CN101181469A - 一种抗骨质疏松中药提取物及活性成分的提取工艺和用途 - Google Patents

一种抗骨质疏松中药提取物及活性成分的提取工艺和用途 Download PDF

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CN101181469A CNA2007101584946A CN200710158494A CN101181469A CN 101181469 A CN101181469 A CN 101181469A CN A2007101584946 A CNA2007101584946 A CN A2007101584946A CN 200710158494 A CN200710158494 A CN 200710158494A CN 101181469 A CN101181469 A CN 101181469A
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殷军
刘阳
刘志惠
王卓
王勇
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Abstract

本发明公开了中药绵萆薢抗骨质疏松活性提取物与活性成分的提取工艺及其用于治疗骨质疏松症的用途。该工艺以中药绵萆薢及新鲜采集的绵萆薢的干燥块茎为原料，采用溶剂提取法、树脂吸附法、正相柱层析法及反相柱层析法制备的提取物。并且以中药绵萆薢活性提取物为原料，应用正相柱层析色谱法、反相柱层析色谱法，正相制备薄层层析法、反相制备薄层层析法，重结晶法及制备液相色谱法分离得到各单体化合物。该工艺得到的绵萆薢的提取物及部分单体化合物用于制备抗骨质疏松症的药物。

Description

一种抗骨质疏松中药提取物及活性成分的提取工艺和用途
技术领域
本发明涉及一种从天然植物中确切的说是中药绵萆薢中获得的具有抗骨质疏松活性的提取物及活性成分的提取工艺及其用于治疗骨质疏松症的用途。
背景技术
骨质疏松症(Oste0Porosis简称OP)是以骨量减少，骨组织微细结构破坏导致骨脆性增加和骨折危险性增加为特征的一种系统性、全身性骨骼疾病。也是一种以骨密度低下为主要症状的一种骨代谢失调的全身性疾病。国际医学界已将骨质疏松症与糖尿病、心血管病等并列为严重危害老年人健康的三大疾病。
绵萆薢：又名白萆薢、川萆薢、棉萆薢。为植物绵萆薢的干燥根茎。绵萆薢的植物来源为薯蓣科绵萆薢Dioscorea spongiosa J.Q.Xi，M.Mizuno et W.L.Zhao、福州薯蓣Dioscorea futschauensis Uline ex R.Knuth和七裂叶萆薢Dioscorea septemloba Thunb.。其化学成分包含薯蓣皂苷(dioscin)、纤细薯蓣皂苷(gracillin)，另含有原薯蓣皂苷(protodioscin)、原纤细薯蓣皂苷(protogracillin，kikubasaponin)及甲基原纤细薯蓣皂苷。性平、味苦。具有利湿去浊，祛风通痹的功效。用于治疗淋病白浊、白带过多、湿热疮毒、腰膝痹痛。
我们的研究发现绵萆薢水提取物经大孔树脂柱后，90％乙醇洗脱物具有较强的抗骨质疏松活性，包括促进成骨细胞增殖，抑制破骨细胞形成的活性，及较明显的抑制PTH诱导的小鼠颅骨骨吸收亢进的活性并且可以显著提高OVX大鼠胫骨近端全骨、松质骨的骨矿含量和骨密度、皮质骨的骨矿含量和厚度，改善骨强度。其中更重要的是90％乙醇部位高剂量组可显著提高胫骨的抗扭力强度，所以我们把90％乙醇洗脱物作为绵萆薢的活性提取物。
在对90％乙醇洗脱物进行化学成分研究过程中，分离得到了28个化合物，其中化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或具有促成骨细胞增值活性或具有抑制破骨细胞形成活性或具有抑制骨吸收活性或具有抑制PTH诱导的小鼠颅骨骨吸收亢进活性(具体数据见药效实验结果)，即这些化合物均表现了抗骨质疏松的活性。所以我们把这些化合物作为绵萆薢中具有抗骨质疏松活性的活性成分，其中化合物17是抗骨吸收实验中的主要皂苷类活性成分，作为90％乙醇部位的主要化学成分，在抑制骨吸收的器官培养模型中显示了较强的活性而且没有细胞毒性。
除本人的研究外，目前尚没有他人从绵萆薢中提取具有抗骨质疏松活性的提取物及活性成分的报道，本发明就绵萆薢中具有抗骨质疏松活性的提取物及活性成分的提取工艺提出发明申请。
发明内容
本发明的目的是提供中药绵萆薢活性提取物及活性成分的提取工艺。绵萆薢经适当的工艺处理后得到的提取物及单体化合物，具有治疗或(和)预防骨质疏松症的活性。
绵萆薢其植物来源为下列植物中的一种或多种：薯蓣科绵萆薢Dioscorea spongiosa J.Q.Xi，M.Mizuno et W.L.Zhao、福州薯蓣Dioscoreafutschauensis Uline ex R.Knuth和七裂叶萆薢Dioscorea septemlobaThunb.。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
