CN105130796B - 一种二萜类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种二萜类化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种二萜类化合物及其制备方法与应用，所述的二萜类化合物是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C20H30O3，命名为14‑氧‑对映‑8(9),15‑海松二烯酸(14‑oxo‑ent‑pimara‑8(9),15‑diene‑19‑oic acid)，具有下述结构式：。所述制备方法是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得。所述的应用为所述的二萜类化合物在制备预防和/或治疗抗炎药物中的应用。本发明所述的二萜类化合物进行了体外抗炎活性测试，实验结果显示出良好的抑制脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞(RAW264.7)产生一氧化氮(NO)的作用，可为医用工业提供有应用价值的新化合物或先导化合物。

Description

一种二萜类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种二萜类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
目前对急慢性炎症的治疗主要以抗生素、激素类药物为主，这些药物的治疗虽然能收到良好的效果，但因耐药菌株的不断增加，有越来越多的病例尽管用抗生素治疗，病情却得不到有效控制，而且抗生素在临床应用中产生副作用的病例是屡见不鲜。部分炎症疾病系病毒感染所致，抗生素基本无效。近年来，中外研究人员逐渐将目光投向资源丰富、纯天然的中草药、民族药，希望从中寻找新的抗炎药物。目前从中草药、民族药中发现了白芥子苷、阿魏酸、升麻苷、槲皮苷、苦参生物碱、大黄素、鱼腥草素、南蛇藤素等一系列天然抗炎药物。这些天然药物表现出的良好抗炎活性日益证明从天然产物中筛选抗炎药物是一个很有前景的方向。
黑果土当归 (Aralia dumetorum Hand.-Mazz) 系五加科 (Araliaceae) 楤木属植物，民间以其根入药，入脾、胃二经。该植物有补中益气、托毒外出、消炎的功效，用于淋巴腺炎、慢性化脓性骨髓炎和疖痈等症。该属植物化学成分主要含二萜、三萜皂苷、香豆素、黄酮、木脂素及甾醇。目前对黑果土当归植物化学成分以及药理活性的研究报道较少。本发明试图对黑果土当归中具有抗炎作用的化合物做深入研究，以期发现其中的抗炎活性天然产物，为筛选高效、低毒的抗炎药物提供依据。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种二萜类化合物；第二目的在于提供所述二萜类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述二萜类化合物的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的二萜类化合物是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C20H30O3，命名为14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸 (14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid)，具有下述结构式：
。
本发明的第二目的是这样实现的，是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将黑果土当归根晾干粉碎得到0.05~0.15cm粒径大小的颗粒，加入黑果土当归根重量比4~8倍的体积百分浓度80~95%乙醇溶液于65~74℃下回流提取3~5次，每次1~3h，合并提取液，提取液过滤，减压浓缩提取液至比重为1.1~1.3得到浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比2~4倍量的水，依次用与水等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂进行萃取，每种溶剂萃取4~6次，蒸去溶剂分别得到石油醚萃取物b、乙酸乙酯萃取物c和正丁醇萃取物d；
C、硅胶柱层析：
1）将石油醚萃取物b上硅胶柱，装柱硅胶为100~200目，用量为萃取物b重量6~8倍量；用体积比为25:1~0:1的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
2）将1）中以5:1配比的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液e上硅胶柱，装柱硅胶为200~300目，用量为洗脱液e体积6~8倍量；用体积比15:1~0:1的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂梯度洗脱、浓缩，经TLC检测，合并相同的部分；
D、高效液相色谱分离：将C步骤2）中以2:1配比的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液采用半制备高效液相色谱仪分离纯化，即得所述的二萜类化合物14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸 (14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid)。
本发明二萜类化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和其他波谱技术测定方法确定为二萜类化合物，并表征其具体结构为：
