CN107794270B - 酮基还原酶dna分子、重组载体和菌株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及生产酮基还原酶的DNA分子、蛋白或多肽序列，重组载体和菌株及应用。所述酮基还原酶DNA分子，其碱基序列为SEQ ID NO.1所示；或者选自编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽或蛋白质；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有酮基还原酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质。本发明将突变体基因同质粒pBAD进行连接更加稳定，而且在阿拉伯糖的诱导下，发酵酶活更高，可达到120U/mL以上，具有表达量高，表达系统稳定，发酵控制简单等特点，适宜规模化生产。

Description

酮基还原酶DNA分子、重组载体和菌株及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种生产酮基还原酶的突变体和工程菌的构建方法，尤其涉及酮基还原酶突变体DNA分子、蛋白或多肽序列，重组载体和菌株及应用。

背景技术

(1)威胁人类健康安全的三大杀手有“高血糖、高血脂、高血压”，其中高脂血症是引起动脉粥样硬化进而导致冠心病、高血压和脑血管疾病的主要原因。羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂类降脂药是目前降血脂的首选药物。他汀类药物就是通过抑制HNG-CoA还原酶的通路效率来限制体内胆固醇的代谢途径，降低血浆中胆固醇和脂蛋白水平，从而起到降血脂的作用。目前已上市或正处于开发中的他汀类药物有洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗伐他汀、匹伐他汀等多种。他汀类药物全球产值可达到200亿美元。

(2)目前他汀类药物的合成工艺路线存在可改进的地方，A6到A7以及C2到C3步骤，采用深冷条件下硼烷还原，对设备要求高且生产不安全。美国专利US5399722、US5286883、中国专利200610027347.0报道这类合成方法。

(3)度洛西汀是一种5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂，是一种抗抑郁药；孟鲁司特是一种对阿斯匹林敏感的哮喘患者以及预防运动诱发的支气管收缩进行治疗的药物。两种药物全球产值均可达到40亿美元。两个产品工艺均采用深冷条件下硼烷还原，对设备要求高且生产不安全。

(4)近年来，随着生物工程技术的迅猛发展，一些酮基还原酶的基因工程菌相继出现，一方面酶活不断提高，另一方面应用工艺不断改进，使得利用酮基还原酶合成他汀类药物和治疗抑郁症的度洛西汀(Duloxetine)和哮喘的孟鲁 司特(Montelukast)中间体，简化了操作过程，降低了生产成本，具有广阔的应用前景。

(5)中国发明专利201510195643提供了一株葡萄糖脱氢酶重组大肠杆菌E.coliRIL/pET-R-SD-AS-G，将葡萄糖脱氢酶与(R)-羰基还原酶共表达方式，利用培养后的重组菌株，以2-羟基苯乙酮为底物，催化不对称转化反应。本发明没有对葡萄糖脱氢酶基因进行定点突变，所采用的表达系统也不同于本发明采用的pBAD+MC1061，所产生的酶催化的底物也不一样。

(6)中国发明专利201510098687同时具有羰基还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌的方法产物光学纯度e.e％最高可达99.4％，相比现有技术均有了显著的提高。所采用的载体为pET-SsCR-GDH，与本发明采用的pBAD+MC1601不同，也没有采用定点突变方法改造脱氢酶，底物只针对4-氯-乙酰乙酸乙酯，应用工艺也不尽相同，未见规模化报道。

(7)中国发明专利201410758942提供了一种共表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的重组菌E.coil BL21，并且公开了其构建方法。其SyS1酶活力为3.7U/g，SyGDH酶活力为44.1U/g。其方法是采用优化密码子在pETDuet-Sygdh-Sys1构建的，与本发明采用蛋白质结构比对筛选特殊氨基酸方法快速筛选突变体的方法不同。

(8)中国发明专利201410759167公开了一种共表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌系统，在质粒pETDuet-Sygdh-Sys1共表达含有羰基还原酶(SyS1)基因和葡萄糖脱氢酶(SyGDH)基因。酮基还原酶的底物是针对2-氯-间氯苯乙酮。所用质粒和底物与本发明不一样，也未提及定点突变方法。