1.活性提取物的提取工艺
(1)绵萆薢根茎粗粉，加水回流提取，滤液蒸干，将得到的浸膏用热水溶解，上样于事先处理好的Diaion 101柱，用蒸馏水及30％，90％乙醇洗脱，得到的90％乙醇洗脱物。
(2)绵萆薢根茎粗粉，加水回流提取，滤液减压浓缩至小体积，先经氯仿萃取后经正丁醇萃取，得到的绵萆薢绵萆薢总皂苷。
(3)绵萆薢根茎粗粉，加75％乙醇回流提取，提取液减压回收乙醇，得到的提取物用少量水分散，氯仿萃取后用正丁醇萃取，得到的绵萆薢绵萆薢总皂苷。
(4)绵萆薢根茎粗粉，加75％乙醇回流，提取液减压回收乙醇后得到的提取物通过非极性大孔吸附树脂，以50％的含水乙醇洗脱，洗脱物减压回收溶剂，得到的绵萆薢总皂苷。
本发明绵萆薢抗骨质疏松活性提取物及活性成分的提取工艺所述活性提取物为绵萆薢的水及醇的简单提取物通过吸附树脂柱后，经水一醇混合溶剂洗脱得到的不同比例洗脱物、绵萆薢总皂苷及从绵萆薢中提取得到的可以预防或(和)治疗骨质疏松症的其它提取物。所述的醇指具有以下通式的饱合一元醇及不饱合一元醇：CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜5)。在混合洗脱剂中，醇所占的百分含量在1％-95％之间。所列的吸附树脂为苯乙烯类、丙烯酸酯类、丙烯酰胺类或氧化氮类大孔吸附树脂任何一种；柱层析填料为下列填料中的任何一种：硅胶、氧化铝、聚酞胺、吸附树脂、葡萄糖凝胶、硅藻土。绵萆薢总皂苷指来源于绵萆薢且绵萆薢皂苷类成分的含量超过50％的提取物。所列的绵萆薢其它提取物，指含有下列化合物中的任何一种，并用于治疗或(和)预防骨质疏松症的提取物：化合物1：绵萆薢素A(diospongiisn A)；2：绵萆薢素B(diospongiisn B)；3：绵萆薢素C(diospongiisn C)；4：piperitol；5：sesaminone；6：(+)-syringaresinol；7：绵萆薢苷A(spongipregnoloside A)；8：绵萆薢苷C(spongipregnoloside C)；9：绵萆薢苷D(spongipregnoloside D)；10：spongiosides E；11：黄山药皂苷(dioscin)；12：pregna-5，16-diene-1β-o1-20-one-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranoside；13：薯蓣皂苷(dioscin)；14：prosapogenin A；15：gracillin；16：hypoglaucin G；17：methylprotodioscin；18：glycoside D；19：daucosterol；20：β-sitosterol；21：(R)-oct-1-ene-3-yl O-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-Glucopyranoside。以中药绵萆薢及新鲜采集的绵萆薢的干燥块茎为原料，采用溶剂提取法、溶剂萃取法、树脂吸附法、正相柱层析法、反相柱层析法、正相薄层层析法、反相薄层层析法及重结晶法得到的上述21种化合物中任何一种的提取物及绵萆薢总皂苷。所列的溶剂为不多于10个碳原子的卤代烷、醇、酮、酯、醚或其混合物，其中卤代烷具有以下通式：CnH2n+1R、CnH2nR2或CnH2n-1R3(n＜10；R＝Cl，Br，I)，醇类溶剂具有以下通式：CnH2n+OH或CnH2n-1OH(n＜10)，酮类及醚类溶剂具有以下通式：CnH2nO或CnH2n-2O(n＜10)，酯类溶剂具有以下通式：CnH2nO2或CnH2n-2O2(n＜10)。溶剂洗脱方式包括单一溶剂的正相、反相及梯度洗脱。
药效实验：动物体内实验表明绵萆薢提取物及总皂苷无论是在抑制OVX大鼠胫骨近端全骨的骨矿含量和骨密度、松质骨的骨矿含量和骨密度、皮质骨的骨矿含量和厚度的下降，还是在改善骨强度方面都显示了较强的活性，并呈良好的量效关系。所以我们认为绵萆薢水提取物经D101大孔树脂柱后30％～90％洗脱物为绵萆薢的活性提取物，绵萆薢总皂苷也为活性物质。
2.活性成分的提取工艺
9 0％乙醇洗脱物，经硅胶柱层析，用CHCl3-MeOH梯度洗脱，得到6个流份，将流份2、3、4、5、6分别采用正相柱层析法、反相柱层析法、正相薄层层析法、反相薄层层析法、重结晶法分离得到的各单体化合物。
