CN105640969A

CN105640969A - 毛冬青次皂苷的抗菌用途

Info

Publication number: CN105640969A
Application number: CN201410627121.9A
Authority: CN
Inventors: 林丽萍; 吕晔
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2014-11-10
Filing date: 2014-11-10
Publication date: 2016-06-08

Abstract

？本发明公开了一种乌苏烷型五环三萜类化合物毛冬青次皂苷作为活性成分应用于预防和治疗口腔菌引发的相关疾病的用途。毛冬青次皂苷对变形链球菌，伴放线放线杆菌，牙龈卟啉单胞菌尤其是具核梭杆菌具有显著的抑制效果。毛冬青次皂苷作为抗菌活性成分，具有毒性小、疗效好和广谱性的特点，本发明利用毛冬青次皂苷的抗菌性，能够制备治疗口腔疾病的药物；同时制备成本低，提取工艺简单，特别有利于环境保护。

Description

毛冬青次皂苷的抗菌用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种天然化合物毛冬青次皂苷作为活性成分制备抑菌剂的用途。

背景技术

细菌感染在世界范围内无时无刻不存在，并且感染发生的频率呈现上升趋势，危害极其严重。目前防治仍以化学抗菌剂为主要控制措施。由于长期使用化学抗菌剂防治，导致细菌对硝基咪唑类，头孢类，b-内酰胺类，林可霉素类，红霉素，氯霉素以及四环素等多种抗菌剂产生了不同程度的耐药性，防治效果显著降低，使得医生不得不加大用药剂量以及通过联合用药等方法来提高治疗效果，但是又进一步增大了细菌抗药性的能力，使得人类面临着无药可用的危险。因此，探索高效、安全、广谱且环境友好型绿色抗菌剂显得尤为重要。

毛冬青次皂苷，英文名称prosapogeninA，分子式C₃₅H₅₆O₈，分子量604.40，化学名称(1S,2R,4aS,6aS,6bR,9S,10S,12aR)-1-hydroxy-9-(hydroxymethyl)-1,2,6a,6b,9,12a-hexamethyl-10-((2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-yl)-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-icosahydropicene-4a-carboxylicacid。

毛冬青次皂苷溶于甲醇，吡啶等有机溶剂。研究发现毛冬青次皂苷具有显著的抗血小板聚集活性，然而迄今为止未见毛冬青次皂苷作为抗菌剂在医学上应用的相关文献或报道。

发明内容

本发明的目的是探索毛冬青次皂苷作为活性成分在制备抑菌剂中的应用。

本发明通过大量研究证明，毛冬青次皂苷作为活性成分制备得到的抑菌剂具有很好的抑菌效果，可用于防治各种类型的细菌感染，特别是用于防治需氧菌、厌氧菌和兼性厌氧菌的感染。所述的需氧菌优选变形链球菌；所述的厌氧菌优选具核梭杆菌；所述的兼性厌氧菌优选伴放线放线杆菌。

毛冬青次皂苷是从天然植物中分离纯化获得，其作为活性成分和各种赋形剂配制成制药工业上允许的任意一种剂型。毛冬青次皂苷还可以和其他抗菌剂，增溶剂、助溶剂和赋形剂混合制成制药上允许的任意一种剂型。所述的剂型可以是外用的乳剂、软膏、搽剂、喷雾剂以及内服的片剂、胶囊、注射剂等。所述的其他药物为硝基咪唑类，头孢类，b-内酰胺类，林可霉素类，红霉素，氯霉素以及四环素等。所用的增溶剂可以是吐温类、司盘类、十二烷基硫酸钠等；助溶剂可以是乙醇、丙二醇、聚乙二醇、甘油等。赋形剂可以是二氧化硅、硬脂酸镁、乳糖、淀粉、阿拉伯胶等。本发明所述的毛冬青次皂苷可从冬青科植物特别是毛冬青中分离纯化得到，经HPLC峰面积归一化法测定纯度达98%以上。

与现有技术比较本发明的有益效果：毛冬青次皂苷作为抑菌剂具有广谱抗菌活性，抑菌时间短，持续时间长，是医药行业中理想的抑菌剂。与一般化学抑菌剂相比，对细菌具有广谱、效果显著，而且来源于天然植物毛冬青的提取物，具有安全无毒的特点，更有利于人类健康。

附图说明

附图是毛冬青次皂苷的结构图。

具体实施方式

以下通过选取具有代表性的细菌对本发明抑菌剂的抑菌效果做进一步说明：

实施例1毛冬青次皂苷作为活性成分对细菌感染的防治

受试菌采用从国家标准菌株中心CMCC采购的0代标准冻干菌株，先进行菌株的复苏，复苏至2代，然后进行斜面接种即得下一代菌株。再将斜面菌株接种到平板中进行培养活化（厌氧菌需放入二氧化碳培养箱中进行培养）。准确称取毛冬青次皂苷（从冬青科植物毛冬青中分离纯化得到，经HPLC峰面积归一化法测定纯度达98%以上）。

1、待测药物的配制、添加和2倍梯度稀释

1.1按照表1中的指示用多通道的移液器将已经灭菌处理的生长培养基添加至已灭菌或消毒的96孔平底板中，每个孔添加100μL培养基。

1.2以DMSO（二甲基亚砜）作为溶剂（Solvent）配制1%（w/v）的待测活性物质溶液（Activesolution），以同等浓度的冬青素(IlexgeninA)的DMSO(二甲基亚砜)溶液作为试验的阳性对照（Positivecontrol）。

1.3用已经灭菌处理的相应的生长培养基稀释每一个待测的活性物质溶液、阳性对照和用于配制待测活性物质的溶剂（溶剂作为试验的阴性对照——Negativecontrol）。

