CN103110673B - 一种抗菌毛冬青三萜总皂苷及其应用 - Google Patents
一种抗菌毛冬青三萜总皂苷及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种毛冬青三萜总皂苷及其在制备治疗口腔疾病药物方面的应用。该毛冬青三萜总皂苷由原料毛冬青根茎或叶制备，含有冬青素的重量百分含量为20%～50%。本发明毛冬青三萜总皂苷制备过程简单，制得的产品抑菌效果好，可以作为治疗口腔疾病药物的组要成分进行进一步研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种毛冬青三萜总皂苷及其应用，具体涉及一种具有较佳抗菌效果的毛冬青三萜总皂苷。
背景技术
牙周病和龋病都是以细菌感染为主的多因素影响下的进行性、破坏性疾病。与牙周病和龋病发生发展密切相关的细菌被称为牙周致病菌和致龋菌。牙菌斑中绝大多数细菌为口腔正常菌丛，仅少数细菌与牙周病的发生、发展密切相关。在各型牙周病的病损区，常可分离出一种或几种优势菌，它们具有显著的毒力或致病性，能通过多种机制干扰宿主防御能力，具有引发牙周破坏的潜能，称之为牙周致病菌。重要的牙周致病菌包括：伴放线放线杆菌（Aa）、牙龈卟啉单胞菌(Pg)、福赛坦氏菌(Tf)、具核梭杆菌(Fn)、中间普氏菌(Pi)和变黑普氏菌(Pn)、黏放线菌(Av) 以及齿垢密螺旋体（Td）。其中具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum ATCC 25175，以下简称Fn),是一种专性厌氧杆菌, 常可在眼上、下的菌斑、牙周病灶以及感染根管、尖周病灶中检测到, 近年来对Fn的研究逐渐深入, 一些现象也得到了解释, 同时也渐渐显露出它在尖周病、尤其是牙周病中的重要性。过去一直把该菌视为人体的正常菌群之一, 近年来, 由于从临床标本中不断分离出该菌, 引起国内外学者的关注, 被视为临床上不可忽视的细菌。大量研究证实该菌为条件致病菌, 且具有较强的致病力, 在口腔乃至全身感染性疾病中检出率极高, 广泛存在于感染的牙髓、牙周和其他炎症性病灶中。作为优势菌种,与临床厌氧菌感染的关系十分密切。
而龋病是世界卫生组织提出的人类应重点防治的三大非传染性疾病之一。导致龋病与龋齿的细菌为致龋菌。细菌在龋齿发生和发展过程中起着主导作用。近年来国际上公认的致龋菌种类很多，最主要的是某些变形链球菌和乳酸杆菌。多年的研究已经证实，变形链球菌（S.mutansATCC 25175，以下简称Sm），是人类龋病的始发因素，是目前公认的最重要的致龋菌，其在唾液和菌斑中的水平与龋的发生有高度的正相关关系。变形链球菌是牙菌斑早期定植菌, 因能快速发酵大多数碳水化合物, 产生以乳酸为主的酸性产物, 且可以产生葡萄糖基转移酶, 合成不溶性葡聚糖, 与其表面的脂磷壁酸等构成牙菌斑的骨架, 有利于其他附着力低的细菌在牙面的定植, 在实验动物变型链球菌能诱发龋齿, 目前被公认为龋病的主要致病菌。
毛冬青为冬青科（Aquifoliaceae）冬青属植物Ilex pubescens Hook. et Arn.，别名乌尾丁、六月霜、细叶冬青、山冬青、毛披树、水火药、火烙木等。生于山野坡地、丘陵等灌木丛中。主产广东、广西、福建、江西等地。毛冬青作为中药使用历史悠久，曾收载于1977年版《中国药典》。毛冬青的制剂毛冬青注射剂和毛冬青片剂曾被收载于中药部颁标准，为心血管疾病用药，有扩张血管及抗菌消炎作用。用于冠状动脉硬化性心脏病，血栓闭塞性脉管炎，并用于中心性视网膜炎，小儿肺炎。目前尚未有对其进行口腔抗菌方面的研究。
发明内容
本发明的目的是为了寻求抑制口腔细菌的新药物。
为了达到上述目的，本发明提供了一种毛冬青三萜总皂苷，该毛冬青三萜总皂苷由原料毛冬青根茎或叶制备，含有冬青素的重量百分含量为20%～50%。通过以下步骤制备：
