G-1，105.8)，77.082(G-2，76.9)，78.940(G-3，78.3)，70.955(G-4，70.9)，78.273(G-5，77.9)，62.614(G-6，62.6)；28-O-Sugar：95.789(G-1，95.7)，74.064(G-2，73.8)，79.751(G-3，78.7)，70.955(G-4，71.1)，79.205(G-5，79.1)，62.159(G-6，62.2)。经与文献数据对比，确认单体III为Ilexsaponin B3，化学结构见图2。

单体IV：¹H NMR(Py-d₆)δ：3.22(2H，m，8，8’-H)，3.80(6H，s，OCH₃x2)，3.83(3H，s，OCH₃’x2)，3.92(1H，m，G-3-H)，4.07(2H，m，9，9’-H)，4.25-4.40(7H，m，G-2，4，6，5.9，9’-H)，5.78(1H，dd，G-1)，6.94(2H，s，2，6-H)，6.97(2H，s，2’，6’-H)。¹³C NMR(Py-d₆)δ：138.42(C-1，133.6(文献值))，104.91(C-2，104.0)，154.00(C-3，152.5)，135.63(C-4，137.1)，154.00(C-5，152.5)，104.91(C-6，104.0)，86.54(C-7，85.2)，54.96(C-8，53.6)，72.27(C-9，71.2)，132.14(C-1’，131.2)，104.95(C-2’，103.5)，149.34(C-3’，147.8)，137.42(C-4’，134.7)，149.34(C-5’，147.8)，104.95(C-6’，103.5)，86.51(C-7’，85.0)，54.83(C-8’，53.5)，72.14(C-9’，71.1)，56.76(OMe’x2，56.3)，56.55(OMex2，55.9)，105.09(G-1，102.7)，76.09(G-2，74.0)，78.69(G-3，76.4)，71.69(G-4，69.8)，78.41(G-5，77.1)，62.69(G-6，60.8)。经¹H和¹³C NMR光谱测定分析和文献(Junei Kinjo et al.The first isolation of lignan tri-andtetra-glycosides.Chem.Pharm.Bull.1991，39(6)：1623-1625)比较，确定单体IV为丁香树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖甙，化学结构见图3。

从毛冬青提取物中分离得到皂甙单体Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1和IlexsaponinB3(结构见图1和2.)外，还分离获得了一个双环氧木脂素甙类成分丁香树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖甙(结构见图3.)，该成分因其有酚羟基结构，某些化学鉴别反应结果可与黄酮类相似。

                    实施例2毛冬青提取物的制备-1

取毛冬青饮片100kg，加30％乙醇500kg，加热回流提取3小时，第二次提取2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.06-1.07(70℃±10)，过一装有50kg大孔树脂水相层析柱，用300kg量的水洗涤，然后用200kg量的40％、60％和80％乙醇溶液梯度洗脱，收集40-60％乙醇流份，减压浓缩，真空干燥，得到浸膏粉约4.5kg。提取物中毛冬青总皂甙含量52％，Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1和Ilexsaponin B3的含量分别为5.1％、3.7％和4.3％，Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1和Ilexsaponin B3量比例为1∶0.73∶0.84。

                      实施例3毛冬青提取物的制备-2

取毛冬青饮片100kg，加5％乙醇1000kg，加热回流提取5小时，第二次提取2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.06-1.07(70℃±10)，过一装有50kg大孔树脂水相层析柱，用300kg量的水洗涤，然后用200kg量的40％、60％和80％乙醇溶液梯度洗脱，收集40-60％乙醇流份，减压浓缩，真空干燥，得到浸膏粉约4.3kg。提取物中毛冬青总皂甙含量51％，Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1和Ilexsaponin B3的含量分别为4.4％、5.9％和6.5％，Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1和Ilexsaponin B3量比例为1∶1.3∶1.5。

                       实施例4毛冬青提取物的制备-3

取毛冬青饮片100kg，加50％乙醇800kg，加热回流提取1小时，第二次提取2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.06-1.07(70℃±10)，过一装有50kg大孔树脂水相层析柱，用300kg量的水洗涤，然后用200kg量的40％、60％和80％乙醇溶液梯度洗脱，收集40-60％乙醇流份，减压浓缩，真空干燥，得到浸膏粉约4.2kg。提取物中毛冬青总皂甙含量53％，Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1和Ilexsaponin B3的含量分别为4.1％、5.8％和3.8％，Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1和Ilexsaponin B3量比例为1∶1.4∶0.9。