上述多项专利报道表明，利用基因工程方法可成功表达酮基还原酶基因，但均没有通过蛋白质结构功能区域的分析，选择突变点构建突变体的方法报道。

发明内容

综上所述，对于以往技术而言，存在的主要问题是：酮基还原酶基因工程菌的比酶活低，表达不稳定，不易实现产业化。

本发明的目的在于提供一种生产酮基还原酶的突变体和工程菌及其构建 方法，本发明获取的工程菌发酵操作简便、表达系统稳定，适合大规模生产。

具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种酮基还原酶DNA分子，其碱基序列为SEQ IDNO.1所示；或者选自编码如下蛋白(a)或(b)的基因：

(a)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽或蛋白质；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有酮基还原酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质。

优选的，在(a)限定的氨基酸序列中经过取代的一个或几个氨基酸且具有酮基还原酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质的第102位为丝氨酸，第133位为异亮氨酸。

优选的，碱基序列SEQ ID NO.1是利用SEQ ID NO.3序列的第102位氨基酸和第133位氨基酸突变得到。

优选的，用于第102位氨基酸突变的引物序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。

优选的，用于第133位氨基酸突变的引物序列为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。

第二方面，本发明提供了一种蛋白质或者多肽序列，选自以下多肽或蛋白质中的一种：

(a)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽或蛋白质；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有酮基还原酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质。

优选的，在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有酮基还原酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质的第102位为丝氨酸，第133位为异亮氨酸。

第三方面，本发明还提供了一种重组载体，其将如下所述的DNA分子作为目的基因，通过与质粒结合得到：

所述DNA分子，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；或者选自编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽或蛋白质；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有酮基还原酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质。

优选的，所述质粒含有阿拉伯糖操纵子作为启动子。

更优选的，所述质粒为pBAD质粒。

第四方面，本发明还提供了一种生产酮基还原酶的菌株，所述菌株为大肠杆菌Escherichia coli.B102-133，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2016101。

第五方面，本发明还提供了以上所述的生产生产酮基还原酶的菌株在酮基还原酶发酵领域中的应用。

优选的，所述菌株发酵时添加外源诱导剂阿拉伯糖。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供了一种基因定点突变的高效筛选突变体的方法，操作简便、酶活表达量大、表达系统稳定、适合大规模生产。

(2)采用的质粒pBAD和突变体基因连接后更加稳定，在阿拉伯糖的诱导发酵中酶活更高，发酵酶活可达到120U/mL以上。

(3)本发明构建的基因工程菌生产以阿拉伯糖为诱导剂，避免了进口乳糖的使用，降低生产成本10-20％，操作简便，更适宜规模化生产。

(4)本发明技术可以应用于降血脂药物他汀类药物中间体的合成，用生物催化合成法替代化学合成，避免了硼烷等易燃易爆化学品的使用，生产应用更加安全。

菌株保藏信息

本发明所述菌株为大肠杆菌Escherichia coli.B102-133，保藏编号为CCTCCM2016101，于2016年3月10号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮政编码：430072；电话：(027)-68752319。

具体实施方式

如上所述，本发明的目的在于：提供一种生产酮基还原酶的DNA分子、蛋白或多肽序列，重组载体和菌株，及其构建方法和应用。

本发明以木兰假丝酵母中获得的酮基还原酶基因K序列为已知序列，在NCBI基因库中筛选出同源性较高的16个酮基还原酶基因对应的氨基酸序列，通过对氨基酸中氢键、辅酶与酮基还原酶的结合位点、亚基相互作用分析，得到同源序列间的差异点，并选取102，133，172三个位点，进行基因突变，设计单突变体、双突变体、三突变体共7个突变体，进行基因突变，通过突变体的筛选，获得比酶活高的基因片段。

