CN101385737A

CN101385737A - 一种抗菌有效成分及其应用

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Publication number: CN101385737A
Application number: CNA2008102320225A
Authority: CN
Inventors: 段康民; 王媛; 王玥
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2008-10-31
Filing date: 2008-10-31
Publication date: 2009-03-18

Abstract

一种抗菌有效成分及其应用，本发明是通过QSI抗菌药筛选体系确定，为双藿苷A及其衍生物，其具有在不杀死细菌的前提下降低细菌致病性的作用，属于黄酮类成分，源于淫羊藿中草药。由于细菌群体感应系统QS参与病原菌致病性的调节，双藿苷A具有抑制QS系统的作用，降低具有QS系统病原菌的致病性，是一类广谱性抗菌素药物；双藿苷A还可以作为农药用于农作物病虫害的治疗防治；以双藿苷A及其衍生物为抗菌药物的先导化合物，可开发出新型抗菌药物应用于临床和农业生产；本发明具有无耐药性、原料易得，制备方法易行、无毒害作用的优点，对人类健康和农业生产都有重大意义。

Description

一种抗菌有效成分及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种中药材的抗菌有效成分的确定及其应用。

背景技术

传统的抗菌素是指由细菌、霉菌或其它微生物在繁殖代谢过程中产生的，能够杀灭或抑制其它微生物的一类物质及其衍生物，用于治疗敏感微生物(常为细菌或真菌)所致的感染。青霉素作为最早的抗菌药物成功地解决了临床上金黄色葡萄球菌感染的难题；随后问世的大环内酯类、氨基糖苷类抗菌素又使肺炎、肺结核的死亡率降低了80％。迄今为止，所发现的各种抗菌素在治疗感染疾病中发挥着巨大作用，其大多数是由微生物合成，有三分之二是由链霉素产生。抗菌素按照化学结构的不同分为青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、奎诺酮类、磺胺类等，各种抗菌素的抗菌效果多呈抑菌作用，少数具有杀菌或是溶菌作用，具体的作用机理有：阻碍细菌细胞壁的合成，损害细菌胞浆膜的通透性，干扰蛋白质的合成，抑制脱氧核糖核酸的合成，竞争性抑制和干扰细菌的中间代谢。

临床表明细菌在长时间受传统抗菌素作用时，生存压力使得病原菌产生了耐药性。细菌的多重耐药性在全世界范围内扩增，威胁着整个人类的健康以及生存。因此，寻找能使病原菌失去致病能力，又不对其生存产生选择压力的药物是解决细菌抗药性的关键。

从这一点出发，目前人们基于细菌群体感应系统构建了抗菌素筛选体系。细菌群体感应系统(Quorum Sensing，QS)是近年发现的细菌细胞之间通过自诱导物(Autoinducer)信号分子，来协调其群体行为的一种广泛存在的机制(Annu Rev Cell Dev Biol，2005，21：319～346)；自诱导物浓度随着细菌数量的增加而增大，当浓度达到一定域值时，自诱导物与调节蛋白结合，可以控制包括生物被膜形成、毒素产生、致病因子表达、胞外多糖产生等一系列的相关基因表达，进而控制细菌的行为和表型，对病原菌的致病过程起决定作用。细菌群体感应系统(QS)广泛存在于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中，细菌群体感应调节系统抑制物(Quorum Sensing Inhibitor，QSI)是一类潜在的“抗致病药物”。通过筛选获得的QSI可以成为抗致病药物的先导化合物(AnnuRev Microbiol，1996，50：727～751)。

以铜绿假单胞菌为例(Nature，2000，406：959～964)：与其他病原菌一样其QS系统参与许多生物行为，在其致病过程中起关键作用；铜绿假单胞菌有两个以acyl-HSL(acyl-homohserine lactone，酰基高丝氨酸内酯)为自诱导物的QS系统，即Las系统和Rhl系统(J Clin Invest，2003，112：1460～1465)；在Las和Rhl系统中，自诱导物合成酶LasI和RhlI分别指导自诱导物N-(3-oxododecanoyl)homoserine lactone(3-O-C₁₂-HSL)和N-butyryl-homoserine lactone(C₄-HSL)的合成；转录调节蛋白LasR和RhlR可以与相应的自诱导物特异性结合，进而调节相关基因的表达。