本发明绵萆薢活性提取物及活性成分的提取工艺所述的活性成分是指以绵萆薢活性提取物为原料，采用正相柱层析色谱法、反相柱层析色谱法，正相制备薄层层析法、反相制备薄层层析法，反复重结晶法，制备液相色谱法分离纯化得到的单体化合物：包括1：绵萆薢素A(diospongiisn A)；2：绵萆薢素B(diospongiisn B)；3：绵萆薢素C(diospongiisn C)；4：piperitol；5：sesaminone；6：(+)-syringaresinol；7：绵萆薢苷A(spongipregnoloside A)；8：绵萆薢苷C(spongipregnoloside C)；9：绵萆薢苷D(spongipregnoloside D)；10：spongiosides E；11：黄山药皂苷(dioscin)；12：pregna-5，16-diene-1β-o1-20-one-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranoside；13：薯蓣皂苷(dioscin)；14：prosapogenin  A；15：gracillin；16：hypoglaucin G；17：methylprotodioscin；18：glycoside D；19：daucosterol；20：β-sitosterol；21：(R)-oct-1-ene-3-yl O-α -L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-Glucopyranoside。所述的柱层析色谱填料为下列填料中的任何一种：硅胶、氧化铝、聚酰胺、吸附树脂、葡萄糖凝胶、ODS、硅藻土；制备薄层板的吸附剂为硅胶G、硅胶H、硅胶GF254、氧化铝及聚酰胺中的任何一种。所列的溶剂为下列溶剂及与水以任意比例混合的溶剂：不多于10个碳原子的卤代烷、醇、酮、酯、醚或其混合物等，其中卤代烷具有以下通式：CnH2n+1R、CnH2nR2或CnH2n-1R3(n＜10；R＝Cl，Br，I)，醇类溶剂具有以下通式：CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜10)，酮类及醚类溶剂具有以下通式：CnH2nO或CnH2n-2O(n＜10)，酯类溶剂具有以下通式：CnH2nO2或CnH2n-2O2(n＜10)。溶剂洗脱方式包括单一溶剂的正相、反相及梯度洗脱。
在对90％乙醇洗脱物进行化学成分研究过程中，分离得到了28个化合物，对它们同时进行促成骨样细胞增殖、抑制破骨样细胞形成实验及抑制PTH诱导骨吸收的实验。在实验中，化合物1、6、7、9、11、14、15及16显示了很强的促成骨细胞增殖活性，化合物8、12、13、17、18、20及21具有较弱的活性。在抑制破骨样细胞形成实验中，有效的化合物有2、3、4、6、13、17、19及20。抑制骨吸收实验中有效的化合物有2、3、4、5、6、10、16、17及21。其中化合物2、3、4、5、6、16、17及21具有抑制PTH诱导的小鼠颅骨骨吸收亢进活性，即这21个化合物均表现了抗骨质疏松的活性。所以我们把这些化合物作为绵萆薢中的活性成分，其中化合物17是抗骨吸收实验中的主要活性成分，在小鼠OVX模型中，化合物17抑制了全骨骨矿含量、骨密度和全骨断面面积的降低，松质骨骨密度的降低，皮质骨的内、外膜周长的增长，皮质骨骨矿含量、皮质骨厚度和皮质骨密度的下降及抗扭力的减弱。具有较强的抗骨质疏松作用而且不具有细胞毒性。
本发明的有益效果是：(1)、本发明提供了从天然植物绵萆薢中提取抗骨质疏松活性较强的提取物的提取工艺，此工艺简单，操作方便，生产成本较低。(2)、本发明提供了绵萆薢中具有抗骨质疏松活性的活性成分的提取工艺，并且找到了含量大、活性强且基本没有毒性的化合物。(3)、这些工艺制备的提取物及化合物可以为制备预防或(和)治疗骨质疏松症的药物提供优质原料产品。
附图说明：
图1为绵萆薢活性成分提取工艺图
图2为本发明中提取的化合物1
图3为本发明中提取的化合物2
图4为本发明中提取的化合物3
图5为本发明中提取的化合物4
图6为本发明中提取的化合物5
图7为本发明中提取的化合物6
图8为本发明中提取的化合物7
图9为本发明中提取的化合物8
图10为本发明中提取的化合物9
图11为本发明中提取的化合物10
图12为本发明中提取的化合物11
图13为本发明中提取的化合物12
图14为本发明中提取的化合物13
图15为本发明中提取的化合物14
图16为本发明中提取的化合物15
图17为本发明中提取的化合物16
图18为本发明中提取的化合物17
图19为本发明中提取的化合物18
图20为本发明中提取的化合物19
图21为本发明中提取的化合物20
图22为本发明中提取的化合物21
具体实施方式：
1具有抗骨质疏松活性提取物的提取工艺
实例1：水提取物经大孔树脂柱后，90％乙醇洗脱物的制备方法：绵萆薢10克，粉碎成100～200  左右的粗粉，加100ml水回流提取二次，每次1小时，所得溶剂经冻干或减压干燥，得到提取物3.6g，此提取物溶于热水后通过大孔吸附树脂柱，用水一醇混合溶剂洗脱得到的含30-90％醇洗脱物。