本发明采用大肠杆菌表达系统(pBAD+MC1061)将酮基还原酶突变基因连接，以阿拉伯糖为诱导剂，生产出酶活高的酮基还原酶。

本发明筛选出比酶活高的突变体(B102-133)，获得了发酵稳定，酶活高的基因工程菌。

其中，所述生产酮基还原酶的菌株的构建方法，通过将目的基因片段同载体连接，得到重组载体，然后转化到大肠杆菌中，得到生产酮基还原酶的菌株。

其中，本发明筛选出的目的基因序列为SEQ ID NO.1所示：

其中，SEQ ID NO.1基因对应的编码氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示：

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。但这些实施例仅为本发明的代表举例而已，不应理解为本发明实施的限定范围。此外，凡是对本发明实施例的简单替换或变化，均属于本发明的保护范围。本发明实施例中所用的材料以及仪器均为本领域技术人员常用的材料和仪器。例如，质粒载体pBAD Myc-HisA质粒，MC1061感受态细胞等可以通过市售购买，例如北京华越洋生物科技有限公司等多家生物公司均有销售。本发明实施例中所用的pBAD Myc-HisA质粒，MC1061感受态细胞具体来说，是电子科技大学生命 科学与技术学院的汤丽霞女士赠送的。

以下的实施例中，所用材料和设备的厂家和规格如表1和表2所示。

表1本发明实施例中所用的材料及厂家名称

表2本发明所用设备的信息

名称	型号	厂家
			PCR扩增仪	T100	Bio-rad
蛋白电泳槽	Mini-protean tetra	Bio-rad
			磁力搅拌器	79-1	常州国华
气相色谱仪(GC)	9790	浙江福立
			旋转蒸发仪	RE-3000B	巩义宇翔

实施例一

实施例一提供了一种构建本发明突变体基因工程菌的步骤，如下所示：

(1)突变体基因的筛选

将解脂假丝酵、葡萄牙假丝酵母和木兰假丝酵母等三种不同来源野生菌的酮基还原酶的4H8N、3WG6、K氨基酸序列进行比对，进行同源性比较分析，通过对蛋白质功能区域中的氢键、辅酶与酮基还原酶的结合位点、亚基相互作用的分析，确定以木兰假丝酵母的酮基还原酶K序列SEQ ID NO.3为模板。

其中，SEQ ID NO.3的序列如下：

以酮基还原酶K序列SEQ ID NO.3为基础，通过计算机辅助的半理性设计，选定了三个氨基酸突变位点，分别为E102S(gag-tcc)、L133I(tta-atc)和E172D(gaa-gat)，即将第102位的谷氨酸(Glu)替换为丝氨酸(Ser)，将第133位的亮氨酸(Leu)替换为异亮氨酸(Ile)，将第172位谷氨酸(Glu)替换为天冬氨酸(Asp)。

(2)突变体的设计与构建

对102、133和172位点的氨基酸进行7种组合方式的突变，分别为3个单突变102、133、172；两两组合102-133、133-172、172-102的3个双突变和1个三组合的102-133-172结合的三突变，通过定点突变方法，获得7种突变体目的片段。

其中，可以通过定点突变试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，直接通过引物设计以及PCR的方法获得突变片段。

其中，定点突变时所用到的引物序列如表3所示，按照突变位点，先进行单个位点的突变，然后再进行另一位点的突变(得到双突变突变)，然后再进行第三个位点的突变(得到三位点突变)。

表3引物序列

序列编号		引物序列
			SEQ ID NO.4	B102-P1	CCCAGCGTCCGGACTAGATTTAG
SEQ ID NO.5	B102-P2	CTAGTCCGGACGCTGGGGAATC
			SEQ ID NO.6	B133-P1	CAACGGGATCAGTTTGGAGGAA
SEQ ID NO.7	B133-P2	CAAACTGATCCCGTTGGCCTC
			SEQ ID NO.8	B172-P1	TGCGGATGTCAAGCCCCAA
SEQ ID NO.9	B172-P2	CTTGACATCCGCAACTTTCAGAA