化合物14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸 (14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid)，为白色无定型粉末(溶剂为氯仿)，-14.8 (c 0.15,CHCl3); IR (KBr) 谱在3347, 1710, 1688, 1645 cm-1有吸收，表明分子中存在羧基、羟基和双键。HRESI-MS(附图1)显示其准分子离子峰m/z 317.2128 [M-H]- (calcd.317.2116)，结合NMR 谱确定其分子式为C20H30O3，不饱和度为6。1H NMR(附图2，数据归属见表1)显示分子中有3个甲基单峰，分别为δH 1.29 (3H, s), 1.16 (3H, s) 及0.99 (3H,s) )，有1个单取代双键信号（δ 6.04 (1H, dd, J = 17.6, 10.8 Hz, H-15), 5.07 (1H,d, J = 10.8 Hz, H-16a), 4.98 (1H, d, J = 17.6 Hz, H-16b)）; 13C NMR(附图3，数据归属见表1)显示分子中有20个碳，其中有7个季碳(含2个羰基碳和2个烯碳)，2个次甲基(含1个烯碳)，8个亚甲基(含1个烯碳)，及3个甲基。结合HSQC相关谱(附图4)，并对比文献数据可证实,该化合物与已知化合物7-oxo-13-epi-pimara-8,15-dien-18-oic acid结构相似,区别在于分子中的酮羰基(δC 203.5)连接在分子中的14位，而不是7位。进一步经HMBC相关(附图5)、COSY相关(附图6)和ROESY(附图7)及与文献(Chang L.C., Song L.L., ParkE.J., Luyengi L., Lee K.J., Farnsworth N.R., Pezzuto J.M., Kinghorn D.Bioactive constituents of Thuja occidentalis. Journal of Natural Products.2000,63(9): 1235-1238.) 对比证实，使化合物的结构最终得到确认，化合物具有下述结构式：
通过SCIFINDER数据库检索和文献查询证实该化合物为新化合物。
表1 本发明化合物的1H-和13C-NMR (CDCl3)数据
本发明的第三目的是这样实现的，所述的二萜类化合物在制备预防和/或治疗炎症药物中的应用。
本发明所述的二萜类化合物进行了体外抗炎活性测试，实验结果显示出良好的抑制脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞(RAW264.7)产生一氧化氮(NO)的作用，可为医用工业提供有应用价值的新化合物或先导化合物。
本发明的优点：
1、本发明中的二萜类化合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO有显著的抑制作用，提示其具有良好的抗炎活性，可以作为抗炎活性成分或先导化合物。
2、本发明中的二萜类化合物可为天然存在的有机化合物，原料来源广泛，并且化合物制备操作流程简单，所获得的化合物纯度高，随后的工业化生产易实现。
附图说明
图1是本发明化合物高分辨质谱（HRESI-MS)；
图2 是本发明化合物的核磁共振氢谱（1H NMR) ；
图3 是本发明化合物的核磁共振碳谱（13C NMR) ；
图4 是本发明化合物的HSQC相关谱；
图5是本发明化合物的HMBC相关谱；
图6 是本发明化合物的COSY相关谱；
图7 是本发明化合物的ROESY相关谱。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明所述的二萜类化合物，是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C20H30O3，命名为14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸 (14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid)，具有下述结构式：
。
本发明所述的二萜类化合物的制备方法，是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将黑果土当归根晾干粉碎得到0.05~0.15cm粒径大小的颗粒，加入黑果土当归根重量比4~8倍的体积百分浓度80~95%乙醇溶液于65~74℃下回流提取3~5次，每次1~3h，合并提取液，提取液过滤，减压浓缩提取液至比重为1.1~1.3得到浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比2~4倍量的水，依次用与水等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂进行萃取，每种溶剂萃取4~6次，蒸去溶剂分别得到石油醚萃取物b、乙酸乙酯萃取物c和正丁醇萃取物d；
C、硅胶柱层析：
1）将石油醚萃取物b上硅胶柱，装柱硅胶为100~200目，用量为萃取物b重量6~8倍量；用体积比为25:1~0:1的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
2）将1）中以5:1配比的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液e上硅胶柱，装柱硅胶为200~300目，用量为洗脱液e体积6~8倍量；用体积比15:1~0:1的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂梯度洗脱、浓缩，经TLC检测，合并相同的部分；
D、高效液相色谱分离：将C步骤2）中以2:1配比的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液采用半制备高效液相色谱仪分离纯化，即得所述的二萜类化合物14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸 (14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid)。
A步骤所述的过滤是经80~120μm的滤纸进行过滤。
A步骤所述的减压浓缩是在50℃以下的温度条件下用旋转蒸发仪进行减压浓缩。
B步骤中所述的蒸去溶剂是采用旋转蒸发仪蒸去溶剂。
C步骤1）中所述的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂的体积配比为25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1和0:1。
C步骤2）中所述的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂的体积配比为15:1、10:1、7:1、5:1、2:1和0:1。