（1）提取：取毛冬青根茎或叶，采用50%～70%乙醇提取，过滤，取滤液；
（2）沉淀：取步骤（1）中制得的滤液，回收20%～80%的溶剂，静置沉淀，过滤，得沉淀A和滤液B备用；
（3）粗制：取步骤（2）中的沉淀A即为所述毛冬青三萜总皂苷；或取步骤（2）中的滤液B采用大孔吸附树脂洗脱，洗脱剂分别采用20%～30%乙醇溶液、50%～90%乙醇溶液进行梯度洗脱（优选洗脱梯度为30%乙醇和70%乙醇），收集50%～90%乙醇溶液，浓缩干燥得粗提物C即为所述毛冬青三萜总皂苷。
或将步骤（3）中的沉淀A和粗提物C混合，即得所述毛冬青三萜总皂苷。
或将步骤（3）中的沉淀A和粗提物C混合，进行硅胶柱层析，洗脱剂分别采用体积比为30:1～20:1的氯仿-甲醇混合液、10:1～5:1的氯仿-甲醇混合液进行梯度洗脱（优选洗脱梯度为30:1的氯仿-甲醇混合液和10:1的氯仿-甲醇混合液），收集体积比为10:1～5:1的氯仿-甲醇混合液，浓缩干燥即为所述毛冬青三萜总皂苷。
其中，步骤（1）中提取时乙醇与毛冬青根茎或叶的体积重量比为1～10L/kg，提取温度为50～81℃，提取时间为1～5h。
本发明还提供了上述毛冬青三萜总皂苷在制备治疗口腔疾病药物方面的应用
本发明相比现有技术具有以下优点：通过对毛冬青三萜总皂苷进行适当纯化，能够有效提高其对口腔细菌的抑制效果。本发明通过较少的精制步骤，提高了具有抑菌作用的有效成分的含量，在尽可能节省成本的同时，增强了抑菌效果。本发明毛冬青三萜总皂苷制备过程简单，制得的产品抑菌效果好，可以作为治疗口腔疾病药物的组要成分进行进一步研究。
附图说明
图1所示为待测活性物质添加和梯度稀释的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
对比实施例一
取毛冬青根茎1kg，采用50%乙醇1 L在50℃下提取1h，过滤；取滤液，浓缩干燥，得毛冬青总皂苷300g，其中含冬青素重量百分含量为10%。
实施例一
（1）提取和沉淀：取毛冬青根茎1kg，采用70%乙醇3 L保持微沸热回流提取3h，过滤；取滤液，回收80%溶剂，静置沉淀，过滤，沉淀为粗提物A，滤液B备用；粗提物A的重量为255g，其中含冬青素重量百分含量为20%。
（2）大孔树脂粗制：将步骤（1）中的滤液B采用大孔吸附树脂洗脱，洗脱剂分别采用30%乙醇溶液、70%乙醇溶液进行梯度洗脱，收集70%乙醇洗脱液，浓缩干燥得粗提物C；粗提物C的重量为158g，其中含冬青素重量百分含量为30%。
（3）硅胶柱层析精制：将步骤（1）中制备的粗提物A和步骤（2）中制备的粗提物C混合，进行硅胶柱层析，洗脱剂分别采用体积比为30:1的氯仿-甲醇混合液和10:1的氯仿-甲醇混合液进行梯度洗脱，收集体积比为10:1的氯仿-甲醇混合液，浓缩干燥即得毛冬青三萜总皂苷196.8g，其中冬青素的含量（w/w）为50%。
实施例二
（1）提取：取毛冬青根茎1kg，采用60%乙醇10L在60℃下提取5h，过滤；取滤液，回收20%溶剂，静置沉淀，过滤，沉淀为粗提物A，滤液B备用；
（2）大孔树脂粗制：将步骤（1）中的滤液B采用大孔吸附树脂洗脱，洗脱剂分别采用20%乙醇溶液、50%乙醇溶液进行梯度洗脱，收集50%乙醇洗脱液，浓缩干燥得粗提物C；
（3）硅胶柱层析精制：将步骤（1）中制备的粗提物A和步骤（2）中制备的粗提物C混合，进行硅胶柱层析，洗脱剂分别采用体积比为20:1的氯仿-甲醇混合液、5:1的氯仿-甲醇混合液进行梯度洗脱，收集体积比为5:1的氯仿-甲醇混合液，浓缩干燥即得毛冬青三萜总皂苷211g，其中冬青素的含量（w/w）为41%。
对比实施例二
