CN115820759B - 一种制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法 - Google Patents
一种制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115820759B CN115820759B CN202210879962.3A CN202210879962A CN115820759B CN 115820759 B CN115820759 B CN 115820759B CN 202210879962 A CN202210879962 A CN 202210879962A CN 115820759 B CN115820759 B CN 115820759B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enantiomer
- bjks
- mutant
- pimarane
- rose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种制备对映‑玫瑰烷和对映‑海松烷骨架化合物的方法。通过对来源于慢生型大豆根瘤菌的对映‑贝壳杉烯合成酶活性口袋的理性设计，获得首个能催化前体ent‑CPP合成目标产物的关键合成酶突变体BjKS‑F72Y，核苷酸序列如SEQ.IDNO1，氨基酸序列如SEQ.ID NO2，发生突变的氨基酸位点为第72位F突变为Y。最后在大肠杆菌中利用异源甲羟戊酸途径以及前体ent‑CPP合成模块，成功实现了由起始物质甘油到新型二萜类骨架化合物的“一步合成”。本发明为合成光学纯对映‑玫瑰烷和对映‑海松烷骨架化合物提供了新策略，也为发现新型萜类化合物、丰富萜类天然产物化合物库提供了重要的先导化合物资源。
Description
技术领域
本发明涉及合成生物学以及酶工程领域，尤其涉及一种制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法。
背景技术
对映-玫瑰烷(ent-rosane)和对映-海松烷(ent-pimarane)类化合物是代表性二萜天然产物亚群，含有特殊的6-6-6三环骨架结构，通过不同官能团修饰可产生多种生物活性，是小分子药物的重要来源之一。例如来源于大戟科植物的对映-玫瑰烷类天然产物euphominoid A-I对Epstein-Barr病毒具有抑制作用，euphominoid A-C(1-3)的EC50分别为13.20μM、5.40μM和24.40μM[Kemboi,D.；Siwe-Noundou,X.；Krause,R.W.M.；Langat,M.K.；Tembu,V.J.,Euphorbia Diterpenes:An Update of Isolation,Structure,Pharmacological Activities and Structure-Activity Relationship.Molecules(Basel,Switzerland)2021,26.]。从豨莶中提取到的一种对映-海松烷二萜化合物奇任醇具有很好的抗炎作用，来源于Siegesbeckia pubescens的化合物4对RANKL诱导的骨髓巨噬细胞(BMMs)破骨细胞的生成具有抑制作用[Sun,Z.；Zhang,Y.；Zhou,H.；Xu,J.；Gu,Q.,Diverse Diterpenoids and Sesquiterpenoids from Siegesbeckia Pubescens andTheir Activity against Rankl-Induced Osteoclastogenesis.Bioorganic Chemistry2021,107,104537.]。
2014年，中国科学院上海药物研究所果德安课题组采用了天然提取的方式从12kgAcanthopanax gracilistylus的根皮干粉中经半制备HPLC分离得到10mg化合物5[Wu,Z.-Y.；Zhang,Y.-B.；Zhu,K.-K.；Luo,C.；Zhang,J.-X.；Cheng,C.-R.；Feng,R.-H.；Yang,W.-Z.；Zeng,F.；Wang,Y.；Xu,P.-P.；Guo,J.-L.；Liu,X.；Guan,S.-H.；Guo,D.-A.,Anti-Inflammatory Diterpenoids from the Root Bark of AcanthopanaxGracilistylus.Journal of Natural Products 2014,77,2342-2351.]。2017年，中山大学顾琼课题组从3kg Euphorbia milii干粉中经制备HPLC分离得到500mg化合物1、400mg化合物2和15mg化合物3等[Kemboi,D.；Siwe-Noundou,X.；Krause,R.W.M.；Langat,M.K.；Tembu,V.J.,Euphorbia Diterpenes:An Update of Isolation,Structure,PharmacologicalActivities and Structure-Activity Relationship.Molecules(Basel,Switzerland)2021,26.]。然而，植物提取的方式分离纯化步骤繁琐、总收率低、提取成本高且极易造成环境的破环，难以可持续。众所周知，萜类天然产物合成的难点主要在于复杂的环系结构、多手性中心和高氧化态等，为解决这些问题，有机合成化学家们则通过从已知天然产物出发，采用半合成方法获得对映-海松烷类化合物。2004年，韩国国立首尔大学Kim课题组从acanthoic酸出发，通过LAH还原羧酸、TPAP氧化一级羟基、Wittig成烯反应和酯水解反应制备了具有ent-pimara-9(11),15-diene骨架的衍生物6[Suh,Y.G.；Lee,K.O.；Moon,S.H.；Seo,S.Y.；Lee,Y.S.；Kim,S.H.；Paek,S.M.；Kim,Y.H.；Lee,Y.S.；Jeong,J.M.；Lee,S.J.；Kim,S.G.,Synthesis and Anti-Inflammatory Effects of Novel PimaraneDiterpenoid Analogs.Bioorganic&medicinal chemistry letters 2004,14,3487-3490.]；2019年，北京大学付宏征课题组从另一对映-海松烷类天然产物奇任醇出发，通过双羟基保护、环氧化、酸促环化三步化学反应分别以21％、20％的收率得到衍生化合物7和8[Wang,J.；Wu,M.；Gao,C.；Fu,H.,Semisynthesis of Epoxy-Pimarane Diterpenoids fromKirenol and Their Fxa Inhibition Activities.Bioorganic&medicinal chemistry2019,27,1320-1326.]。