中药可谓我国医用化合物的天然宝藏，但目前对大多数天然药物的有效成分不清且作用机理不明。淫羊藿最早记载于《神农本草经》，是使用悠久、应用广泛的中药材之一，受到国内外广泛关注；除其传统用于补肾壮阳祛风湿之外，临床上，淫羊藿还常用于治疗骨质疏松、更年期综合症、乳房肿块、高血压、冠心病等疾病；另外淫羊藿尚具有免疫增强、抗衰老、抗肿瘤、抗艾滋病等作用，具有巨大的研究和开发潜力(中国中药杂志2003，28(4)：303～306)。淫羊藿的主要化学成分为多糖和黄酮类，已有采用硅胶和葡聚糖凝胶柱层析进行分离，运用红外光谱、紫外光谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和质谱鉴定化合物，分离鉴定出有6种黄酮类成分(中国药学杂志1996，31(6)：332～334)，它们之间的不同体现在三个化学基团的变化。目前的研究大多是针对淫羊藿中总黄酮以及淫羊藿苷混合物的制备提取，而对淫羊藿的具体有效成分和作用机理尚未见有报道。

淫羊藿提取物中的双藿苷A属黄酮类成分之一(化学分子式如图1所示)，呈黄色粉末，可溶于水和甲醇，熔点204～206℃，Mg-HCl反应呈红色，Molish反应显棕色环(中国药学杂志1996，31(6)：332～334)。目前人们对淫羊藿中双藿苷A成分的认识仅限于对其理化性质及成份含量的分析研究，而将双藿苷A作为药用成分未见有任何药用或是具体效用的报道，目前在实验室通过柱层析可以获得双藿苷A(中国药学杂志1996，31(6)：332～334)。

发明内容

针对现有抗菌素存在耐药性的问题，本发明的目的是利用所构建的QSI抗菌药筛选体系对淫羊藿药物成分筛选，确定一种抗菌有效成分，同时提出双藿苷A及其衍生物作为抗菌药物的先导化合物在临床上的应用，该抗菌成分在不杀死细菌的前提下降低细菌的致病性，降低致病菌的耐药性。

本发明所提出的一种抗菌有效成分，是通过所构建的QSI抗菌药筛选体系确定，为双藿苷A及其衍生物，其具有在不杀死细菌的前提下降低细菌的致病性。所述的双藿苷A属于黄酮类成分，来源于淫羊藿中草药提取物；所述的双藿苷A分子衍生物是通过对双霍苷A分子进行化学修饰得到，可以是双藿苷A钠盐或是钾盐，即是在双霍苷A分子上R₃的氢离子以钠离子或是钾离子取代，亦具有对细菌的抗致病作用，从而确定双藿苷A及其衍生物作为抗菌药物的先导化合物在临床上的应用。双藿苷A抗菌的有效浓度范围为40μg/ml～200μg/ml，其最佳浓度为166μg/ml，使用的最低有效浓度为40μg/ml，经分析确定人体口服或注射的有效剂量为1～8mg/kg·次。本发明抗菌药可以是固体或者液体制剂应用于临床，可制作成口服液、冲剂、胶囊、片剂或是外包糖衣片的任一种剂型，也可制作成注射剂或是药囊植入到重病患者体内；还可制成喷雾剂作为农药有效预防和治疗植物的细菌感染。本发明的制备可依据淫羊藿苷的提取方法，进一步分离纯化出黄酮类成分双藿苷A。

本发明所构建的QSI抗菌药筛选体系，是利用铜绿假单胞菌受QS系统的调节基因lasI和rhlA为报道基因，以荧光发光杆菌的荧光素酶基因操纵子luxCDABE为报道子，构建的一种高灵敏度、低背景、高通量的QSI筛选体系；并利用这一筛选体系，对淫羊藿提取物中的黄酮类成分进行筛选，发现双藿苷A对铜绿假单胞菌的QS系统有明显的抑制作用。通过药理学研究，双藿苷A的药物作用机理是：双藿苷A通过对细菌群体感应系统的抑制作用来抑制细菌细胞与致病性相关的基因表达，使之在不杀死细菌的前提下降低细菌的致病性，并能大大降低致病菌的耐药性。