取毛冬青叶1kg，采用50%乙醇1 L在50℃下提取1h，过滤；取滤液，浓缩干燥，得毛冬青总皂苷172g，其中含冬青素重量百分含量为5.3%。
实施例三
（1）提取和沉淀：取毛冬青叶1kg，采用70%乙醇3 L保持微沸热回流提取3h，过滤；取滤液，回收80%溶剂，静置沉淀，过滤，沉淀为粗提物A，滤液B备用。
（2）大孔树脂粗制：将步骤（1）中的滤液B采用大孔吸附树脂洗脱，洗脱剂分别采用30%乙醇溶液、70%乙醇溶液进行梯度洗脱，收集70%乙醇洗脱液，浓缩干燥得粗提物C。
（3）硅胶柱层析精制：将步骤（1）中制备的粗提物A和步骤（2）中制备的粗提物C混合，进行硅胶柱层析，洗脱剂分别采用体积比为30:1的氯仿-甲醇混合液和10:1的氯仿-甲醇混合液进行梯度洗脱，收集体积比为10:1的氯仿-甲醇混合液，浓缩干燥即得毛冬青三萜总皂苷193g，其中冬青素的含量（w/w）为37%。
实施例四
（1）提取和沉淀：取毛冬青叶1kg，采用60%乙醇10L在60℃下提取5h，过滤；取滤液，回收50%溶剂，静置沉淀，过滤，沉淀为粗提物A，滤液B备用；
（2）大孔树脂粗制：将步骤（1）中的滤液B采用大孔吸附树脂洗脱，洗脱剂分别采用20%乙醇溶液、50%乙醇溶液进行梯度洗脱，收集50%乙醇洗脱液，浓缩干燥得粗提物C；
（3）硅胶柱层析精制：将步骤（1）中制备的粗提物A和步骤（2）中制备的粗提物C混合，进行硅胶柱层析，洗脱剂分别采用体积比为20:1的氯仿-甲醇混合液、5:1的氯仿-甲醇混合液进行梯度洗脱，收集体积比为5:1的氯仿-甲醇混合液，浓缩干燥即得毛冬青三萜总皂苷148g，其中冬青素的含量（w/w）为32%。
应用实施例
分别取实施例一至四、对比实施例一和二中的制备的毛冬青三萜总皂苷和实施例一中的粗提物A、C进行抗菌测试，受试菌采用S. mutans ATCC 25175 （以下简称Sm）和 F. nucleatum ATCC 10953 （以下简称Fn），实验流程依据《RDP-07-003：活性物质最低抗菌浓度测定操作作业指导书》。
1、待测药物的配制、添加和2倍梯度稀释
1.1按照图1中的指示用多通道的移液器将已经灭菌处理的生长培养基添加至已灭菌或消毒的96孔平底板中，每个孔添加100μL培养基。
1.2 以DMSO（二甲基亚砜）作为溶剂（Solvent）配制1%（w/v）的待测活性物质溶液（Active solution），以1%的玉洁纯 (Triclosan)的DMSO(二甲基亚砜)溶液作为试验的阳性对照（Positive control）。
1.3 用已经灭菌处理的相应的生长培养基稀释每一个待测的活性物质溶液、阳性对照和用于配制待测活性物质的溶剂（溶剂作为试验的阴性对照——Negative control）。
1.4 第1和第8行的第1个（A1 & H1）孔分别添加160μL经过稀释的阳性和阴性对照溶液；经过稀释的活性物质则按照标记好的顺序添加40μL到B1&G1孔中；在第2列到第12列的孔中，每孔添加100μL的相应培养基。
1.5 经步骤1.4后，在第1列的每个孔中均已有200μL的溶液，用一支8通道移液器缓慢地吸打溶液，以混匀第1列中每一个孔中的溶液，混匀后（反复吸打5-6次），用8通道移液器从第1列的孔中转移100μL溶液到第2列的孔中，然后继续用8通道移液器混匀第2列孔中的溶液，混匀后，再转移100μL到第3列孔中，这个操作需不断重复直至全部12列孔中的溶液都混匀，这样第12列的孔中有200μL溶液，最后用8通道移液器从第12列的孔中转移出100μL溶液并弃掉。得到了一系列经2倍稀释含不同浓度的活性物质溶液和阴阳性对照溶液。
2、待测菌液的准备和添加
2.1将经过培养的细菌用相应的已经高温高压灭菌的液体培养基稀释，将细菌的菌液密度调节到1.0×108 CFU/mL，在本实验室中，是用ELx808酶标仪检测调节的结果。吸取300μL经过调节的菌悬液到洁净的96孔平底板中，然后置于 ELx808酶标仪中于630nm波长处检测，当菌液的吸光值（A）约为0.5时则表明菌液浓度达到1.0×108 CFU/mL。