D 将C步骤中以2:1配比的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液经半制备高效液相色谱，以体积配比为50:50的甲醇-水为流动相，流速2.5 ml/min， 250 ×10mm， 5 μm 的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210 nm，每次进样50μL，收集34~36min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到所述的二萜类化合物14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸(14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid)。
本发明的应用为所述的二萜类化合物在制备预防和/或治疗炎症药物中的应用。
所述的二萜类化合物在制备预防和/或治疗急慢性炎症药物中的应用。
下面以具体实施例对本发明做进一步说明：
实施例1 化合物的制备
材料来源：黑果土当归采于云南昆明，经云南民族大学民族医药学院杨青松副教授鉴定为Aralia dumetorum Hand.-Mazz，标本保存于云南民族大学民族医药学院标本馆。
采用以下步骤：
a.粉碎：将10Kg黑果土当归根晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，备用；
b.回流提取：将步骤a中制得的黑果土当归粉在65℃的温度下回流提取4次，每次2小时，每次用60Kg 80%浓度的乙醇提取，合并乙醇提取液，备用；
c、浓缩：将步骤b制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在 50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1380g，备用；
d、萃取：将1380g浸膏混悬于4500ml水中，依次用4500ml石油醚、4500ml乙酸乙酯以及4500ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪减压浓缩，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物390 g、112g、405g。
e. 分离:将步骤d中制得的石油醚萃取物（150g）经100-200 目硅胶柱色谱，用体积比25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为6.4g，Fr.2为6.5g，Fr.3为3.1g，Fr.4为16.1g，Fr.5为3.2g，Fr.6为60.8g，Fr.7为2.8g，Fr.8为39.3g，Fr.6 (10 g)经200-300 目硅胶柱色谱，用体积比15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.6-1-Fr.6-6共6个组分，，Fr.6-1为0.3g，Fr. 6-2为1.7g，Fr. 6-3为1.4g，Fr. 6-4为0.9g，Fr. 6-5为2.4g，Fr. 6-6为2.2g，Fr.6-5经半制备高效液相色谱仪制备，以体积配比为50:50的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min， 250 × 10mm， 5 μm 的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210 nm，每次进样50μL，收集34~36min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸 (14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid) (14 mg)。
实施例2 化合物的制备
采用以下步骤：
a.粉碎：将10Kg黑果土当归根晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，备用；
b.回流提取：将步骤a中制得的黑果土当归粉在67℃的温度下回流提取3次，每次2.5小时，每次用60Kg 84%浓度的乙醇提取，合并乙醇提取液，备用；
c、浓缩：将步骤b制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在 50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1340g，备用；
d、萃取：将1340g浸膏混悬于4000ml水中，依次用4000ml石油醚、4000ml乙酸乙酯以及4000ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取4次，再用旋转蒸发仪减压浓缩，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物372 g、103g、396g。
e. 分离:将步骤d中制得的石油醚萃取物（150g）经100-200 目硅胶柱色谱，用体积比25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为6.8g，Fr.2为6.9g，Fr.3为3.7g，Fr.4为17.3g，Fr.5为2.8g，Fr.6为58.2g，Fr.7为2.9g，Fr.8为37.0g，Fr.6 (10 g)经200-300 目硅胶柱色谱，用体积比15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.6-1-Fr.6-6共6个组分，Fr.6-1为0.3g，Fr. 6-2为1.8g，Fr. 6-3为1.2g，Fr. 6-4为0.7g，Fr. 6-5为2.3g，Fr. 6-6为2.4g，Fr.6-5经半制备高效液相色谱仪制备，以体积配比为50:50的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min， 250 ×10mm， 5 μm 的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210 nm，每次进样50μL，收集34~36min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸 (14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid) (15 mg)。