由于细菌群体感应系统QS参与人和动植物的病原菌致病性的调节，本发明所提出的双藿苷A具有抑制QS系统的作用，因此可以降低具有QS系统病原菌的致病性，所以本发明的双藿苷A及其衍生物被确定为抗菌药物的先导化合物，并以其开发出新型抗菌药物应用于临床治疗以及农业生产。具有QS系统的病原菌在临床上的致病菌主要包括有：铜绿假单胞菌、绿脓杆菌、大肠杆菌及其他肠道致病菌，如耶耳辛氏肠炎杆菌、沙门氏菌、及作为人类龋病的主要致病菌变形链球菌、金黄色葡萄球菌等；对于这一类具有QS系统的致病菌，双藿苷A都有降低其致病性的作用，因此确定双藿苷A是一类广谱性抗菌素药物。除此以外在农作物种植上，铜绿假单胞菌也是感染植物的病原菌，还有青枯菌以及引起马铃薯软腐病的主要病原菌软腐欧氏杆菌等都受QS系统调节。双藿苷A参与这些病原菌所引起的人及动植物感染的治疗，在不杀死细菌的情况下通过对细菌致病相关基因表达的抑制来达到抑制细菌致病性的目的，而不造成耐药性是其最大优势；并且双藿苷A制备的原料易得，制备方法易行，作为中药材提取物其本身无毒害作用。将双藿苷A及其衍生物作为抗菌药的先导化合物，对其官能团进一步修饰，则能开发出新型的抗菌素，不仅对人类健康，对畜牧业及农业等都有重大意义。

附图及其说明

附图1为双藿苷A化学分子式，式中R₁为Rha-Glc(鼠李糖-葡萄糖)，R₂为Glc(葡萄糖)，R₃为H；附图2为双藿苷A在166.67μg/ml浓度下，对lasQS抑制作用的曲线图，左图为发光强度(CPS)的对比曲线，右图为细菌生长(OD_600nm)的对比曲线；附图3为不同浓度的双藿苷A对las QS抑制作用影响的变化曲线；附图4是大蒜萃取物、双藿苷A和ddH₂O在固体培养基上对PAOD100(pKD-lasI)生长(左)和发光(右)影响的照片；附图5是双藿苷A对铜绿假单胞菌(PAO)在牛奶平板上的蛋白水解圈影响的照片。

具体实施方式

以下通过实例详细说明本发明所构建的QSI抗菌药物筛选体系，和对双藿苷A抗菌性的验证及其制备应用的举例。

所构建的细菌群体感应系统抑制物筛选体系，质粒pMS402(具有Tmp抗性)是带有缺失启动子的报道基因luxCDABE的载体(Mol Microbiol，2003，50：1477-1491)。lasI基因和rhlA基因的启动子区域经PCR扩增，克隆到报道质粒pMS402上，建成的两个质粒分别命名为pKD-lasI和pKD-rhlA；用电转化方法分别转化至PAOD100(J Bacteriol，1995，177：7155-7163)中，获得带有相应质粒的报道菌株PAOD100(pKD-rhlA)和PAOD100(pKD-lasI)；lasI基因和rhlA基因的启动子分别对Las和Rhl QS系统的自诱导物反应，使荧光素酶基因表达，从而使菌体发光。在QS抑制物存在下，检测表达量(即counts per second，CPS发光值)的强度，用构建的QSI筛选体系对淫羊藿中药成分以及提取物筛查，确定双藿苷A具有抑制QS系统的作用。