                        实施例5毛冬青提取物的制备-4

取毛冬青饮片100kg，加20％乙醇500kg，加热回流提取3小时，第二次提取2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.06-1.07(70℃±10)，过一装有50kg大孔树脂水相层析柱，用300kg量的水洗涤，然后用200kg量的40％、60％和80％乙醇溶液梯度洗脱，收集40-60％乙醇流份，减压浓缩，真空干燥，得到浸膏粉约4.7kg。提取物中毛冬青总皂甙含量52％，Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1和Ilexsaponin B3的含量分别为5.1％、4.7％和5.4％，Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1和Ilexsaponin B3量比例为1∶0.9∶1.1。

                        实施例6毛冬青颗粒剂的制备

取实施例2制备的提取物2kg，过80目筛网，加等量糊精，充分混和，置干法制粒机挤压成条，然后破碎制粒，整粒，得到质地脆硬的淡棕色颗粒，分装成袋，每袋净重0.5g，相当生药5g。

                        实施例7毛冬青片的制备

取实施例2制备的提取物2kg，过80目筛网，加入预胶化淀粉、微晶纤维素、羟丙基纤维素各500、1200、和300g，充分混和，湿法制粒，干燥后加入适量的硬脂酸镁和胶态二氧化碳，充分混和，压制成片，每片重0.5克/片，相当生药4.5g。

                     实施例8毛冬青胶囊的制备

取实施例2制备的提取物2kg，过80目筛网，加入1.5kg淀粉，充分混和，湿法制粒，干燥后加入适量的硬脂酸镁和胶态二氧化碳，充分混和，装填胶囊，每粒内重0.5g，相当生药4.5g。

                     实施例9毛冬青粉针剂的制备

取实施例2制得的浸膏粉，加5倍量水溶解，然后用一半体积的正丁醇萃取三次，合并萃取液浓缩并干燥。取该纯化浸膏粉500g(总皂甙含量80％)，加葡萄糖500g，用8000ml灭菌水溶解，灭菌过滤，分装至小瓶内，每瓶4ml，然后冷冻干燥，密封即得。每瓶粉针的总固物0.5g，其中提取物量为250mg。

                 实施例10提取物及其制剂的TLC鉴别试验

取实施例2-5制得的毛冬青提取物及实施例6-9的制剂适量，用甲醇制成每1ml含相当于提取物5mg的溶液，作为供试品溶液。另取Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1和IlexsaponinB3对照品，加甲醇制成每1ml含1mg溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述四种溶液各1-2ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。所有供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

                        实施例11药理试验

1.毛冬青提取物对成年雄性大鼠交配的影响

1.1实验药物

毛冬青提取物(实施例2制备)：给药前置研钵中研细，加0.25％CMC蒸馏水研磨，配制成混悬液，备用。苯甲酸雌二醇注射液：上海第九制药厂生产，批号991101。黄体酮注射液：上海第九制药厂生产，批号2000703。丙酸睾酮注射液：上海第九制药厂生产，批号2000601。注射用青霉素钠：华北制药股份有限公司，批号U0104018。

1.2实验动物

SD大鼠，雌雄各半，SPF级。雄性大鼠体重250±10g，雌性大鼠体重190±10g。由中外合资上海西普尔-必凯实验动物有限公司供应，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2003-0002。饲养环境：室温：25±0.5℃，相对湿度：60-70％，照度：150-200Lux，12小时明暗交替。雄鼠每笼饲养1只。

1.3实验方法

1.3.1雌性大鼠准备

50只雌性大鼠在乙醚麻醉下，行双侧卵巢切除术。术后肌注青霉素钠2万U.kg^-1，每日1次，共3天。卵巢切除约4周后进行实验。实验前48小时每只皮下注射苯甲酸雌二醇20μg，实验前4小时每只皮下注射黄体酮注射液500μg。

1.3.2雄性大鼠准备

50只雄性大鼠按体重随机分组，每组10只。分成空白对照和毛冬青(低、中、高)、丙酸睾酮组，共5组。前4组每天灌胃给予CMC混悬液或药物1次，每次5ml.kg^-1，连续21天；后1组于第19和20天，皮下注射丙酸睾酮1次(1ml.kg^-1)。