2.2 用12通道移液器将调节好浓度的菌悬液添加到已经添加了待测活性物质溶液的96孔板中，阴性对照溶液和阳性对照溶液的96孔板中，每孔均添加100μL调节好浓度的菌悬液。此时96孔板中的每个孔中应均有200μL溶液。然后将96孔板置于合适的培养箱中培养，S.mutans是兼性厌氧菌置于CO2培养箱中培养， F.nucleatum是专性厌氧菌则需置于厌氧培养箱或厌氧培养盒中培养。培养温度均为37℃，培养24h。
3、读取实验结果
3.1 通常培养24小时后，就可以比较明显地观察到细菌的生长/没生长的情况。如果凭肉眼都可以观察到有无生长的区别，则就可以将96孔板从培养箱中取出，置于室温中平衡一段时间让其回复到室温（以防冷凝水聚集在96孔板的底部影响实验结果的读取）。
3.2将96孔板置于ELx808酶标仪酶标仪中，盖上酶标仪盖子后，启动ELx808酶标仪，读取96孔板上的数据，结果如下表2和下表3所示。
表2 各活性物质对Sm的最低抑菌浓度（MIC, ppm）
| 活性物质 | 对比实施例一产品 | 实施例一产品 | 实施例二产品 | 对比实施例二产品 | 实施例三产品 | 实施例四产品 | 实施例一粗提取A | 实施例一粗提物C | 冬青素 | 玉洁纯 |
| MIC | 17.2 | 12.5 | 14.3 | 25.3 | 14.7 | 15.4 | 16.1 | 15.8 | 7.8 | 5.3 |
表3 各活性物质对Fn的最低抑菌浓度（MIC,ppm）
| 活性物质 | 对比实施例一产品 | 实施例一产品 | 实施例二产品 | 对比实施例二产品 | 实施例三产品 | 实施例四产品 | 实施例一粗提取A | 实施例一粗提物C | 冬青素 | 玉洁纯 |
| MIC | 499 | 456 | 478 | ＞500 | 480 | 495 | 498 | 486 | 398 | 28.1 |
从表2、表3中可以看出，测试的各活性物质均具有较好的抑菌效果，以实施例一至四中制备的毛冬青三萜总皂苷的抑菌效果最佳，且对Sm具有更强的抑菌效果。
Claims (4)
1.一种抗菌毛冬青三萜总皂苷，所述毛冬青三萜总皂苷由原料毛冬青根茎或叶制备；其特征在于：所述毛冬青三萜总皂苷中冬青素的重量百分含量为20%～50%；所述毛冬青三萜总皂苷的制备工艺包括以下步骤：（1）提取：取毛冬青根茎或叶，采用50%～70%乙醇提取，过滤，取滤液；（2）沉淀：取步骤（1）中制得的滤液，回收20%～80%的溶剂，静置沉淀，过滤，得沉淀A和滤液B备用；（3）粗制：取步骤（2）中的滤液B采用大孔吸附树脂洗脱，洗脱剂分别采用20%～30%乙醇溶液、50%～90%乙醇溶液进行梯度洗脱，收集50%～90%乙醇溶液，浓缩干燥得粗提物C；将沉淀A和粗提物C混合，进行硅胶柱层析，洗脱剂分别采用体积比为30:1～20:1的氯仿-甲醇混合液、10:1～5:1的氯仿-甲醇混合液进行梯度洗脱，收集体积比为10:1～5:1的氯仿-甲醇混合液，浓缩干燥即为所述毛冬青三萜总皂苷。
2.根据权利要求1所述的毛冬青三萜总皂苷，其特征在于：所述步骤（3）中大孔吸附树脂洗脱的洗脱剂分别采用30%乙醇溶液和70%乙醇溶液进行梯度洗脱。
3.根据权利要求1或2所述的毛冬青三萜总皂苷，其特征在于：所述硅胶柱层析的洗脱剂分别采用30:1的氯仿-甲醇混合液和10:1的氯仿-甲醇混合液进行梯度洗脱。
4.权利要求1至3任一所述的毛冬青三萜总皂苷在制备治疗口腔疾病药物方面的应用。
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