实例2：绵萆薢总皂苷的制备方法的①：绵萆薢根茎100克，粉碎成100～200目左右的粗粉，加600ml水回流提取2次，每次2小时，减压浓缩提取物至小体积，先经氯仿萃取除去脂溶性成分，后经正丁醇萃取，得绵萆薢总皂苷26.9克。②：绵萆薢根茎100克，粉碎成100～200目左右的粗粉，加600毫升75％乙醇回流提取2次，每次2小时，滤液经减压回收乙醇后得到的提取物用少量水分散，先经氯仿萃取除去脂溶性成分，后经正丁醇萃取，得绵萆薢总皂苷36.9克。③：绵萆薢根茎100克，粉碎成100～200目左右的粗粉，加600毫升75％乙醇回流提取2次，每次2小时，滤液减压回收乙醇后得到提取物。将提取物通过非极性大孔吸附树脂柱，以50％的含水乙醇洗脱，洗脱物经减压回收溶剂，得绵萆薢总皂苷16.2克。
2绵萆薢提取物的体内实验
实验方法：将90只6月龄的健康未交配Wister大鼠，经适应性喂养1周后，进行双卵巢切除术或假手术，随机分成9组：(1)卵巢切除10周组(control组)：卵巢切除术后10周处死。(2)假手术组(sham组)：进行手术，但不摘除卵巢，10周后处死。(3)阳性对照组(positive control组)：卵巢切除术两周后经皮下注射给药0.1毫克/千克/天17β-estradiol(购于日本东京化成工业株式会社)，用药8周后处死。(4)萆薢90％乙醇部位高剂量组(90％EtOH 100)：卵巢切除术两周后经胃肠道给药，灌注萆薢90％乙醇部位100毫克/千克/天，用药8周后处死。(5)萆薢提取物低剂量组(90％EtOH 50)：卵巢切除术两周后经胃肠道给药，灌注萆薢90％乙醇部位50毫克/千克/天，用药8周后处死。(6)萆薢总皂苷高剂量组(T.saponin 100)：卵巢切除术后8周经胃肠道给药，灌注萆薢总皂苷100毫克/千克/天，用药8周后处死。(7)萆薢总皂苷低剂量组(T.saponin 50)：卵巢切除术两周后经胃肠道给药，灌注萆薢总皂苷50毫克/千克/天，用药8周后处死。所有动物处死前，麻醉状态下用外周肢体定量计算机断层扫描(PQCT)测量大鼠左侧胫骨近端干髓端生长板下1-5mm范围内的松质骨、皮质骨和全骨，扫描4个断面，数据取自3-4mm处断面。测量指标：全骨矿量、全骨密度、全骨断面积、松质骨矿量、松质骨密度、皮质骨外周周长、内周周长、皮质骨矿量、皮质骨密度、皮质骨厚度、抗压力、抗折力、抗扭力等。
实验结果：
(1)各实验组对大鼠胫骨近端全骨的影响
实验组   鼠数 全骨矿量 全骨密度 全骨断面积
对照组假手术组阳性对照组90％EtOH10090％EtOH 1089910     8.13±0.75#9.77±1.348.94±1.12*9.17±0.86*8.45±     638.32±35.05760.25±20.29#709.39±31.08*695.36±50.40*655.01±     12.77±1.3812.85±1.7112.58±1.2013.26±1.7112.93±
  50总皂苷100总皂苷50 910     0.568.66±0.388.57±0.85     39.15636.37±15.79656.32±44.17     0.9513.60±0.5513.01±1.52
#P＜0.01与伪手术组对照，*P＜0.01与对照组对照
(2)各实验组对大鼠胫骨近端松质骨影响
    实验组   松质骨矿量   松质骨密度
    对照组假手术组阳性对照组90％EtOH10090％EtOH50总皂苷100总皂苷50     0.79±0.160.87±0.080.79±0.130.97±0.33*0.99±0.18**1.02±0.09**0.97±0.24*     150.9±27.4#208.6±56.9198.3±51.3**227.0±33.2***193.9±30.1***202.0±6.9***197.2±30.7***
#p＜0.05.与伪手术组对照，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001
与对照组对照
(3)各实验组对大鼠胫骨近端皮质骨的影响
A.各实验组对大鼠胫骨近端皮质骨的内、外膜周长的影响
    实验组     外膜周长     内膜周长
  对照组假手术组阳性对照组90％EtOH10090％EtOH50总皂苷100总皂苷50     12.65±0.6812.68±0.8412.56±0.5912.88±0.8512.69±0.4513.07±0.2712.81±0.74     9.59±0.70#8.92±0.809.14±0.46*9.62±0.989.64±0.569.96±0.329.74±0.75
#p＜0.05与伪手术组对照，*p＜0.05与对照组对照
B.各实验组对大鼠胫骨近端皮质骨的骨矿含量、骨密度及皮质骨厚度的影响
实验组 皮质骨骨矿含量 皮质骨骨密度 皮质骨厚度
对照组假手术组 5.34±0.41##6.09±0.24     1251.58±13.821257.85± 0.49±0.03##0.60±0.02