近来，随着萜类天然产物生物合成途径的不断解析以及酶定向进化技术的发展，为深入研究萜类化合物的生物合成和工业生产奠定了重要基础。基于廉价原料为底物设计高效的生物合成策略制备萜类骨架(母核)，进而，通过对这些母核分子的羟基化、环氧化、糖基化以及卤化等多种修饰作用，形成种类丰富的生物活性物质，可以有效弥补有机合成化学在复杂天然产物类药物生产方面的不足，实现化学合成与生物合成的强强联合。然而，由于关键的天然合成酶尚未被发现，对映-玫瑰烷以及对映-海松烷骨架化合物的生物合成方法至今未能攻克，无相关研究报道。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，通过提供一类对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物、其关键合成酶以及化合物的微生物异源合成方法，旨在解决目前无法生物合成两类目标骨架化合物的问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，其中，所述骨架化合物由对映-贝壳杉烯合成酶的突变体BjKS-F72Y催化ent-CPP生成；所述突变体BjKS-F72Y的核苷酸序列如SEQ.ID NO 1所示，氨基酸序列如SEQ.ID NO 2所示，所述突变体发生突变的氨基酸位点为第72位的F突变为Y。
所述的制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，其中，所述对映-玫瑰烷骨架化合物ent-rosa-5(10),15-diene，以及对映-海松烷骨架化合物
ent-pimara-8(9),15-diene，其结构式如下所示：
所述的制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，其中，所述方法包括步骤：
构建BjKS突变模板质粒；
构建BjKS突变体重组质粒；
构建含有甲羟戊酸途径及FPP合成酶的重组质粒；
筛选BjKS突变体，得到突变体BjKS-F72Y；
利用突变体BjKS-F72Y进行对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的异源生物合成；
产物结构鉴定。
所述的制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，其中，构建BjKS突变模板质粒的具体步骤为：将来源于慢生型大豆根瘤菌的对映-贝壳杉烯合成酶基因BjKS与来源于链霉菌的ent-CPP合成酶基因PtmT2共同克隆至质粒pETDuet-1的MCS2上，来源于酵母的GGPP合成酶基因BTS1克隆到质粒pETDuet-1的MCS1上，即获得BjKS突变模板质粒pETDuet-BTS1-PtmT2-BjKS。
所述的制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，其中，选择对映-贝壳杉烯合成酶活性口袋的六个氨基酸残基L71、F72、Y136、L140、A167和V171进行突变，构建BjKS突变体重组质粒。
所述的制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，其中，筛选BjKS突变体的具体步骤为：将含有甲羟戊酸途径及FPP合成酶的重组质粒pACYCDuet-T1B1-ERG20和BjKS突变体重组质粒pETDuet-BTS1-PtmT2-BjKS共转到大肠杆菌BL21(DE3)中，经过含氯霉素和氨苄青霉素的双抗平板筛选，得到重组菌株，利用所述重组菌株进行异源生物合成对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的筛选。
所述的制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，其中，通过GC-MS分析BjKS突变体重组菌株异源生物合成的产物的分布情况并进行筛选。
所述的制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，其中，在产物结构鉴定之前，还包括步骤：利用硼氢化氧化反应将突变体BjKS-F72Y异源生物合成的对映-玫瑰烷类和对映海松烷骨架化合物进行衍生化反应。
一种对映-贝壳杉烯合成酶突变体，其中，所述突变体BjKS-F72Y的核苷酸序列如SEQ.ID NO 1所示，所述突变体BjKS-F72Y催化ent-CPP产生对映-贝壳杉烯、化合物ent-rosa-5(10),15-diene以及化合物ent-pimara-8(9),15-diene。
一种对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物，其中，所述骨架化合物如上任一所述的方法制备而来，或由如上所述的对映-贝壳杉烯合成酶突变体BjKS-F72Y催化ent-CPP得到；所述对映-玫瑰烷骨架化合物ent-rosa-5(10),15-diene以及对映-海松烷骨架化合物ent-pimara-8(9),15-diene结构式如下所示：
有益效果：本发明首次提供了一种制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的生物合成方法。通过对来源于慢生型大豆根瘤菌对映-贝壳杉烯合成酶活性口袋的改造，获得首个能催化前体ent-CPP合成对映-玫瑰烷骨架化合物ent-rosa-5(10),15-diene以及对映-海松烷骨架化合物ent-pimara-8(9),15-diene的突变体BjKS-F72Y，进一步通过微生物异源合成系统，实现了由起始物质甘油到新型二萜类骨架化合物的“一步合成”。与现有技术相比，本发明为合成光学纯对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物提供了新策略，也为发现新型萜类化合物、丰富萜类天然产物化合物库提供了重要的先导化合物资源。此外，本发明也为对映-贝壳杉烯合成酶的进一步改造提供了新的信息，对其他萜类环化酶的改造具有借鉴意义。
附图说明
图1为本发明实施例提供的BjKS-F72Y突变体催化ent-CPP反应的过程以及产物示意图。
图2为本发明实施例提供的对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的异源生物合成体系示意图。
图3为本发明实施例提供的BjKS突变体在大肠杆菌体内催化ent-CPP反应的产物分布示意图。
图4为本发明实施例提供的BjKS-F72Y突变体在大肠杆菌体内催化ent-CPP反应的GC-MS分析结果示意图。
图5为本发明实施例中衍生化产物的HPLC分析结果示意图。
图6为本发明实施例中对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的结构及相关化学转化。
图7为本发明实施例中化合物9的核磁共振氢谱图。
图8为本发明实施例中化合物9的核磁共振碳谱图。
图9为本发明实施例中化合物9的核磁共振DEPT135谱图。
图10为本发明实施例中化合物9的核磁共振COSY谱图。
图11为本发明实施例中化合物9的核磁共振NOESY谱图。
图12为本发明实施例中化合物9的核磁共振HMBC谱图。
图13为本发明实施例中化合物9的核磁共振HSQC谱图。
图14为本发明实施例中化合物10的核磁共振氢谱图。
图15为本发明实施例中化合物10的核磁共振碳谱图。
图16为本发明实施例中化合物10的核磁共振DEPT135谱图。