PCR反应体系：

Taq酶，pfu酶，北京全式金生物技术有限公司

PCR反应条件如下：

1)94℃，5min；

2)94℃，30sec；

3)63℃，30sec；

4)72℃，8min；

5)条件2)-4)循环30次；

6)72℃，10min。

(3)工程菌的构建与筛选

第一步：将突变体的目的片段(102突变片段，133突变片段，172突变片段，102-133突变片段，133-172突变片段，102-172突变片段，102-133-172突变片段)与质粒pBAD大片段混匀后，进行连接。

连接体系：混匀后16℃连接过夜，反应体系见表4。

表4 pBAD和目的基因连接体系

第二步:连接产物转化大肠杆菌

取10μL连接反应物加入到100μL感受态细菌中，在EP管中轻轻混匀，冰浴30min后，42℃下热击90s，取出后快速冰浴2min，使细菌冷却。加入lmL不含抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡1h。取100μL均匀涂布于含AMP(100μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养，经电泳检测连接成功。第三步:酮基还原酶的摇瓶发酵及优势菌株筛选

从斜面培养基上接种重组大肠杆菌到30mL含30uL氨苄青霉素的液体LB培养基中，然后在30℃、240rpm条件下，完成18-20小时的一级培养过程。接下来，将一级培养种子接种到1L含10mL阿拉伯糖诱导剂的液体LB培养基中，在相同温度和转动频率下培养24小时，完成二级培养过程。将培养液于4000rpm离心12分钟后，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为菌体：缓冲液＝1：10(m：v)的浓度超声破碎。破碎完全后，离心收集液体，即得酮基还原酶粗酶液，经絮凝得酮基还原酶酶液。测定酶活大小，筛选出突变体B102-133具有最高发酵酶活。

表5不同突变体的发酵酶活

菌株	发酵酶活(U/mL)
		原始基因	30
B102突变片段	40
		B133突变片段	30
B172突变片段	15
		B102-133突变片段	120
B102-172突变片段	50
		B133-172突变片段	25
B102-133-172突变片段	35

从表5可以看出，采用原始基因即未突变的片段构建的重组质粒转化到大肠杆菌之后，发酵酶活为30U/mL，而采用定点突变后的B102片段、B102-133片段、B102-172片段和B102-133-172片段构建的重组质粒转化到大肠杆菌之后，发酵酶活均有不同程度的提高，尤其是B102-133片段，发酵酶活提高到未突变体的4倍，为120U/mL。从以上结果不难看出，采用本实施例方法构 建的特异性位点突变体，构建重组质粒后，对发酵酶活带来巨大变化，显著提高了发酵酶活。

其中，酶活的测定方法如下：

A.1酶活定义

在反应温度为30℃，pH为7.0的条件下，每5分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量，定义为一个单位(U)。

A.2原理：

葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化型辅酶NADP+通过磷酸戊糖途径产生还原型辅酶NADPH，后者与他汀类酮基还原酶共同作用于底物4-氯乙酰乙酸乙酯，生成4-氯-3-羟基丁酸乙酯。还原型辅酶NADPH与他汀类酮基还原酶协同作用后，被氧化为氧化型辅酶NADP+，并再次通过磷酸戊糖途径生成NADPH，形成辅因子再生循环。整个反应过程中，辅酶NADPH与他汀类酮基还原酶作用的反应速度最慢，可以作为衡量他汀类酮基还原酶酶活的标准。最后，通过单位时间内底物4-氯乙酰乙酸乙酯转化为产物4-氯-3-羟基丁酸乙酯的物质的量计算他汀类酮基还原酶酶活大小。

A.3溶液的配制

A3.1磷酸钠缓冲液：称取3.12g二水磷酸二氢钠溶于100mL纯净水中得磷酸二氢钠溶液，称取7.17g十二水磷酸氢二钠溶于100mL纯净水中得磷酸氢二钠溶液。量取39mL磷酸二氢钠溶液和61mL磷酸二氢钠溶液混匀，得200mmol磷酸盐缓冲溶液，溶液pH为7.0。