阳性对照组90％EtOH10090％EtOH50总皂苷100总皂苷50 6.86±0.67* *6.62±0.44* *6.32±0.34* *6.25±0.21* *6.28±0.51* *     10.131291.97±15.761294.43±18.931268.60±15.701254.27±12.861258.30±9.84 0.54±0.04**0.52±0.03*0.49±0.030.50±0.020.49±0.03
##p＜0.01与伪手术组对照，*p＜0.05，**p＜0.01与对照组对照
(4)各实验组对大鼠胫骨近端骨强度的影响
  实验组 X轴抗压力 Y轴抗折力 极轴抗扭力
  对照组假手术组阳性对照组90％EtOH10090％EtOH50总皂苷100总皂苷50   3.51±0.51##4.87±0.864.15±0.94*3.85±0.573.76±0.333.67±0.133.75±0.59     4.47±0.664.44±0.974.26±0.574.87±0.684.54±0.354.45±0.544.40±0.81   7.17±1.25#8.71±1.697.87±1.278.06±1.35*7.43±0.757.83±0.377.38±1.15
#p＜0.05，##p＜0.01.与伪手术组对照；*p＜0.05，**p＜0.01与对照组
对照
结论：上述数据以绵萆薢水及醇的简单提取物通过大孔吸附树脂柱经含30-90％的水一醇混合溶剂洗脱物及绵萆薢总皂苷为例，证实绵萆薢水及醇的简单提取物经含30-90％的水一醇洗脱物及绵草薛总皂苷无论是在提提高OVX大鼠胫骨近端全骨的骨矿含量和骨密度、松质骨的骨矿含量和骨密度、皮质骨的骨矿含量和厚度，还是在改善骨强度方面，都显示了较强的活性。并且含30-90％不同浓度的水一醇洗脱物组中存在可显著提高胫骨的抗扭力强度的组分，这是许多抗骨质疏松药物所达不到的。
3具有抗骨质疏松活性的化合物的提取工艺
实例：如图1
将80克90％乙醇部位，经硅胶柱层析，用CHCl3-MeOH梯度洗脱(99∶1-1∶99)，得到6个流份(Fr.1-Fr.6)，流份2、3、4、5、6经反复硅胶柱层析、反相薄层制备、大孔树脂柱层析、重结晶等方法得到28个化合物，其中的21个经实验证实具有抗骨质疏松活性，分别为1：绵萆薢素A(diospongiisn A)；2：绵萆薢素B(diospongiisn B)；3：绵萆薢素C(diospongiisn C)；4：piperitol；5：sesaminone；6：(+)-syringaresinol；7：绵萆薢苷A(spongipregnoloside A)；8：绵萆薢苷C(spongipregnoloside C)；9：绵萆薢苷D(spongipregnoloside D)；10：spongiosides E；11：黄山药皂苷(dioscin)；12：pregna-5，16-diene-1β-o1-20-one-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranoside；13：薯蓣皂苷(dioscin)；14：prosapogenin A；15：gracillin；16：hypoglaucin G；17：methylprotodioscin；18：glycoside D；19：daucosterol；20：β-sitosterol；21：(R)-oct-1-ene-3-yl O-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-Glucopyranoside。并运用核磁共振(NMR)，质谱(MS)，红外(IR)，气相(GC)等光谱、色谱手段，确定了它们的结构、相对及绝对构型。(各化合物的结构见附图2-22)
4.化合物活性筛选：
(1)促成骨样细胞增值实验：实验数据见下表
所有化合物促成骨细胞增值实验数据
Comp.   Stimulation Rate(％) Comp  Stimulation Rate(％)
1234567891011     79.8***2.3□25.4□28.7□23.460.3**13.730.0*211.6***□10.695.1***    45.6**□23.1□8.9□41.7□29.7120.0***72.0**□14.8228.1***5.067.3**     □12.5□33.3□10.6□12.3□6.7□2.140.6*39.0*56.2**□4.347.1*     12131415161718192021    □25.1□102.313.477.7***32.0□29.932.4□17.6□45.5□7.5   4.7□31.264.1**12.185.6***□27.177.7***□9.1□30.145.6**   40.6*24.8*81.8***□6.425.7*32.1*20.049.2**31.4*34.6*
结论：化合物1、6、7、9、11、14、15及16均显示了很强的促成骨样细胞增值的活性。化合物8、12、13、17、18、20及21的活性较弱。