实施例3 化合物的制备
采用以下步骤：
a.粉碎：将10Kg黑果土当归根晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，备用；
b.回流提取：将步骤a中制得的黑果土当归粉在69℃的温度下回流提取5次，每次2小时，每次用60Kg 88%浓度的乙醇提取，合并乙醇提取液，备用；
c、浓缩：将步骤b制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在 50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1410g，备用；
d、萃取：将1410g浸膏混悬于4500ml水中，依次用4500ml石油醚、4500ml乙酸乙酯以及4500ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪减压浓缩，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物395 g、117g、411g。
e. 分离:将步骤d中制得的石油醚萃取物（150g）经100-200 目硅胶柱色谱，用体积比25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为7.2g，Fr.2为7.4g，Fr.3为3.9g，Fr.4为17.8g，Fr.5为3.1g，Fr.6为57.3g，Fr.7为3.2g，Fr.8为36.3g，Fr.6 (10 g)经200-300 目硅胶柱色谱，用体积比15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.6-1-Fr.6-6共6个组分，Fr.6-1为0.4g，Fr. 6-2为1.9g，Fr. 6-3为1.3g，Fr. 6-4为0.8g，Fr. 6-5为2.6g，Fr. 6-6为2.0g，Fr.6-5经半制备高效液相色谱仪制备，以体积配比为50:50的甲醇-水为流动相，流速2.5 ml/min， 250 × 10mm， 5 μm 的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210 nm，每次进样50μL，收集34~36min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸 (14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid) (18 mg)。
实施例4 化合物的制备
采用以下步骤：
a.粉碎：将10Kg黑果土当归根晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，备用；
b.回流提取：将步骤a中制得的黑果土当归粉在71℃的温度下回流提取4次，每次2小时，每次用60Kg 92%浓度的乙醇提取，合并乙醇提取液，备用；
c、浓缩：将步骤b制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在 50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1480g，备用；
d、萃取：将1480g浸膏混悬于5000ml水中，依次用5000ml石油醚、5000ml乙酸乙酯以及5000ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取6次，再用旋转蒸发仪减压浓缩，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物387 g、111g、408g。
e. 分离:将步骤d中制得的石油醚萃取物（150g）经100-200 目硅胶柱色谱，用体积比25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为7.5g，Fr.2为7.7g，Fr.3为4.2g，Fr.4为18.2g，Fr.5为3.2g，Fr.6为61.3g，Fr.7为3.3g，Fr.8为34.2g，Fr.6 (10 g)经200-300 目硅胶柱色谱，用体积比15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.6-1-Fr.6-6共6个组分，Fr.6-1为0.4g，Fr. 6-2为2.0g，Fr. 6-3为1.4g，Fr. 6-4为0.7g，Fr. 6-5为2.8g，Fr. 6-6为1.8g，Fr.6-5经半制备高效液相色谱仪制备，以体积配比为50:50的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min， 250 ×10mm， 5 μm 的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210 nm，每次进样50μL，收集34~36min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸 (14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid) (21 mg)。
实施例5 化合物的制备
采用以下步骤：
a.粉碎：将10Kg黑果土当归根晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，备用；
b.回流提取：将步骤a中制得的黑果土当归粉在74℃的温度下回流提取5次，每次2小时，每次用60Kg 95%浓度的乙醇提取，合并乙醇提取液，备用；
c、浓缩：将步骤b制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在 50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1520g，备用；
d、萃取：将1520g浸膏混悬于4500ml水中，依次用4500ml石油醚、4500ml乙酸乙酯以及4500ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪减压浓缩，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物420 g、130g、450g。