1.4第1和第8行的第1个（A1&H1）孔分别添加160μL经过稀释的阳性和阴性对照溶液；经过稀释的活性物质则按照标记好的顺序添加40μL到B1&G1孔中；在第2列到第12列的孔中，每孔添加100μL的相应培养基。

1.5经步骤1.4后，在第1列的每个孔中均已有200μL的溶液，用一支8通道移液器缓慢地吸打溶液，以混匀第1列中每一个孔中的溶液，混匀后（反复吸打5-6次），用8通道移液器从第1列的孔中转移100μL溶液到第2列的孔中，然后继续用8通道移液器混匀第2列孔中的溶液，混匀后，再转移100μL到第3列孔中，这个操作需不断重复直至全部12列孔中的溶液都混匀，这样第12列的孔中有200μL溶液，最后用8通道移液器从第12列的孔中转移出100μL溶液并弃掉。得到了一系列经2倍稀释含不同浓度的活性物质溶液和阴阳性对照溶液。

表1待测活性物质添加和梯度稀释的流程

2、待测菌液的准备和添加

2.1将经过培养的细菌用相应的已经高温高压灭菌的液体培养基稀释，将细菌的菌液密度调节到1.0×10⁸CFU/mL，在本实验室中，是用ELx808酶标仪检测调节的结果。吸取300μL经过调节的菌悬液到洁净的96孔平底板中，然后置于ELx808酶标仪中于630nm波长处检测，当菌液的吸光值（A）约为0.5时则表明菌液浓度达到1.0×10⁸CFU/mL。

2.2用12通道移液器将调节好浓度的菌悬液添加到已经添加了待测活性物质溶液的96孔板中，阴性对照溶液和阳性对照溶液的96孔板中，每孔均添加100μL调节好浓度的菌悬液。此时96孔板中的每个孔中应均有200μL溶液。然后将96孔板置于合适的培养箱中培养，需氧菌为变形链球菌；所述的厌氧菌为牙龈卟啉单胞菌及具核梭杆菌；所述的兼性厌氧菌为伴放线放线杆菌。

S.mutans是需氧菌，置于细菌培养箱中培养，伴放线放线杆菌(A.actinomycetemcomitans)是兼性厌氧菌置于CO₂培养箱中培养，F.nucleatum、牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）和福赛坦氏菌（T.forsythia）是专性厌氧菌则需置于厌氧培养箱或厌氧培养盒中培养。培养温度均为37℃，培养24h。

3、读取实验结果

3.1通常培养24小时后，就可以比较明显地观察到细菌的生长/没生长的情况。如果凭肉眼都可以观察到有无生长的区别，则就可以将96孔板从培养箱中取出，置于室温中平衡一段时间让其回复到室温（以防冷凝水聚集在96孔板的底部影响实验结果的读取）。

3.2将96孔板置于ELx808酶标仪酶标仪中，盖上酶标仪盖子后，启动ELx808酶标仪，读取96孔板上的数据，结果显示：24h内，不同浓度的毛冬青次皂苷对变形链球菌，伴放线放线杆菌，牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌、福赛坦氏菌有效，最低抑菌浓度见表2所示。而阳性对照组冬青素仅对变形链球菌有抑制效果，MIC值为7.81μg/mL，对伴放线放线杆菌，牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌则无效。通过对比试验显示，体现了毛冬青次皂苷作为抑菌剂，具有较好的广谱性的优势。

表2毛冬青次皂苷对细菌的最低抑菌浓度（MIC,μg/mL）

细菌种类	变形链球菌	伴放线放线杆菌	牙龈卟啉单胞菌	具核梭杆菌	福赛坦氏菌
						MIC	13.21	6.23	9.12	12.33	9.24

实施例2：

称取毛冬青次皂苷与二氧化硅、硬脂酸镁等常规赋形剂按照常规工艺，制成有效成分浓度为3%的粉末，经95%乙醇制粒，干燥后成颗粒剂。

实施例3取实施例2中的颗粒装入胶囊中即得胶囊剂。

实施例4取实施例3中的颗粒压片即得片剂。

实施例5：取硬脂酸、单硬脂酸甘油脂、白凡士林和液体石蜡置烧杯中，于水浴上加热至80℃，搅拌使熔化。另取吐温80和计算量蒸馏水水浴加热至约80℃，搅拌均匀，同温度下，将水相缓慢加入到油相中去，搅拌成乳白色半固体状，室温下搅拌冷却，称取毛冬青次皂苷与乳化剂基质共研磨即得乳膏剂。

实施例6：

取毛冬青次皂苷与凡士林、石蜡、硅油或羊毛脂等研磨均匀记得软膏剂。

实施例7：

取毛冬青次皂苷溶解于药用乙醇中制成溶液即得搽剂。

实施例8：

取毛冬青次皂苷溶解于抛射剂（如氟氯烷烃类）中，同时加入适量药用乙醇，装于适当的阀门容器中即得喷雾剂。

Claims

1.毛冬青次皂苷作为活性成分在制备抗菌剂中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于毛冬青次皂苷作为活性成分和药物助剂、赋形剂配制成药物上允许的任意一种剂型；或者毛冬青次皂苷作为活性成分和其他药物以及助剂、赋形剂配制成为药物上允许的任意一种剂型。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的剂型是外用的乳剂、软膏、搽剂、喷雾剂以及内服的片剂、胶囊和注射剂等。

4.所述的其他药物为硝基咪唑类，头孢类，b-内酰胺类，林可霉素类，红霉素，氯霉素以及四环素等。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的抑菌剂用于防治需氧菌、厌氧菌和兼性厌氧菌引起的相关疾病。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的需氧菌为变形链球菌；所述的厌氧菌为牙龈卟啉单胞菌及具核梭杆菌；所述的兼性厌氧菌为伴放线放线杆菌。