(2)抑破骨细胞形成实验：实验数据见下表
二芳基庚酮类及部分甾体皂苷类抑制破骨细胞形成的实验数据
Comp.     Conc.(μM)     Numb.of TRAP(+)     Inh.Ratio(％)
NormalControlElcitonin12345613171920 0.12U/ml200202200202200202200202200202200202200202002022002020020     0.0±0.0109.8±37.732.0±6.7*1.3±1.5**70.3±8.895.3±6.40.0±0.0**7.1±0.5*33.8±25.9*0.0±0.0**6.3±2.5*31.3±18.8*1.3±1.1**9.3±1.6*18.9±23.40.0±0.0**1.2±1.1*52.5±26.0*0.0±0.0**5.6±2.5*35.8±25.7*64.0±19.2119.3±1.5**0.0±0.0**0.0±0.0**61.3±4.5*0.0±0.0**103.0±15.40.0±0.0**2.0±4.0* 70.898.936.013.2100.098.269.2100.096.871.598.994.082.9100.099.052.2100.097.768.341.70100.0100.046.8100.06.2100.098.2
结论：上述数据表明除化合物1以外，所有的二芳基庚酮类及甾体皂苷类化合物均具有潜在的抑制破骨细胞形成的活性。其中化合物2、3、4及6在200μM时，完全抑制了破骨细胞的形成。甾体皂苷13、17、19及20也显示了较强活性。
(3)抑制骨吸收实验：实验数据见下表
所有化合物抑制骨吸收的实验数据
Comp.     45Ca release(％) Comp.     45Ca release(％)
  200M     20M   200M   20M
PTHControlElcitonin123456789   25.3±2.6#15.4±1.3***18.4±0.7**44.6±3.330.5±0.419.1±1.6*13.6±1.0***15.1±1.5**24.1±1.944.6±5.123.7±0.925.5±3.5 21.8±1.918.2±3.1*18.2±3.2*22.6±2.514.7±0.8***21.9±1.541.9±8.627.7±2.026.9±5.2 11121314151617181920 27.8±2.429.6±1.920.7±4.032.5±0.525.8±0.919.2±2.1*17.4±1.6**31.2±0.933.2±7.837.2±1.7 23.3±1.425.3±7.523.8±7.028.4±9.126.4±0.322.8±7.924.9±1.228.5±1.627.1±1.021.6±3.0
10     17.1±4.5* 30.9±4.5 21     20.7±1.1* 23.8±1.6
结论：二芳基庚酮类化合物2、3、4及6在低浓度下(20μM)就显示了强的抑制骨吸收的活性。化合物5在较高浓度下(200μM)具有此活性。甾体皂苷类化合物10、16、17及21在较高浓度下同样具有抑制骨吸收的活性。
(4)对PTH诱导的骨吸收的抑制实验：实验数据见下表
所有化合物对由PTH诱导的45Ca释放的抑制作用
Comp.   45Ca release(％) Comp.   45Ca release(％)
    200     20     200     20
1     44.6±3.3     21.8±1.9 2     30.5±0.4     18.2±3.1*
3     19.1±1.6*     18.2±3.2* 4     13.6±1.0*** 22.6±2.5
5     15.1±1.5**     14.7±0.8** 6     23.3±1.9     20.9±0.4*
7     22.2±0.2     27.4±4.2 8     20.7±4.0     23.8±7.0
9     31.1±1.6     25.0±4.5 10     37.3±4.1     41.9±3.5
11     37.3±9.5     21.6±1.0 12     29.6±1.9     25.3±7.5
13     26.2±1.2     32.6±1.7 14     23.7±1.0     27.7±2.0
15     44.6±5.1     41.9±8.6 16     17.1±4.5*     30.9±4.5
17     17.4±1.6**     24.9±1.2 18     30.2±3.8     25.7±3.9
19     32.5±0.5     28.4±9.1 PTH 25.3±2.6#
21     20.7±1.1*     23.8±1.6     Contro1 15.4±1.3