e. 分离:将步骤d中制得的石油醚萃取物（150g）经100-200 目硅胶柱色谱，用体积比25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为9.5g，Fr.2为8.8g，Fr.3为3.5g，Fr.4为18.0g，Fr.5为3.7g，Fr.6为65.3g，Fr.7为3.6g，Fr.8为35.3g，Fr.6 (10 g)经200-300 目硅胶柱色谱，用体积比15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.6-1-Fr.6-6共6个组分，Fr.6-1为0.5g，Fr. 6-2为2.1g，Fr. 6-3为1.2g，Fr. 6-4为0.6g，Fr. 6-5为3.1g，Fr. 6-6为1.4g，Fr.6-5经半制备高效液相色谱仪制备，以体积配比为50:50的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min， 250 × 10mm， 5 μm 的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210 nm，每次进样50μL，收集34~36 min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸 (14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid) (24 mg)。
实施例6 本发明化合物的结构鉴定
取实施例1制备的14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸 (14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid)，为白色无定型粉末（溶剂为氯仿）；测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。
-14.8 (c 0.15, CHCl3); IR (KBr) 谱在3347, 1710, 1688, 1645cm-1有吸收，表明分子中存在羧基、羟基和双键。HRESI-MS(附图1)显示其准分子离子峰m/z317.2128 [M-H]- (calcd. 317.2116)，结合NMR 谱确定其分子式为C20H30O3，不饱和度为6。1H NMR(附图2，数据归属见表1)显示分子中有3个甲基单峰，分别为δH 1.29 (3H, s),1.16 (3H, s) 及0.99 (3H, s) )，有1个单取代双键信号（δ 6.04 (1H, dd, J = 17.6,10.8 Hz, H-15), 5.07 (1H, d, J = 10.8 Hz, H-16a), 4.98 (1H, d, J = 17.6 Hz,H-16b)）; 13C NMR(附图3，数据归属见表1)显示分子中有20个碳，其中有7个季碳(含2个羰基碳和2个烯碳)，2个次甲基(含1个烯碳)，8个亚甲基(含1个烯碳)，及3个甲基。结合HSQC相关谱(附图4)，并对比文献数据可证实,该化合物与已知化合物7-oxo-13-epi-pimara-8,15-dien-18-oic acid结构相似,区别在于分子中的酮羰基(δC 203.5)连接在分子中的14位，而不是7位。进一步经HMBC相关(附图5)、COSY相关(附图6)和ROESY(附图7)及与文献(Chang L.C., Song L.L., Park E.J., Luyengi L., Lee K.J., Farnsworth N.R.,Pezzuto J.M., Kinghorn D. Bioactive constituents of Thuja occidentalis.Journal of Natural Products. 2000,63(9): 1235-1238.) 对比证实，使化合物的结构最终得到确认，命名为14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸 (14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid) 。
实施例7
取实施例2制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C20H30O3。确认实施例2制备的化合物为所述的二萜类化合物14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸 (14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid)。
实施例8
取实施例3制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C20H30O3。确认实施例3制备的化合物为所述的二萜类化合物14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸 (14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid)。
实施例9
取实施例4制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C20H30O3。确认实施例4制备的化合物为所述的二萜类化合物14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸 (14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid)。
实施例10
取实施例5制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C20H30O3。确认实施例5制备的化合物为所述的二萜类化合物14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸 (14-oxo-ent-pimara -8(9),15-diene-19-oic acid)。
实施例11 本发明化合物抗炎活性检测
取实施例1~5所制备的任一二萜类化合物进行抗炎活性检测试验，试验情况如下：
采用LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的筛选模型评价本发明化合物对NO生成的抑制作用：