实施例1、

(1)用多孔板对所构建筛选体系的有效性检验以及筛选体系的工作方式。

在多孔板中使用PAOD100(pKD-lasI)和PAOD100(pKD-rhl)两个报道体系，对中药成份进行筛查。群体感应抑制物(QSI)的筛选，使用含Tmp抗菌素的M9液体培养基，在底部透明的多孔板中进行；将报道菌株PAOD100(pKD-rhlA)和PAOD100(pKD-lasI)培养菌液接种至多孔板中，然后每孔分别加测试样品、甲醇或水对照，并以无菌矿物油或透明塑料膜覆盖；多孔板在Wallac Victor 1420多标记分析仪上间歇震荡，每隔半小时测量其生长(OD₆₀₀)和发光值(CPS)；样品中若含有QSI，发光值则会明显下降。分析对中药成份及中药提取物样品的粗筛结果，发现双藿苷A具有抑制PAOD100(pKD-lasI)发光的作用，如图2(左)，表现为在双藿苷A的存在下，基因的表达即发光量明显受到抑制。在双藿苷A实验孔发光发生变化的同时，与对照相比，PAOD100(pKD-lasI)的生长基本无差别，如图2(右)表现为两条对比曲线几乎重合。可见双藿苷A仅针对QS系统有抑制作用而并不抑制细菌生长，在生长状况相同的前提下能表现出对QS系统的抑制，这就证明了双藿苷A在降低致病性的同时降低了细菌耐药性产生的可能。

(2)双藿苷A抗菌作用的固体平板检测。

在固体平板上同样使用PAOD100(pKD-lasI)和PAOD100(pKD-rhlA)两个报道体系，来检测样品对生长的影响，可以直接观察。用报道菌株PAOD100(pKD-rhlA)和PAOD100(pKD-lasI)的培养菌液接种含Tmp抗菌素的LB液体培养基，细菌与培养基摇匀混合倒平板；待凝固后将平板分为3个相等的区域放置无菌滤纸片，3个滤纸片分别有大蒜萃取液作为阳性对照(J Bacteriol，2005，187：1799-1814)，和中药提取物样品，以及ddH₂O或甲醇作为负性对照；培养后在LAS-3000荧光/化学发光成像分析系统中成像，观测记录发光强度及其变化。如果样品在抑制生长的同时具有QSI特性，在固体平板检测的方式下，也可以通过抑菌圈外的发光量变化检测到QSI特性；图4分别是大蒜萃取物、双藿苷A和ddH₂O在固体培养基上对PAOD100(pKD-lasI)生长(图4左)和发光(图4右)的影响；图4(左)表现为在相同条件下，这些样品对PAOD100(pKD-lasI)生长基本没有影响，但图4(右)表现为含大蒜萃取物的滤纸片的周围细菌发光减弱，含双藿苷A的滤纸片的周围细菌发光也减弱，而含ddH₂O的滤纸片的周围细菌发光情况没有变化。这一结果表明：大蒜萃取物和双藿苷A使lasI基因的表达量降低，导致细菌发光减弱，说明了Las QS系统受到了抑制。平板检测结果与多孔板测试结果相吻合，进一步验证了双藿苷A的QSI特性。

(3)铜绿假单胞菌在牛奶平板上形成蛋白水解圈的检测。

由于细菌自身会分泌蛋白酶水解牛奶中的蛋白，在平板上留下透明的蛋白酶水解圈，而QS系统对铜绿假单胞菌的蛋白酶合成有调节作用，抑制QS系统可以进一步抑制细菌的蛋白酶活性，从而不能形成透明的水解圈。

将灭菌牛奶母液与LB培养基混合配成2％的牛奶固体平板。将平板分隔成相等的三个部分，把培养的铜绿假单胞菌(PAO)的稀释菌液、和菌液与双藿苷A混合液、以及双藿苷A三者直接点在干燥的牛奶平板上；单独的双藿苷A作为对照，单独的PAO在平板上细菌的蛋白酶合成未受阻碍，可看见清晰的蛋白水解圈，如图5所示，而双霍苷A与PAO混合后细菌的QS系统受抑制从而抑制了细菌的蛋白酶水解活性，所以在平板上未形成水解圈。由此进一步验证，双霍苷A可以抑制细菌QS系统，有效地降低细菌的致病性。

(4)双藿苷A用量的确定(浓度梯度测试)。

为测量双藿苷A的有效浓度范围，确定双藿苷A的用量。以母液为起始浓度作系列的梯度稀释，如图3示例不同浓度下双藿苷A对las QS的抑制作用，不同浓度的双藿苷A呈现出不同程度的抑制作用，从图中可得出双藿苷A的有效浓度范围为40～200μg/ml，其抑制效果在166.67μg/ml浓度时达到峰值，为最佳抑制浓度；确定40μg/ml为可用的最低抑制浓度。