A3.2辅酶NADP+溶液：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adeninedinucleotide phosphate)缩写NADP，取0.6mg NADP+固体粉末于1mL蒸馏水中，充分溶解，得0.6mg/mL辅酶NADP+溶液。

A3.3葡萄糖脱氢酶：安琪GS2500型葡萄糖脱氢酶，按照葡萄糖脱氢酶酶活力检测方法检测酶活E(单位U/mL)，酮基还原酶酶活检测过程该酶添加量为3000U。

A3.4 4-氯乙酰乙酸乙酯：分子式C6H9ClO3，分子量164.59，CAS号：638-07-3，含量≥97％。

A3.5 4-氯-3-羟基丁酸乙酯：分子式C6H11ClO3，分子量166.7，CAS号：86728-85-0，含量≥95％。

A4实验操作：

准确称取0.5g 4-氯乙酰乙酸乙酯和1.0g葡萄糖固体于150mL磷酸钠缓冲液(200mmol，pH＝7.0)中，30℃搅拌10min。然后向反应体系中加入3000U葡萄糖脱氢酶和1mL辅酶NADP+(0.6mg/mL)，搅拌5min。然后向反应体系加入1mL酮基还原酶，磁力搅拌60min后终止反应。迅速量取2mL反应液于4mL离心管中，加入2mL乙酸乙酯，上下震摇使两者混合均匀，然后在4500r/min条件离心3min，取有机层待检。

A5气相检测：

A5.1气相检测条件：色谱柱型号为HP-5；进样量为2uL；进样器温度为270℃；柱箱温度：程序升温100℃保持3min，然后10℃/min升温至220℃；FID检测器温度为270℃；氢气压力为0.1MPa(30ml/min)；空气压力为0.1MPa(300ml/min)；分流比为1:100；载气压力为0.04MPa；斜率为100uv/min；最小峰宽为1sec；最小面积为10uv*s；最小峰高为10uv。

A5.2标样检测：准确称取0.01g4-氯乙酰乙酸乙酯，加入1ml乙酸乙酯充分溶解，然后按照上述气相检测检测条件检测，获得底物标样4-氯乙酰乙酸乙酯气相色谱图。采用相同的方法获取产物标样4-氯-3-羟基丁酸乙酯的气相色谱图。

A5.3样品检测：取上述A4实验操作获得的有机层液，按照气相色谱检测条件检测，获得样品气相色谱图。

参照标样4-氯乙酰乙酸乙酯和4-氯-3-羟基丁酸乙酯的出峰特征，分析检测样品气相色谱图谱中底物4-乙酰乙酸乙酯和产物4-氯-3-羟基丁酸乙酯的峰面积(或峰面积百分比)，酶活计算时备用。

A6酶活计算：

酶活力E(U/mL)＝(0.5×106/164.59)×转化率/(60/5)