(1) 试剂的配制：D-Hank’s缓冲溶液：称取NaCl 8.0 g、KCl 0.4 g、Na2HPO4•12H2O0.134 g、KH2PO4 0.06 g、NaHCO3 0.35 g、酚酞 0.02 g，加入超纯水约800 mL使全溶，调节PH至7.0-7.2，超纯水定容至1 L，过滤，分装，湿热(121 ºC、20 min)灭菌，4 ºC贮存备用。
PBS缓冲溶液：称取NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、KH2PO4 0.27 g、Na2HPO4•12H2O 3.58g，加入超纯水约800 mL使全溶，调节pH至7.2-7.4，超纯水定容至1 L，过滤，分装，湿热灭菌，4 ºC贮存备用。
胰酶：胰酶1.25 g、EDTA-Na2 0.1 g，用PBS缓冲溶液定容至500 mL,所有操作在冰上完成。
化合物母液：化合物以DMSO为溶剂配制成100 mmol/L的母液，-20 ºC贮存。
(2) 接种细胞：取处于对数生长期的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)，用含10%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，以8*104/孔接种于96孔板，每孔100μL，于恒温培养箱培养24h。
(3) 加入待检测化合物：实验分为空白组(DMSO+培养液)、LPS组(LPS+DMSO+培养液)、阳性药物组(L-NMMA+LPS+DMSO+培养液)和化合物组(不同剂量化合物+LPS+培养液)，化合物组分为100、25、6.25、1.56、0.39 μM五个剂量组；小心吸出残留培养液后，根据不同分组分别给予不同的试剂和培养液，总体积100 μL；每组设置3个复孔，各组DMSO含量均控制在1‰。继续培养24h。
(4) NO含量检测：小心吸取上清液50L，加入Griess I液50L，于摇床振摇10 min，再加入Griess II液50 μL，继续振摇10min，在全波长酶联免疫检测仪540 nm处读取吸光值，根据NO2 —含量标准曲线(按照Griess试剂盒说明书制作)计算出NO含量。运用IBM SPSSStatistics 21和GraphPad Prism 5对数据进行单因素方差分析、计算IC50等。
计算得本发明化合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的半数抑制浓度为8.9 ±1.6 µg/mL(阳性对照L-单甲基精氨酸(L-NMMA），IC50为3.3 ± 0.7 µg/mL)，表明本发明的化合物具有较好的抗炎活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种二萜类化合物制备方法，所述二萜类化合物的分子式为C20H30O3，命名为14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸，具有下述结构式：
其特征在于制备方法具体为：
A、浸膏提取：将黑果土当归根晾干粉碎得到0.05~0.15cm粒径大小的颗粒，加入黑果土当归根重量比4~8倍的体积百分浓度80~95%乙醇溶液于65~74℃下回流提取3~5次，每次1~3h，合并提取液，提取液过滤，减压浓缩提取液至比重为1.1~1.3得到浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比2~4倍量的水，依次用与水等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂进行萃取，每种溶剂萃取4~6次，蒸去溶剂分别得到石油醚萃取物b、乙酸乙酯萃取物c和正丁醇萃取物d；
C、硅胶柱层析：
1）将石油醚萃取物b上硅胶柱，装柱硅胶为100~200目，用量为萃取物b重量6~8倍量；用体积比为25:1~0:1的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
2）将1）中以5:1配比的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液e上硅胶柱，装柱硅胶为200~300目，用量为洗脱液e体积6~8倍量；用体积比15:1~0:1的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂梯度洗脱、浓缩，经TLC检测，合并相同的部分；
D、高效液相色谱分离：将C步骤2）中以2:1配比的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液采用半制备高效液相色谱仪分离纯化，即得所述的二萜类化合物14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸。
2.根据权利要求1所述二萜类化合物制备方法，其特征在于A步骤所述的过滤是经80~120μm的滤纸进行过滤。
3.根据权利要求1所述二萜类化合物制备方法，其特征在于A步骤所述的减压浓缩是在50℃以下的温度条件下用旋转蒸发仪进行减压浓缩。
4.根据权利要求1所述二萜类化合物制备方法，其特征在于B步骤中所述的蒸去溶剂是采用旋转蒸发仪蒸去溶剂。
5.根据权利要求1所述二萜类化合物制备方法，其特征在于C步骤1）中所述的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂的体积配比为25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1和0:1。
6.根据权利要求1所述二萜类化合物制备方法，其特征在于C步骤2）中所述的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂的体积配比为15:1、10:1、7:1、5:1、2:1和0:1。
7.根据权利要求1所述的二萜类化合物制备方法，其特征在于将C步骤中以2:1配比的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液经半制备高效液相色谱，以体积配比为50:50的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集34~36min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到所述的二萜类化合物14-氧-对映-8(9),15-海松二烯酸。
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