1.3.3实验条件：所有实验动物在实验前一星期开始，通过控制灯光调整动物的时差，使其能够适应环境，即：6:00-18:00日光灯照明；18:00-6:00红灯照明。实验观察时全部采用红色灯光(没有其它光线照明)，禁声。笼舍大小：55×35×20cm。

1.3.4观察指标和数据处理

扑捉潜伏期：自雌鼠投入至雄鼠第一次跨骑行为的时间；扑捉次数：雌鼠投入20分钟内雄鼠扑捉雌鼠的次数；射精潜伏期：自雌鼠投入至雄鼠第一次射精(以跨骑雌鼠后舔自身生殖器为标志)的时间；射精次数：雌鼠投入20分钟内雄鼠跨骑雌鼠后，舔自身生殖器次数。各组间作方差分析，并进一步作Student-t检验。

1.4实验结果

雌雄大鼠经处理或给药，于第21天晚合笼进行实验观察。表1.显示，与空白对照组比较，各给药组的扑捉潜伏期有不同程度地缩短；扑捉次数明显或显著性增加；射精潜伏期显著性缩短；射精次数明显或显著性增加。提示毛冬青提取物可提高成年雄性SD大鼠的性欲，增强大鼠的交配能力。

表1.毛冬青提取物对大鼠交配的影响(mean±SD，N＝10)

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

2.对大鼠实验性血栓形成的影响

2.1实验药物

毛冬青提取物(实施例2制备)：同前；戊巴比妥钠：广州南方化玻公司进口分装(批号：20040303)实验前用生理盐水溶解，稀释至2％浓度备用；肝素钠注射液：常州生化千红制药有限公司产品，规格为12500单位/2ml/支，试验前用生理盐水稀释至每毫升5单位，备用；阿司匹林：阿斯特拉制药有限公司产品(批号：97043005)，临用前以0.25％CMC蒸馏水配制成2％浓度混悬液，备用。

2.2实验动物

SD雄性大鼠，来源同前。雄性大鼠体重280±10g。

2.3实验方法

取50只雄性大鼠，按体重和性别随机分成毛冬青(低、中、高)、空白对照(CMC)和阿司匹林组，共5组，每组10只。每天灌胃给予药物或CMC混悬液1次，每次5ml.kg^-1，连续14天。末次给药1h后，ip戊巴比妥钠40mg.kg^-1麻醉，手术暴露右侧颈外静脉和左侧颈总动脉，于动静脉近心端插入事先准备好的体外导流管，固定。该导流管由3段管体组成，两端细管用硬膜外导管制成，每段长7cm，内径1mm；中段采用硅胶管，长7cm，内置5cm长7^#手术丝线(5.0±0.1mg)；三段管体连接后，管内注满经稀释后肝素溶液。开放动脉夹后，血液从左颈总动脉经该导管后进入右颈外静脉；15min后断流，立即取出中段管中丝线，精密称重，计算血栓重量(血栓重量＝丝线湿重-丝线原重)。数据处理，t检验。

2.4实验结果

表2.显示，大鼠给与高、中、低剂量毛冬青提取物后，体外血栓明显减少，与空白对照组比较，差异显著(P＜0.05)。提示毛冬青提取物可抑制大鼠体外血栓的形成。表2.毛冬青提取物对大鼠体外血栓形成的影响