图17为本发明实施例中化合物10的核磁共振COSY谱图。
图18为本发明实施例中化合物10的核磁共振NOESY谱图。
图19为本发明实施例中化合物10的核磁共振HMBC谱图。
图20为本发明实施例中化合物10的核磁共振HSQC谱图。
图21为本发明实施例中化合物11的核磁共振氢谱图。
图22为本发明实施例中化合物11的核磁共振碳谱图。
图23为本发明实施例中化合物12的核磁共振氢谱图。
图24为本发明实施例中化合物12的核磁共振碳谱图。
具体实施方式
本发明提供一种制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，所述骨架化合物由对映-贝壳杉烯合成酶的突变体BjKS-F72Y催化ent-CPP(ent-copalyldiphosphate，对映-柯巴基焦磷酸)生成；所述突变体BjKS-F72Y的核苷酸序列如SEQ.ID NO 1所示，氨基酸序列如SEQ.ID NO 2所示。
突变体BjKS-F72Y是在野生型BjKS的基础上，选择对映-贝壳杉烯合成酶活性口袋的氨基酸残基F72进行突变，发生突变的氨基酸位点为第72位的F突变为Y。
在一些实施方式中，对映-玫瑰烷骨架化合物ent-rosa-5(10),15-diene以及对映-海松烷骨架化合物ent-pimara-8(9),15-diene的结构式如下所示：
本发明实施例通过对来源于慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的对映-贝壳杉烯合成酶(BjKS)活性口袋中多个位点的突变，找到一种或多种能催化底物ent-CPP生产新的产物的突变体。通过以大肠杆菌为底盘的异源生物合成，野生型BjKS可以催化ent-CPP生成大量对映-贝壳杉烯。针对异源合成其他二萜类化合物的需求，通过对所选突变位点的筛选，本发明提供了一种对映-贝壳杉烯合成酶的突变体BjKS-F72Y，如图1所示，该突变体除了能催化ent-CPP生成对映-贝壳杉烯外，还能有效地生成新的化合物ent-rosa-5(10),15-diene和ent-pimara-8(9),15-diene，这两个化合物分别为对映-玫瑰烷和对映-海松烷类天然产物的关键骨架。
在一些实施方式中，所述的制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法包括步骤：
S10、构建BjKS突变模板质粒；
S20、构建BjKS突变体重组质粒；
S30、构建含有甲羟戊酸途径及FPP合成酶的重组质粒；
S40、筛选BjKS突变体，得到突变体BjKS-F72Y；
S50、利用突变体BjKS-F72Y进行对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的异源生物合成；
S60、产物结构鉴定。
在一些实施方式中，步骤S10构建BjKS突变模板质粒的具体步骤为：将来源于慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的对映-贝壳杉烯合成酶基因(BjKS)与来源于链霉菌(Streptomyces platensis)的ent-CPP合成酶基因(PtmT2)共同克隆至pETDuet-1的MCS2上，来源于酵母的GGPP合成酶基因BTS1被克隆到pETDuet-1的MCS1上，即获得突变模板质粒pETDuet-BTS1-PtmT2-BjKS。
在一些实施方式中，步骤S20中，选择对映-贝壳杉烯合成酶活性口袋附近的六个氨基酸残基L71、F72、Y136、L140、A167和V171进行突变，利用重叠延伸PCR技术进行定点突变，构建BjKS突变体重组质粒。
在一些实施方式中，步骤S30中，将甲羟戊酸途径(MVA pathway)的基因分为两个操纵子，第一个操纵子将乙酰辅酶A(acetyl-CoA)转化为甲羟戊酸(MVA)，第二个操纵子将MVA转化为IPP和DMAPP，DMAPP和IPP经FPP合成酶ERG20催化形成FPP(如图2所示)。具体的，第一个合成操纵子包括来源于大肠杆菌(E.coli)的乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因(atoB)、来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的HMG-CoA合成酶基因(mvaS)和截短的HMG-CoA还原酶基因(mvaA)；第二个合成操纵子包括来源于肺炎双球菌(Streptococcuspneumoniae)的甲羟戊酸激酶基因(mvaK1)、磷酸甲羟戊酸激酶基因(mvaK2)、磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因(mvaD)和异戊烯基焦磷酸异构酶基因(fni)。这些甲羟戊酸合成途径的基因(简写为T1B1)和来源于酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FPP合成酶基因(ERG20)，分别被克隆到pACYCDuet-1的两个多克隆位点(multiple cloning site，MCS)上，即获得含有甲羟戊酸途径及FPP合成酶的重组质粒pACYCDuet-T1B1-ERG20。
在一些实施方式中，步骤S40中，筛选BjKS突变体的具体步骤为：将含有甲羟戊酸途径及FPP合成酶的重组质粒pACYCDuet-T1B1-ERG20和BjKS突变体重组质粒pETDuet-BTS1-PtmT2-BjKS共转到大肠杆菌BL21(DE3)中，经过含氯霉素和氨苄青霉素的双抗平板筛选，得到重组菌株，利用所述重组菌株进行异源生物合成对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的筛选。
具体的，通过GC-MS分析BjKS突变体重组菌株异源生物合成的产物的分布情况并进行筛选。通过野生型BjKS和各突变体气相色谱峰的积分面积比例分析各产物的分布情况，GC-MS分析结果显示突变体F72Y催化底物主要生成了三个产物：对映-贝壳杉烯、化合物A、化合物B，而野生型BjKS或其他突变体仅生成了对映-贝壳杉烯及少量其他产物(其他产物在野生型BjKS和所有突变体反应中普遍存在)，或底物ent-CPP中焦磷酸基团离去形成ent-copalol(如图3所示)。因此，筛选得到突变体BjKS-F72Y进行下一步操作。
在一些实施方式中，利用突变体BjKS-F72Y进行对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的异源生物合成。GC-MS显示含有BjKS-F72Y的突变菌株能够催化ent-CPP合成保留时间分别为21.96min、22.93min和28.08min的对映-玫瑰烷类化合物、对映海松烷类化合物和对映-贝壳杉烯，其占比分别是28.0％、26.2％和45.8％(如图4所示)。本发明实施例成功以廉价甘油为起始底物合成了目标对映-玫瑰烷类和对映海松烷类化合物。
在一些实施方式中，步骤S50之前还包括步骤：利用硼氢化氧化反应将突变体BjKS-F72Y异源生物合成的对映-玫瑰烷类和对映海松烷骨架化合物进行衍生化反应。
为了确定对映-玫瑰烷类和对映海松烷类化合物的结构，本发明实施例首先利用硼氢化氧化反应，对突变体F72Y催化底物生成的三个产物的混合物进行衍生化以增加极性，反应式如下：