    Elcitonin     18.4±0.7**
结论：二芳基庚酮类及木脂素类化合物的量虽然少，但是却具有极强的抑制骨吸收的活性，包括化合物2、3、4、5及6。甾体皂苷类化合物16、17及21也具有较强的抑制活性。其中化合物17占甾体皂苷总量的1/2左右，所以对化合物17进行了动物体内实验的研究。
5.主要活性成分化合物17的抗骨质疏松活性动物体内实验
实验方法：将50ddy未交配雌性小鼠，经适应性喂养1周后，进行双卵巢切除术或假手术，随机分成5组：(1)卵巢切除7周组(control组)：卵巢切除术后7周处死。(2)假手术组(sham组)：进行手术，但不摘出卵巢，7周后处死。(3)阳性对照组(positive control组)：卵巢切除术两周后经皮下注射给药0.1毫克/千克/天17β-es tradiol，用药5周后处死。(4)化合物17高剂量组(M-protod-50)：卵巢切除术2周后经胃肠道给药灌注化合物1750毫克/千克/天，用药5周后处死。(5)化合物17低剂量组(M-protod-20)：卵巢切除术2周后经胃肠道给药灌注化合物1720毫克/千克/天，用药5周后处死。所有动物处死前，麻醉状态下用外周肢体定量计算机断层扫描(pQCT)测量左侧胫骨近端干骺端生长板下及股骨远端1-5毫米范围内的松质骨、皮质骨和全骨，扫描4个断面，数据取自1-2毫米处断面。测量指标：全骨矿量(TOT-CNT，mg/mm)、全骨密度、全骨断面积、松质骨矿量、松质骨密度、皮质骨外膜周长、内膜周长、皮质骨矿量、皮质骨密度、皮质骨厚、抗压力、抗折力、抗扭力等。
实验结果：
(1)各实验组对小鼠胫骨近端全骨的影响
    组别 全骨骨矿含量   全骨骨密度 全骨骨面积
对照组假手术组阳性对照组M-protod-20M-protod-50   1.63±0.15#2.09±0.281.96±0.12**1.73±0.301.88±0.29* 413.87±36.26#571.23±107.35521.76±28.87**437.94±4 8.72491.19±63.17*   0.13±0.02#0.24±0.090.29±0.01**0.15±0.040.19±0.04*
#P＜0.001与伪手术组对照，*P＜0.05，**P＜0.001与对照组
对照
(2)各实验组对小鼠胫骨近端松质骨的影响
    组别   松质骨的骨矿含量   松质骨骨密度
 对照组假手术组阳性对照组M-protod-20M-protod-50     0.29±0.030.23±0.110.28±0.030.33±0.100.29±0.04     144.94±12.83#191.93±24.83177.59±23.59**161.15±14.16*165.72±16.10*
#p＜0.001与伪手术组对照，*p＜0.05，**p＜0.01，与对照组对照
(3)各实验组对小鼠胫骨近端皮质骨的影响
A.各实验组对小鼠胫骨近端皮质骨的内、外膜周长的影响
组别   皮质骨的外膜周长     皮质骨的内膜周长
 对照组假手术组阳性对照组M-protod-20M-protod-50     7.13±0.22#6.39±1.066.84±0.15**6.89±0.23*6.86±0.18**     6.25±0.33##5.64±0.455.54±0.22***5.93±0.64*5.66±0.30**
#p＜0.05，##p＜0.01与伪手术组对照，*p＜0.05，**p＜0.01，***
p＜0.001与对照组对照。
B.各实验组对小鼠胫骨近端皮质骨的骨矿含量、骨密度及皮质骨厚
度的影响
组别 皮质骨骨矿含量 皮质骨骨密度 皮质骨厚度
  对照组假手术组阳性对照组M-protod-20M-protod-50     0.84±0.25##1.28±0.231.24±0.09** *0.85±0.261.14±0.03*     873.18±25.98#948.93±82.00942.25±16.79***877.76±45.25931.51±32.69**     0.13±0.03##0.23±0.050.21±0.01** *0.15±0.040.19±0.04**
##p＜0.01与伪手术组对照，*p＜0.05，**p＜0.01与对照组对照。
(4)各实验组对小鼠胫骨近端骨强度的影响
    组别   X轴抗压力 Y轴抗折力 极轴抗扭力
 对照组假手术组阳性对照组M-protod-20M-protod-50     0.40±0.06#0.58±0.180.47±0.05*0.41±0.050.46±0.09     0.40±0.05#0.59±0.190.49±0.05*0.44±0.070.46±0.08     0.73±0.09#1.09±0.350.91±0.07**0.77±0.130.89±0.16*
#p＜0.05与伪手术组对照；*p＜0.05，**p＜0.01与对照组对照