其中，转化率＝产物的峰面积/(底物峰面积+产物峰面积)×100％；

0.5×106表示底物4-氯乙酰乙酸乙酯的质量(ug)；

164.59为底物4-氯乙酰乙酸乙酯的相对分子质量(g/mol)；

60为反应时间(min)；

5为酶活定义中的单位时间(min)。

A7酶活检测要求：

氧化型辅酶NADP+要求现配现用，其他溶液配制放置时间不超过1个月。

转化率必须控制在20-40％的线性范围，超出线性范围需要将酶液用纯净水稀释后重新检测，酶活计算时乘以稀释倍数。

A.8结果的允许误差

平行试验相对误差为±5％。每个样品检测三次，检测结果记为E_n(n＝1,2,3)，其算数平均值记为

则需满足要求：

实施例二

实施例二提供了本发明实施例一制备得到的菌株所产的酮基还原酶同原始菌株所产酮基还原酶的比酶活大小比较实验。

其中，比酶活是指每毫克酶蛋白所含的活力单位，就是酶活除以酶蛋白的质量。

将已知序列的目的片段基因和酮基还原酶与经过氨基酸位点在102和133区域的双组合的突变体的基因片段，分别连接到质粒pBAD大片段，取10μL连接反应物加入到100μL感受态细菌中，在EP管中轻轻混匀，冰浴30min后，42℃下热击90s，取出后快速冰浴2min，使细菌冷却。加入lmL不含抗生素的LB液体培养基(含10μL 10％的阿拉伯糖诱导剂)，37℃，200rpm振荡1h。取100μL均匀涂布于含AMP(100μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养，得到未突变和突变的大肠杆菌基因工程菌，采用实施例一中的第三步摇瓶发酵的方法进行发酵，提取酶液，然后分别测定每毫升酶液中酶蛋白的质量(采用凯氏定氮法)以及每毫升酶液中酶活力单位数，得到经过B102-133双突变的菌 株所产酮基还原酶的比酶活是原始菌株产酶的比酶活的4.2倍(见表6)。

表6突变菌株和原始菌株的发酵比酶活

菌株	比酶活(U/mg)
		原始菌株	10
突变菌株	42

实施例三实施例三提供了将实施例一制备得到的酮基还原酶在生物合成领域中的应用。

在50L发酵罐中加入12kg磷酸钠缓冲液、1.08kg葡萄糖固体、1.184kg底物(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯(含量为67％)、1kg葡萄糖脱氢酶(2500U/ml)、4.5kg酮基还原酶(120U/ml)和300mg辅酶NADP+，反应温度30℃、pH＝7.0(10％氢氧化钠溶液调节pH)，磁力搅拌下反应，气相色谱(GC)检测至反应完全。GC检测的条件为：色谱柱型号，HP-5；进样量，1uL；进样器温度，270℃；柱箱温度，程序升温100℃保持3min，然后10℃/min升温至220℃；FID检测器温度，270℃。然后，向反应体系加入150g活性炭搅拌30min后抽虑，滤液依次经18L、12L乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，减压旋蒸浓缩得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基乙酸叔丁酯粗品920g(含量80％)，化学收率92.8％，光学纯度99.9％。

(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯是一种重要的药物中间体，可以用于合成他汀类药物的中间体。从以上反应结果可以看出，本发明获得的酮基还原酶与葡萄糖脱氢酶一起可以用于他汀类脂肪烃酮基中间体底物的生物 催化合成，催化效率高，底物适应性强。同时也可以用于治疗抑郁症类药物芳基酮和治疗哮喘类药物噻吩类酮基中间体的生物催化合成。本发明的菌株制得的酮基还原酶表现出良好的生物学活性。

以上所述仅为本发明较佳实施例，并不用于局限本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在发明的保护范围之内。

。

Claims (11)

1.一种酮基还原酶DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽或蛋白质。

2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

3.序列SEQ ID NO.4和序列SEQ ID NO.5所示的引物对和序列SEQ ID NO.6和序列SEQID NO.7所示的引物对在制备序列SEQ ID NO.1中的应用，其中，所述制备过程中包含将序列SEQ ID NO.3的编码第102位氨基酸的密码子和编码第133位氨基酸的密码子突变。

4.一种蛋白质或者多肽，所述蛋白质或多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.一种重组载体，其特征在于，将编码如SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列的DNA分子作为目的基因，将所述目的基因与质粒结合得到所述重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，将碱基序列如SEQ ID NO.1 所示的DNA分子作为目的基因，将所述目的基因与质粒结合得到所述重组载体。

7.根据权利要求5或6所述的重组载体，所述质粒含有阿拉伯糖操纵子。

8.根据权利要求7所述的重组载体，所述质粒为pBAD质粒。

9.一种生产酮基还原酶的菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌（Escherichia coli）B102-133，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2016101。

10.权利要求9所述的生产酮基还原酶的菌株在酮基还原酶发酵中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述菌株发酵时添加外源诱导剂阿拉伯糖。