由于衍生化产物的极性增加，因此可以使用反相半制备HPLC进行分离纯化(结果如图5所示)，使用半制备HPLC对得到的三个衍生化产物进行分离，对化合物9和10进行核磁分析。
本发明实施例还提供一种对映-贝壳杉烯合成酶突变体，所述突变体BjKS-F72Y的核苷酸序列如SEQ.ID NO 1所示，所述突变体BjKS-F72Y催化ent-CPP产生对映-贝壳杉烯、化合物ent-rosa-5(10),15-diene以及化合物ent-pimara-8(9),15-diene。
本发明实施例还提供一种对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物，所述骨架化合物如上任一所述的方法制备而来，或由如上所述的对映-贝壳杉烯合成酶突变体BjKS-F72Y催化ent-CPP得到；所述对映-玫瑰烷骨架化合物ent-rosa-5(10),15-diene以及对映-海松烷骨架化合物ent-pimara-8(9),15-diene结构式如下所示：
本发明实施例公开的一种对映-贝壳杉烯合成酶的突变体，以生产对映-玫瑰烷和对映-海松烷类二萜骨架。本发明基于该对映-贝壳杉烯合成酶的晶体结构，考虑其活性口袋中不同位点氨基酸残基的改变可能对底物折叠、环化和淬灭方式等的影响，利用合成生物学手段研究突变体催化底物ent-CPP所生成的产物，这些产物的生成有助于对映-玫瑰烷和对映海松烷类天然产物的异源合成。本发明实施例为对映-贝壳杉烯合成酶的进一步改造提供了新的信息，对其他萜类环化酶的改造具有一定的借鉴作用。
下面通过具体实施例对本发明一种制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法做进一步的解释说明：
实施例1：BjKS突变模板质粒的构建
对来源于慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的对映-贝壳杉烯合成酶基因(BjKS)，使用DNAMAN软件设计，在不改变原有基因所编码的氨基酸序列(Uniprot号为Q45222)，根据E.coli的偏好性对密码子进行优化并调整G+C含量，优化的基因序列交由商业公司合成。与来源于链霉菌(Streptomyces platensis)的ent-CPP合成酶基因(PtmT2)共同克隆至pETDuet-1的MCS2上，来源于酵母的GGPP合成酶基因BTS1被克隆到pETDuet-1的MCS1上，即获得突变模板质粒pETDuet-BTS1-PtmT2-BjKS。
实施例2：BjKS突变体重组质粒的构建
选取BjKS活性口袋附近六个氨基酸残基(L71、F72、Y136、L140、A167和V171)，利用重叠延伸PCR技术进行定点突变。以野生型pETDuet-BTS1-PtmT2-BjKS质粒为模板，配制如下PCR反应体系(50μL体系，冰上操作)：约1ng模板DNA(野生型BjKS)、2.5μL 10μM正向引物、2.5μL 10μM反向引物、25μLHot Start High-Fidelity 2×Master Mix和适量ddH2O(补齐至50μL)。各组分混合完毕后快速离心，采用如下PCR程序：(1)98℃预变性30s，(2)98℃变性10s，(3)退火20s，(4)72℃延伸5min，(5)步骤(2)-(4)循环30次，(6)72℃彻底延伸2min，(7)4℃保存，其中退火温度参照Tm Calculator(NEB)计算结果，利用琼脂糖(1％)凝胶电泳对PCR产物进行分离纯化。通过同源重组来获得目标点突变质粒，重组反应体系(20μL)如下：4μL 5×CE MultiS buffer、PCR产物(20-200ng)、2μL Exnase MultiS和适量ddH2O(补齐至20μL)。
将重组反应产物分别转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。具体过程如下：从-80℃冰箱取出DH5α感受态细胞并置于冰上缓慢融化后，立即加入5μL重组产物，轻轻混匀后冰上放置30min，然后置于42℃水浴锅中热激90s，再冰浴2min。在无菌条件下加入600μL LB液体培养基，在37℃，220rpm的摇床中培养50min使细菌复苏，然后离心1min(5000rpm)，弃上清，用残留的液体将菌体重悬，均匀涂布到含有氨苄青霉素(工作浓度100mg/L)的LB固体培养基上，晾干后，用封口膜密封，平板倒置于37℃培养箱中过夜培养。
次日挑取单克隆接种至5mL含相应抗生素的LB培养基中，于37℃，220rpm的摇床中培养约10h后提取质粒。质粒提取的具体过程参照Omega公司的质粒提取试剂盒(PlasmidMini Kit I D6943)的使用说明书，质粒送商业公司测序，测序正确的质粒置于-20℃冰箱备用。
实施例3：含有甲羟戊酸途径及FPP合成酶重组质粒的构建
本实施例将甲羟戊酸途径(MVA pathway)的基因分为两个操纵子，第一个操纵子将乙酰辅酶A(acetyl-CoA)转化为甲羟戊酸(MVA)，第二个操纵子将MVA转化为IPP和DMAPP，DMAPP和IPP经FPP合成酶ERG20催化形成FPP(图2)。具体的，第一个合成操纵子包括来源于大肠杆菌(E.coli)的乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因(atoB)、来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的HMG-CoA合成酶基因(mvaS)和截短的HMG-CoA还原酶基因(mvaA)；第二个合成操纵子包括来源于肺炎双球菌(Streptococcus pneumoniae)的甲羟戊酸激酶基因(mvaK1)、磷酸甲羟戊酸激酶基因(mvaK2)、磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因(mvaD)和异戊烯基焦磷酸异构酶基因(fni)。这些甲羟戊酸合成途径的基因(简写为T1B1)和来源于酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FPP合成酶基因(ERG20)，分别被克隆到pACYCDuet-1的两个多克隆位点(multiple cloning site，MCS)上，即获得质粒pACYCDuet-T1B1-ERG20。
实施例4:BjKS突变体的筛选及产物分布
经测序正确的质粒pETDuet-BTS1-PtmT2-BjKS(野生型或突变体)和pACYCDuet-T1B1-ERG20共转到感受态细胞BL21(DE3)中，其转化方法同实施例1，不同的是将复苏后的菌液均匀涂布于含有氯霉素和氨苄青霉素的双抗LB固体培养板上，37℃培养箱过夜培养筛选得到的单克隆即可用于异源生物合成对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的筛选。