结论：由以上的数据及分析显示，化合物17在小鼠OVX模型中，抑制了全骨的骨矿含量、骨密度和全骨断面面积的降低，松质骨骨密度的降低，皮质骨的内、外膜周长的增长，皮质骨骨矿含量、皮质骨厚度和皮质骨密度的下降及抗扭力的减弱，具有较强的抗骨质疏松作用。

Claims (10)

1.绵萆薢抗骨质疏松活性提取物，其特征在于：绵萆薢其原植物来源为薯蓣科绵萆薢Dioscorea spongiosa J.Q.Xi，M.Mizuno et W.L.Zhao、福州薯蓣Dioscorea futschauensis Uline ex R.Knuth和七裂叶萆薢Dioscorea septemloba Thunb.的提取物。
2.根据权利要求1所述的绵萆薢抗骨质疏松活性提取物，其特征在于：所述的提取物为绵萆薢水及醇的简单提取物或萃取物，或其通过大孔吸附树脂柱，经水-醇混合溶剂洗脱得到的不同比例水-醇混合溶剂洗脱物、绵萆薢总皂苷及从绵萆薢中提取的具有抗骨质疏松活性的其它提取物。
3.根据权利要求2所述的绵萆薢抗骨质疏松活性提取物，其特征在于：所述的抗骨质疏松活性成分指下列单体化合物：1：绵萆薢素A(diospongiisn A)；2：绵萆薢素B(diospongiisn B)；3：绵萆薢素C(diospongiisn C)；4：piperitol；5：sesaminone；6：(+)-syringaresinol；7：绵萆薢苷A(spongipregnoloside A)；8：绵萆薢苷C(spongipregnoloside C)；9：绵萆薢苷D(spongipregnolosideD)；10：spongiosides E；11：黄山药皂苷(dioscin)；12：pregna-5，16-diene-1β-o1-20-one-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranoside；13：薯蓣皂苷(dioscin)；14：prosapogenin A；15：gracillin；16：hypoglaucin G；17：methylprotodioscin；18：glycoside D；19：daucosterol；20：β-sitosterol；21：(R)-oct-1-ene-3-yl O-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-Glucopyranoside，上述单体化合物用于制备治疗抗骨质疏松症的药物。
4.根据权利要求2所述的绵萆薢活性提取物，其特征在于：所述的醇具有以下通式：CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜5)；在混合洗脱剂中，醇所占的百分含量在1％-95％之间。
5.根据权利要求2所述的绵萆薢活性提取物的提取工艺，其特征在于：所述的吸附树脂为苯乙烯类、苯丙酸类、丙稀酰胺类及氧化氮类大孔树脂中的任何一种，所述的绵萆薢总皂苷指来源于绵萆薢的提取物，在提取物中绵萆薢皂苷类成分的含量超过50％。
6.一种如权利要求1所述的绵萆薢抗骨质疏松活性提取物的提取工艺，其特征在于：以中药绵萆薢及新鲜采集的绵萆薢的干燥根茎为原料，采用溶剂提取法、溶剂萃取法、树脂吸附法、正相柱层析法、反相柱层析法得到的权利要求2所述的各种提取物。
7.根据权利要求5所述的中药绵萆薢抗骨质疏松活性提取物的提取工艺，其特征在于：所列的溶剂为不多于10个碳原子的卤代烷、醇、酮、酯、醚及其混合物，其中卤代烷具有以下通式：CnH2n+1R、CnH2nR2或CnH2n-1R3(n＜10；R＝Cl，Br，I)，醇类溶剂具有以下通式：CnH2n+1OH或CnH2n-1OH(n＜10)，酮类及醚类溶剂具有以下通式：CnH2nO或CnH2n-2O(n＜10)，酯类溶剂具有以下通式：CnH2nO2或CnH2n-2O2(n＜10)，溶剂洗脱方式包括单一溶剂的正相、反相及梯度洗脱。
8.根据权利要求7所述的中药绵萆薢抗骨质疏松活性提取物的提取工艺，其特征在于：绵萆薢抗骨质疏松活性成分是以中药绵萆薢及新鲜采集的绵萆薢的干燥根茎为原料，采用正相柱层析色谱法、反相柱层析色谱法，正相制备薄层层析法、反相制备薄层层析法，反复重结晶法，反相制备液相色谱法分离纯化得到的单体化合物。
9.根据权利要求8所述的绵萆薢抗骨质疏松活性成分的提取工艺，其特征在于：绵萆薢活性成分在柱层析过程中用到的柱色谱填料为硅胶、氧化铝、聚酰胺、吸附树脂、葡萄糖凝胶、ODS及硅藻土；制备薄层板的吸附剂为硅胶G、硅胶H、硅胶GF254、氧化铝、聚酰胺及ODS。
10.根据权利要求9所述的绵萆薢活性成分的提取工艺，其特征在于：绵萆薢活性成分在柱层析、薄层层析、重结晶及制备液相过程中用到的溶剂为权利要求7中所述的溶剂及其与水任何比例的混合溶剂，溶剂洗脱方式包括单一溶剂的正相、反相及梯度洗脱。
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