注：与空白对照组比较，*P＜0.05

3.对大鼠中动脉栓塞再灌注损伤的影响

3.1实验药物

毛冬青提取物(实施例2制备)：同前；水合氯醛(AR)：上海化学试剂公司生产，用生理盐水配制成10％浓度备用。

3.2实验动物

SD雄性大鼠，来源同前。雄性大鼠体重260-280g。

3.3实验方法

取60只雄性大鼠，按体重随机分成空白对照、假手术和毛冬青低、中、高剂量组5组，每组12只。给药组，每日灌胃毛冬青提取物一次，连续9天。假手术组和造型组给等体积CMC。第10天给药前，以水合氯醛350mg.kg^-1，ip麻醉，仰卧固定，颈正中切开皮肤，依次暴露右颈总、颈外、颈内动脉，结扎颈总动脉向心端和颈外动脉，在颈内动脉下前穿线备用，夹闭颈内动脉远心端，在穿线后方剪一切口，向切口内插入一根带圆头的尼龙线，(线长5cm，直径0.25mm，先端烫成圆头，圆头直径约0.4mm，距圆头17.5mm处作一黑色记号)抽紧颈内动脉处备用线，开放颈内动脉上动脉夹，将尼龙线缓缓插入颈内动脉，至黑色记号到达颈内动脉分叉处，有轻微阻力为止，扎紧备用线。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露右颈总、颈外、颈内动脉，不闭塞大脑中动脉。术后严格控制室温至25-25℃，大鼠体温维持在36.5-37.5℃。闭塞中动脉2h后，将线栓拉回至颈内动脉，使血液再灌注中动脉。逐层缝合创口。造模1h后，灌胃给药一次。

24h后断头取脑，称量手术侧(右侧)半脑湿重。置烘箱中，110℃烘烤24h至恒重，精确称量干重，计算脑含水百分比。[脑组织含水量(％)＝(湿重-干重)×100/湿重]

3.4实验结果

表3.显示，与假手术组比较，造型组大鼠脑含水量显著增高(P＜0.05)；大鼠给予高、中、低剂量毛冬青提取物后，脑组织含水量均不同程度降低，与造型组比较，高剂量组差异显著(P＜0.05)。提示毛冬青提取物可抑制大鼠实验性中动脉栓塞再灌注损伤，减轻由此引起的脑水肿。

表3.毛冬青提取物对大鼠中动脉栓塞再灌注损伤的影响

注：与造型组比较，*P＜0.05；与假手术组比较，##P＜0.01

Claims (9)

1.一种毛冬青提取物的制备方法，包括下列步骤：

a.用5-10倍药材重量倍数的体积百分比浓度为20％-30％的乙醇水溶液，回流提取2次，每次1-5小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.06-1.07的浓缩液，静置，取上清液供上大孔树脂柱纯化处理；

b.取上述浓缩液的上清液过一装有大孔树脂的水相层析柱，经3-6BV量的水洗涤，用1-4BV量的20％-80％乙醇水溶液梯度洗脱，收集40-60％乙醇流份，减压浓缩，真空干燥，得到浸膏粉；

所述提取物中，毛冬青总皂甙以Ilexsaponin B1为对照的分光光度法测，重量百分含量不低于50％，Ilexsaponin A1的重量百分含量不低于4.0％，Ilexsaponin B1的重量百分含量为2.5～7.5％，Ilexsaponin B3的重量百分含量为3.0～8.0％。

2.如权利要求1所述毛冬青提取物的制备方法，其特征在于，步骤b中，所述大孔树脂的装量为药材重量的1/2-1/4；所述20％-80％乙醇水溶液为20％、40％、60％和80％的乙醇水溶液。

3.一种毛冬青提取物，其特征在于，所述毛冬青提取物由权利要求1-3任一权利要求所述方法制得。

4.如权利要求3所述毛冬青提取物，其特征在于，所述毛冬青提取物中，Ilexsaponin A1、Ilexsaponin B1和Ilexsaponin B3重量比例为1∶(0.6～1.9)∶(0.7～2.0)。

5.一种毛冬青制剂，含有权利要求3或4所述毛冬青提取物与药用辅料，其中，毛冬青提取物与药用辅料的重量比为(4～8)∶(6～2)。

6.如权利要求5所述毛冬青制剂，其特征在于，毛冬青提取物与药用辅料的重量比(3-4)∶3。

7.如权利要求5所述毛冬青制剂，其特征在于，所述毛冬青制剂的制剂类型选自颗粒剂、片剂、胶囊、软胶囊、干糖浆、滴丸、注射液或冻干粉针剂。

8.如权利要求7所述毛冬青制剂，其特征在于，所述片剂为速释片剂或缓释片剂；所述胶囊为缓释胶囊。

9.如权利要求8所述毛冬青制剂，其特征在于，所述药用辅料选自：淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、低取代羟丙纤维素、羧甲基淀粉纳、乙基纤维素、聚乙二醇、丙二醇、大豆油、卵磷脂、蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘氨酸、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、滑石粉、可溶性淀粉、麦芽糊精、微粉硅胶或矫味剂中的一种或多种。

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