将重组菌株接种至含34mg/L氯霉素和50mg/L氨苄青霉素的1mL LB液体培养基中，在37℃，220rpm的摇床中培养6h后，再接种到含有17mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的30mL AM培养基中，于37℃，220rpm的摇床中培养至OD600约0.6-0.8，于冰水中冷却30min后，加入IPIG(工作浓度0.1mM)诱导，并加入3mL十二烷作为覆盖相。在25℃，180rpm的条件下诱导培养72h后，取100μL菌液，用900μL AM培养基稀释，检测其OD600值。剩余菌液离心(4℃，20000rpm，30min)，取1mL上层有机相(十二烷层)用于GC-MS检测。实验组和对照组同时进行且培养条件相同，实验组和对照组至少重复三次，结果以平均值±标准偏差的形式表示。通过野生型BjKS和各突变体气相色谱峰的积分面积比例分析各产物的分布情况。GC-MS分析结果显示突变体F72Y催化底物主要生成了三个产物：对映-贝壳杉烯、化合物A、化合物B，而野生型BjKS或其他突变体仅生成了对映-贝壳杉烯及少量其他产物(其他产物在野生型BjKS和所有突变体反应中普遍存在)，或底物ent-CPP中焦磷酸基团离去形成ent-copalol(图3)。AM培养基配制方法：将酵母提取物5g/L，甘油30g/L，(NH4)2SO4 2.0g/L，柠檬酸1.7g/L，KH2PO4 4.2g/L，K2HPO4·3H2O 15.7g/L，EDTA 8.4mg/L溶解去离子水中，并在121℃条件下高压灭菌20min，然后在无菌条件下分别加入无菌MgSO4·7H2O(1M)5mL/L，维生素B1(4.5g/L)1mL/L，batch trace metal solution 10mL/L，并用10mol/LNaOH调节pH值至7.0。MgSO4·7H2O和维生素B1的母液均用0.22μm的一次性针头过滤器过滤除菌。Batch tracemetal solution配制方法如下：将0.25g CoCl2·6H2O、1.5g MnCl2·4H2O、0.15g CuCl2·2H2O、0.3g H3BO3、0.25g Na2MoO4·2H2O、1.3gZn(CHCOO)2·2H2O以及10g Ferric citrate依次溶解到适量1mol/L盐酸中，用1mol/L盐酸定容至1L，最后经121℃高压蒸汽灭菌。
实施例5：对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物异源生物合成
为了制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷类化合物，将含有可使甘油转化为FPP的质粒1：pACYCDuet-T1B1-ERG20和可使FPP转化为目标二萜化合物的质粒2：pETDuet-BTS1-PtmT2-BjKS-F72Y的重组菌株接种至含17mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的1L*5AM培养基中，大约培养3h后，测得OD600约0.6-0.8，置于冰水中冷却30min后，加入IPIG(工作浓度0.1mM)，各加入200mL正辛烷作为上层覆盖相。在25℃，180rpm条件下诱导培养3天后，离心(4℃，7000rpm，30min)并收集有机相，用旋转蒸发仪除去正辛烷后得到粗产物。以正己烷为洗脱剂对粗产品进行柱层析分离得到115毫克产物混合物。GC-MS显示含有BjKS-F72Y的突变菌株能够催化ent-CPP合成保留时间分别为21.96min、22.93min和28.08min的对映-玫瑰烷类化合物、对映海松烷类化合物和对映-贝壳杉烯，其占比分别是28.0％、26.2％和45.8％(图4)。本实施例成功以廉价原料甘油为起始底物合成了目标对映-玫瑰烷类和对映海松烷类化合物。
本实施例采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测对映-玫瑰烷和对映-海松烷类化合物。使用的是日本Shimadzu公司生产的GCMS-QP2020 NX(其中GC体系采用GC-2030系列)，气相色谱仪中装备型号为SH-Rxi-5Sil(30m×0.25mm×0.25mm)的柱子。以氦气作为载气，流速为1mL/min。采用不分流模式进样，进样口温度为250℃，升温程序：起始温度设为80℃，按升温速率8℃/min升温至160℃，停留1min；按升温速率2℃/min升温至170℃，停留1min；按升温速率1℃/min升温至179℃，停留4min；按升温速率0.5℃/min升温至185℃，停留2min；按升温速率1℃/min升温至190℃，停留0min；最后，按升温速率8℃/min升温至260℃，停留3min，进样体积为1μL。
实施例6：对映-玫瑰烷类和对映海松烷骨架化合物的衍生化反应
为了确定对映-玫瑰烷类和对映海松烷类化合物的结构，本发明实施例首先利用硼氢化氧化反应三者的混合物进行衍生化以增加极性，反应式如下：
在0℃条件下，BH3·Me2S(0.36mL，0.72mmol，2equiv.，2M in THF)滴加到纯化后的BjKS-F72Y的催化产物(98mg，0.36mmol，1equiv.)的四氢呋喃(2mL)溶液中，然后反应体系自然升温，并在室温下继续反应8h。TLC监测反应体系，待底物反应完全，反应体系转移至冰水浴中，在0℃下缓慢滴加甲醇并搅拌0.5h，减压浓缩后得到的粗产品重新用四氢呋喃溶解，加入NaOH(4mL，12mmol，33equiv.，3M in H2O)和H2O2(4mL，30％w/w in H2O)，在室温下搅拌8h后，加入Na2S2O3溶液，乙酸乙酯萃取三次，用饱和食盐水洗涤有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤之后，减压浓缩，经柱层析分离纯化(hexane/EtOAc＝15/1)得到73mg(0.25mmol，70％)白色固体。由于衍生化产物的极性增加，因此可以使用反相半制备HPLC进行分离纯化(结果如图5所示)，使用半制备HPLC对得到的三个衍生化产物进行分离，对化合物9和10进行核磁分析。
化合物9：白色针状固体。TLC:Rf＝0.46(hexane/EtOAc＝9/1),PMA stain.[α]D 26.3＝47.88(c＝0.52,CHCl3).1H NMR(500MHz,CDCl3)δ3.74(m,2H),2.02(m,2H),1.88(m,2H),1.59(m,2H),1.51(d,J＝3.3Hz,2H),1.46(m,2H),1.41(m,2H),1.33(m,2H),1.28(d,J＝6.1Hz,2H),1.23(dd,J＝6.1,3.0Hz,2H),1.05(m,1H),0.96(s,3H),0.95(s,3H),0.95(s,3H),0.82(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ136.56,133.29,59.58,49.14,41.14,39.95,37.81,37.54,34.06,32.75,31.83,29.12,27.94,26.08,25.45,25.33,23.58,20.00,17.15.IR(KBr,cm–1)3615,3312,2964,2921,2868,2846,2358,2342,2330,1469,1452,1433,1380,1359,1262,1045,1028,988.HRMS-ESI(m/z):[M+H]+calculated for C20H35O+,291.2682；found,291.2682.