实施例2、

双藿苷A的提取可采用已有方法的组合获取(中国药学杂志1996，31(6)：332～334)。研究表明，淫羊藿不同部位中双藿苷A的分布量为根>茎>叶，用淫羊藿提取双藿苷A，包括有浸提、脱杂、萃取、多步洗脱过柱、干燥五个步骤；也可购买淫羊藿苷提取物或淫羊藿总黄酮提取物，再采用硅胶和葡聚糖凝胶柱层析进行分离。提取是以乙醇溶液作为浸提溶剂，以二氯甲烷或二氯乙烷作脱杂溶剂，分别以二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取、浓缩，合并乙酸乙酯和正丁醇部分，用硅胶柱(100～200目)进行分离，氯仿、甲醇梯度洗脱，合并相同流份，取第8部分再次用硅胶柱进行分离，然后用葡聚糖凝胶Sephadex LH220柱纯化，经洗脱喷雾干燥即得双藿苷A。

实施例3、

本发明筛选的双藿苷A作为抗菌有效成分，其有效浓度为40μg/ml～200μg/ml范围；取其有效用量为50mg/l，按照成人标准体重50kg可以计算出一次用药的参考用量，体重中包含有60％的体液，40％为细胞内液，20％为细胞外液，而细胞外液中体重的5％为血浆，15％为组织液；即血液中达到该有效浓度所需的一次用药参考量为50kg×5％×50mg/l＝125mg，但考虑到个体的差异和给药方式及剂型的不同，人体一次口服或注射的用药量应在1mg/kg～8mg/kg范围。双藿苷A溶于水或者有机溶剂，可制成片剂、丸剂、粉剂、冲剂直接口服或舌下、直肠给药，亦可用于吸入治疗，针剂可以静脉、肌肉注射，外用可对皮肤或者眼睛局部用药，重病者可以进行植入治疗。双藿苷A是从已用多年的中药材中提取纯化，故无毒副作用。

实施例4、

可以将双藿苷A制成粉剂农药，用于由致病细菌引起的多种农作物病虫害的治疗防治。双藿苷A溶于水，将其配制成浓度为80mg/l～180mg/l的水溶液，作为农药直接喷洒或浸根，可治疗和防治农作物的病虫害；另外，可将双藿苷A与农药增效剂(如消抗液)混合使用，能够改进农药的湿润、附着的性能，尤其是可以加快其穿透速度，达到提高药效的目的。将双藿苷A作为农药使用，具有绿色无公害和环保的优点。

Claims

1、一种抗菌有效成分，是通过QSI抗菌药筛选体系确定，其特征在于，所述的抗菌有效成分为双藿苷A及其衍生物，其具有在不杀死细菌的前提下降低细菌致病性的作用；所述双藿苷A属于黄酮类成分，源于淫羊藿中草药。

2、根据权利要求1所述的抗菌有效成分，其特征在于，所述的双藿苷A衍生物是双藿苷A的钠盐或是钾盐，即是在双霍苷A分子上R₃的氢离子以钠离子或是钾离子取代。

3、根据权利要求1所述的抗菌有效成分，其特征在于，将所述的双藿苷A应用于降低具有QS系统致病菌的致病性，是一类广谱性抗菌素药物。

4、根据权利要求3所述抗菌有效成分的应用，其特征在于，所述双藿苷A抗菌的有效浓度范围为40μg/ml～200μg/ml，优化的浓度为166μg/ml。

5、根据权利要求3所述抗菌有效成分的应用，其特征在于，所述双藿苷A抗菌药是固体或是液体制剂；可以制成口服液、冲剂、胶囊、注射剂、药囊、片剂或是外包糖衣片的任一种剂型。

6、根据权利要求3所述抗菌有效成分的应用，其特征在于，所述双藿苷A用于人体口服或注射的有效剂量为1～8mg/kg·次。

7、根据权利要求3所述抗菌有效成分的应用，其特征在于，将所述的双藿苷A制成农药，用于由致病细菌引起的农作物病虫害的治疗防治。

8、根据权利要求7所述抗菌有效成分的应用，其特征在于，将所述的双藿苷A溶于水，配制成浓度为80mg/1～180mg/l的水溶液使用。