化合物10：无色油状。TLC:Rf＝0.46(hexane/EtOAc＝9/1),PMA stain.[α]D 27.0＝-32.91(c＝0.55,CHCl3).1H NMR(500MHz,CDCl3)δ3.81-3.70(m,1H),1.95-1.86(m,2H),1.74(dd,J＝19.7,8.4Hz,1H),1.68-1.56(m,1H),1.53-1.48(m,2H),1.46-1.37(m,2H),1.28-1.24(m,2H),1.14(dt,J＝12.5,6.1Hz,1H),1.02(td,J＝13.0,3.6Hz,1H),0.95(s,2H),0.88(s,2H),0.84(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ136.82,124.33,77.41,52.00,46.34,43.54,41.99,37.67,36.81,34.89,33.44,33.38,32.85,30.79,23.19,21.82,20.73,19.56,19.16,19.08.IR(KBr,cm–1)2954,2924,2854,2359,2307,1749,1459,1377,1261,1146,1024,962.808.HRMS-ESI(m/z):[M+H]+calculated for C20H35O+,291.2682；found,291.2683.
本实施例采用高效液相色谱分离纯化衍生化产物9和10。使用日本Shimadzu公司生产的HPLC Dionex UltiMate 3000，使用的色谱柱为Agilent公司生产的C18色谱柱，型号为ZORBAX Eclipse XDB-C18(5μm，9.4×250mm)。采用梯度洗脱的方式分离纯化衍生物，水和甲醇作为流动相，流速为1mL/min，检测器波长为200nm，流动相A为水，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序：20％甲醇洗脱2min；2-15min甲醇浓度升至100％，并保持30min；45-46min甲醇浓度降至20％，并保持3min。
实施例7：对映-玫瑰烷类产物的结构鉴定
对于催化产物A的结构鉴定，其衍生物9的核磁数据(1H、13C、2D NMR)、旋光数据等显示衍生物9的结构如图6所示。
表1本实施例合成与文献报道的化合物9的核磁数据
化合物9中的一级羟基进一步消除，可以得到化合物11，即ent-rosa-5(10),15-diene(图6)。具体如下：将o-NO2PhSeCN(17.8mg，0.078mmol，3.0equiv.)加入到9(7.6mg，0.026mmol，1.0equiv.)的四氢呋喃(0.5mL)溶液中，反应体系变为橘黄色，然后将n-Bu3P(19.5μL，0.078mmol，3.0equiv.)滴加到反应体系中，反应液变为深红色，随后在室温下反应7h。反应结束后，反应体系移至0℃，并小心加入H2O2(91μL，30％w/w in H2O)。随后，反应体系缓慢升温，并在室温下反应18h后，以正己烷为洗脱剂，反应液直接进行柱层析分离纯化，得到无色油状的化合物11(2.5mg，0.009mmol，40％)。GC-MS显示化合物11与BjKS-F72Y突变体催化ent-CPP生成的产物A的GC保留时间和质谱碎片峰一致。
综上，目标对映-玫瑰烷类产物为ent-rosa-5(10),15-diene(11)。
TLC:Rf＝0.95(hexane),PMA stain.[α]D 25.7＝43.67(c＝0.3,CHCl3).1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.83(dd,J＝17.5,10.7Hz,1H),4.92(dd,J＝17.5,1.4Hz,1H),4.84(dd,J＝10.7,1.4Hz,1H),2.13–1.86(m,4H),1.63–1.57(m,2H),1.54–1.23(m,12H),1.03(s,3H),0.98(s,3H),0.97(s,2H),0.84(s,4H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ151.68,136.60,133.32,108.65,39.98,39.92,37.85,37.43,36.58,34.09,32.85,31.84,29.14,27.96,26.05,25.47,25.34,23.25,20.02,17.18.IR(KBr,cm–1)3082,2954,2924,2854,2390,2285,1640,1581,1474,1459,1376,1359,1261,1018,998,907.HRMS-ESI(m/z):[M+H]+calculated forC20H33 +,273.2577；found,273.2578.
表2本实施例合成与文献报道的11的核磁数据
其中，文献参文Moiseenkov,A.M.；Dragan,V.A.；Veselovskii,V.V.；Shashkov,A.S.,Syhthesis of Rosane Diterpenes Bull.Acad.Sci.USSR,Div.Chem.Sci.1991,40,1682-1691.实施例8：对映-海松烷类产物的结构鉴定
对于催化产物B的结构鉴定，本发明实施例利用进一步衍生化的方法将化合物10转化为12。在室温条件下，将4-二甲基氨基吡啶(10.3mg，0.084mmol，3.00equiv.)和4-硝基苯甲酰氯(12.8mg，0.069mmol，2.50equiv.)加入到化合物10(8mg，0.028mmol，1.0equiv.)的二氯甲烷(1mL)溶液中，在室温下反应24h后，加入饱和碳酸钠溶液，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤并用旋转蒸发仪减压浓缩，经柱层析分离纯化(hexane/EtOAc＝30/1)，得到白色固体12(7.5mg,0.17mmol，60％)。TLC:Rf＝0.60(hexane/EtOAc＝15/1),PMA stain&UV.[α]D 25.3＝-19.71(c＝0.36,CHCl3).1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.30-8.27(m,2H),8.22-8.18(m,2H),4.49-4.43(m,2H),1.97(m,2H),1.88(m,2H),1.85-1.75(m,2H),1.74-1.70(m,2H),1.59(dd,J＝10.2,6.6Hz,4H),1.49-1.38(m,4H),1.31(ddd,J＝33.4,19.5,11.7Hz,2H),1.18-1.12(m,2H),1.04(dd,J＝13.4,9.7Hz,1H),0.97(s,3H),0.92(s,3H),0.88(s,3H),0.84(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ164.95,150.67,136.98,136.09,130.79,124.14,123.67,63.36,52.02,43.45,42.00,41.48,37.72,36.85,34.77,33.46,33.39,32.87,30.94,23.17,21.83,20.74,19.61,19.17,19.08.IR(KBr,cm–1)2959,2923,2849,2828,2365,2344,2317,1716,1528,1459,1349,1319,1273,1101,872,800,751,718.HRMS-ESI(m/z):[M+H]+calculated for C27H38NO4 +,440.2795；found,440.2763.
利用混合溶剂缓慢挥发的方法培养化合物12的单晶，随后通过X射线衍射实验和晶体结构解析确定12的结构，从而确定催化产物B的结构如图6所示。化合物12的单晶培养条件如下：将5.9mg的化合物12溶解于丙酮、乙醇和乙腈(体积比为1:1:1)的混合溶剂中，然后样品静置于室温下使溶剂慢慢蒸发直至有单晶析出。
同样地，化合物10中的一级羟基可进一步消除生成少量的化合物13，ent-pimara-8(9),15-diene。将o-NO2PhSeCN(23.5mg，0.0103mmol，3.0equiv.)加入到化合物10(10mg，0.034mmol，1.0equiv.)的四氢呋喃(0.5mL)溶液中，反应体系变为橘黄色，然后将n-Bu3P(25.7μL，0.103mmol，3.0equiv.)滴加到反应体系中，反应液变为深红色，随后在室温下反应7h。反应结束后，将反应体系移至0℃，并小心加入H2O2(119μL，30％w/w in H2O)。随后，反应体系缓慢升温，并在室温下反应18h后，以正己烷为洗脱剂，反应液直接进行柱层析分离纯化，得到无色油状的化合物3(痕量，仅可用于GC-MS分析)。GC-MS显示化合物13与F72Y突变体催化ent-CPP生成的产物B具有相同的保留时间和质谱碎片峰。
综上，目标对映-海松烷类产物为ent-pimara-8(9),15-diene(13)。
其中，图7-图13为本发明实施例中化合物9的核磁谱图(包括氢谱、碳谱和二维谱图)；图14-图20为本发明实施例中化合物10的核磁谱图(包括氢谱、碳谱和二维谱图)；图21-图22为本发明实施例中化合物11的核磁谱图(包括氢谱和碳谱)；图23-24为本发明实施例中化合物12的核磁谱图(包括氢谱和碳谱)。
综上所述，本发明首次提供了一种制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的生物合成方法。通过对来源于慢生型大豆根瘤菌对映-贝壳杉烯合成酶活性口袋的改造，获得首个能催化前体ent-CPP合成对映-玫瑰烷骨架化合物ent-rosa-5(10),15-diene以及对映-海松烷骨架化合物ent-pimara-8(9),15-diene的突变体BjKS-F72Y，进一步通过微生物异源合成系统，实现了由起始物质甘油到新型二萜类骨架化合物的“一步合成”。与现有技术相比，本发明为合成光学纯对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物提供了新策略，也为发现新型萜类化合物、丰富萜类天然产物化合物库提供了重要的先导化合物资源。此外，本发明也为对映-贝壳杉烯合成酶的进一步改造提供了新的信息，对其他萜类环化酶的改造具有借鉴意义。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (9)
1.一种制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，其特征在于，所述骨架化合物由对映-贝壳杉烯合成酶的突变体BjKS-F72Y催化ent-CPP生成；所述突变体BjKS-F72Y的编码核苷酸序列如SEQ.ID NO 1所示，氨基酸序列如SEQ.ID NO 2所示，所述突变体发生突变的氨基酸位点为第72位的F突变为Y。
2.根据权利要求1所述的制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，其特征在于，所述对映-玫瑰烷骨架化合物为ent-rosa-5(10),15-diene，以及对映-海松烷骨架化合物为ent-pimara-8(9),15-diene，其结构式如下所示：
3.根据权利要求1所述的制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
构建BjKS突变模板质粒；
构建BjKS突变体重组质粒；
构建含有甲羟戊酸途径及FPP合成酶的重组质粒；
筛选BjKS突变体，得到突变体BjKS-F72Y；
利用突变体BjKS-F72Y进行对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的异源生物合成；
产物结构鉴定。
4.根据权利要求3所述的制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，其特征在于，构建BjKS突变模板质粒的具体步骤为：将来源于慢生型大豆根瘤菌的对映-贝壳杉烯合成酶基因BjKS与来源于链霉菌的ent-CPP合成酶基因PtmT2共同克隆至质粒pETDuet-1的MCS2上，来源于酵母的GGPP合成酶基因BTS1克隆到质粒pETDuet-1的MCS1上，即获得BjKS突变模板质粒pETDuet-BTS1-PtmT2-BjKS。
5.根据权利要求3所述的制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，其特征在于，选择对映-贝壳杉烯合成酶活性口袋的六个氨基酸残基L71、F72、Y136、L140、A167和V171进行突变，构建BjKS突变体重组质粒。
6.根据权利要求3所述的制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，其特征在于，筛选BjKS突变体的具体步骤为：将含有甲羟戊酸途径及FPP合成酶的重组质粒pACYCDuet-T1B1-ERG20和BjKS突变体重组质粒pETDuet-BTS1-PtmT2-BjKS共转到大肠杆菌BL21中，经过含氯霉素和氨苄青霉素的双抗平板筛选，得到重组菌株，利用所述重组菌株进行异源生物合成对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的筛选。
7.根据权利要求6所述的制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，其特征在于，通过GC-MS分析BjKS突变体重组菌株异源生物合成的产物的分布情况并进行筛选。
8.根据权利要求3所述的制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法，其特征在于，在产物结构鉴定之前，还包括步骤：利用硼氢化氧化反应将突变体BjKS-F72Y异源生物合成的对映-玫瑰烷类和对映海松烷骨架化合物进行衍生化反应。
9.一种对映-贝壳杉烯合成酶突变体，其特征在于，所述突变体BjKS-F72Y的编码核苷酸序列如SEQ.ID NO 1所示，所述突变体BjKS-F72Y催化ent-CPP产生对映-贝壳杉烯、化合物ent-rosa-5(10),15-diene以及化合物ent-pimara-8(9),15-diene。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210879962.3A CN115820759B (zh) | 2022-07-25 | 2022-07-25 | 一种制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210879962.3A CN115820759B (zh) | 2022-07-25 | 2022-07-25 | 一种制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115820759A CN115820759A (zh) | 2023-03-21 |
| CN115820759B true CN115820759B (zh) | 2023-08-08 |
Family
ID=85522950
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210879962.3A Active CN115820759B (zh) | 2022-07-25 | 2022-07-25 | 一种制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115820759B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105130796A (zh) * | 2015-10-22 | 2015-12-09 | 云南民族大学 | 一种二萜类化合物及其制备方法与应用 |
| CN108064135A (zh) * | 2013-07-15 | 2018-05-22 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 二萜的生产 |
-
2022
- 2022-07-25 CN CN202210879962.3A patent/CN115820759B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108064135A (zh) * | 2013-07-15 | 2018-05-22 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 二萜的生产 |
| CN105130796A (zh) * | 2015-10-22 | 2015-12-09 | 云南民族大学 | 一种二萜类化合物及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 孔令义编著.《复杂天然产物波谱解析》.中国医药科技出版社,2012,(第2012年9月第1版版),第447-453页第六章"二萜"的第一节"结构类型". * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115820759A (zh) | 2023-03-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ye et al. | Coupling cell growth and biochemical pathway induction in Saccharomyces cerevisiae for production of (+)-valencene and its chemical conversion to (+)-nootkatone | |
| CN106188078B (zh) | 一种手性螺环羟吲哚‑苯并吡喃‑酮并‑3,4‑二氢‑吡喃化合物的合成方法 | |
| CN115197172B (zh) | 二倍半萜化合物、其合成基因簇与合成方法 | |
| EP4086343A1 (en) | Use of biological enzyme for preparing orlistat intermediate, and preparation method | |
| CN112592843B (zh) | 一种生产α-蛇麻烯的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用 | |
| CN106367361A (zh) | 一种酿酒酵母工程菌株及其构建方法、应用 | |
| CN112063647A (zh) | 酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法、酿酒酵母重组菌Cuol02及应用 | |
| CN115851863B (zh) | 一种海绵烷骨架化合物的制备方法及其应用 | |
| CN115820759B (zh) | 一种制备对映-玫瑰烷和对映-海松烷骨架化合物的方法 | |
| CN113755355A (zh) | 一种以葡萄糖为底物生物合成罗汉果醇的工程菌株、构建及其应用 | |
| Wang et al. | Facile biosynthesis of taxadiene by a newly constructed Escherichia coli strain fusing enzymes taxadiene synthase and geranylgeranyl pyrophosphate synthase | |
| CN114774297B (zh) | 产t-杜松醇的重组酿酒酵母及其应用 | |
| CN113444737B (zh) | 细胞色素p450酶及其在合成灵芝三萜类化合物中的应用 | |
| CN111363753B (zh) | 异源生产线性三萜的方法 | |
| CN110669712A (zh) | 一种产r-(+)-紫苏醇的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN111019874A (zh) | 一种生产青蒿素前体的重组菌的构建方法及其发酵工艺 | |
| Yuan et al. | Synthesis of Trifluoromethylated Monoterpenes by an Engineered Cytochrome P450 | |
| CN110885281A (zh) | 一类四环二萜类化合物及其制备方法与应用 | |
| CN117844729B (zh) | 一种重组菌株及其制备方法与应用、补身醇的制备方法 | |
| CN114181984B (zh) | (s)-1-(4-吡啶基)-1,3-丙二醇(ⅰ)的生物制备方法 | |
| Dai et al. | Biotransformation of 4 (20), 11-taxadienes by cell suspension cultures of Platycodon grandiflorum | |
| CN113402371B (zh) | 2,3-二甲氧基-5-甲基-1-羟基-4苯醌化合物、制备方法及应用 | |
| CN107794270B (zh) | 酮基还原酶dna分子、重组载体和菌株及应用 | |
| CN108624610B (zh) | 拟南芥三烯甲素及其制备方法 | |
| CN107653293A (zh) | 特异位点羟基化巨大戟烷型二萜衍生物的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |