CN104498510A

CN104498510A - 产醛酮还原酶菌株、醛酮还原酶基因、载体、工程菌及应用

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Publication number: CN104498510A
Application number: CN201410641987.5A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 王亚军; 罗希; 刘小青
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2014-11-13
Filing date: 2014-11-13
Publication date: 2015-04-08

Abstract

本发明公开了一种产醛酮还原酶菌株、醛酮还原酶基因、载体、工程菌构建及应用方法，所述醛酮还原酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.5中的一种，SEQ ID No.1、SEQ ID No.3所示醛酮还原酶基因来自菌株——乳酸克鲁维酵母XP1461，SEQ ID No.5所示醛酮还原酶基因来自菌株——拜耳接合酵母XP1462；本发明公开的3条来自K.lactis、Z.bailii的醛酮还原酶首次报道用于6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯生物催化合成，制得的样品6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯达到光学纯，几乎检测不到6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯的存在；得益于公开的醛酮还原酶的高差向选择性，产物提取收率高。

Description

产醛酮还原酶菌株、醛酮还原酶基因、载体、工程菌及应用

(一)技术领域

本发明涉及醛酮还原酶产酶微生物、酶基因和构建这些基因的重组表达载体以及酶醛酮还原酶重组菌，并开发醛酮还原酶重组菌在阿托伐他汀手性侧链6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯生物催化合成方面的应用。

(二)背景技术

心脑血管疾病已经成为危害人类健康的头号杀手，预计到2020年，心血管疾病死亡人数将占人类总死亡人数的36％。心脑血管疾病发病与人体内高胆固醇水平有密切关系。阿托伐他汀能竞争性抑制肝脏内胆固醇合成的关键限速酶—3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性，降低内源性胆固醇的合成，是治疗高胆固醇血症和混合型高脂血症的有效药物，具有起效快、降脂能力强、作用时间长和毒副作用小等优点，是全球首个年销售额超过百亿美元的重磅炸弹药。

6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，是阿托伐他汀合成的重要手性中间体，也是关键的药效基团。由于各国药监部门对药物手性纯度设置严苛的限制(e.e.值>99.5％，d.e.值>99％)，6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的合成技术成为阿托伐他汀合成的关键核心技术。传统的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯化学合成工艺从酮酸(酯)出发，通过不对称合成构建手性中心，反应路线复杂，需要使用易燃易爆的硼烷、正丁基锂等及深冷等特殊条件，导致产物d.e.值低、得率低、能耗大。而且，反应产生的硼化物废物处理困难，需要经过繁琐的反复甲醇淬灭、真空蒸馏处理。酶催化反应具有优异的选择性、反应条件温和等优点，一般在常温、常压及近中性条件下进行，把分解、异构化、外消旋化、重排等不利副反应降到最低限度，生物催化技术具备提高过程原子经济性、实现过程绿色环境友好的基本条件。因此，开发生物不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯技术，具有巨大的经济效益和社会效益。

(三)发明内容

本发明目的是提供产立体选择性醛酮还原酶微生物乳酸克鲁维酵母(Kluyvzzzeromyces lactis)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)，3条来自K.lactis、Z.bailii的醛酮还原酶基因和含有上述基因的重组载体及其转化得到的重组菌，开发其在6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯生物催化合成方面的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种醛酮还原酶基因，所述醛酮还原酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.5中的一种。其中SEQ ID No.1、SEQ ID No.3所示醛酮还原酶基因来自菌株--乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)XP1461，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年8月14日，保藏编号为CCTCC NO:M 2014380，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。SEQ ID No.5所示醛酮还原酶基因来自菌株--拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)XP1462，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年8月14日，保藏编号为CCTCC M 2014381，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。

本发明所述SEQ ID No.1、SEQ ID No.3所示的醛酮还原酶基因克隆自K.lactis XP1461(保藏编号CCTCC M 2014380)，SEQ ID No.5所示的醛酮还原酶基因克隆自Z.bailii XP1462(保藏编号CCTCC M 2014381)。所述的醛酮还原酶基因可以从K.lactis XP1461(CCTCC M 2014380)和Z.bailii XP1462(CCTCC M 2014381)基因组中分离获得，也可以从该醛酮还原酶基因的重组载体中或者重组表达组中分离获得，也可以全人工合成获得。

本发明所述的醛酮还原酶基因之一的碱基序列如序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.5所示，分别命名为kakr、kxr和zbakr，全长分别为930bp、990bp和939bp。其中，其编码序列(CDS)分别为：从第一个碱基起至第930个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA；从第一个碱基起至第990个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA；从第一个碱基起至第939个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。该3条序列无内含子，其编码的蛋白质(即醛酮还原酶)氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6所示。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO：1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是等位变异体或非天然发生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO：2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于突变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明还涉及所述醛酮还原酶基因构建的重组表达载体。本发明所述的重组表达载体可以通过本领域常规方法将本发明的醛酮还原酶基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的载体可以为本领域常规的各种载体，如商品化质粒(大肠杆菌中合适的载体有pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pET20、pET32、pRep4、pHS1、pHS2、pMBL等)、粘粒(pHZ132)、噬菌体或者病毒载体(反转录病毒载体，腺病毒载体)等。所述质粒代表部分质粒，其他质粒为技术人员所熟知。本发明所述重组载体优选pET28a质粒。优选地，可以通过下述方法制得本发明的重组表达载体：分别将以K.lactis基因组DNA为模板，通过上游引物(引物1)：5’-CATATGACTACTCAAAAGTTCTTTACTT-3’，下游引物(引物2)5’-GCGGCCGCTCACTTCTGGGATTCAGAAT-3’进行PCR扩增所得到的醛酮还原酶基因产物(核苷酸序列为SEQ ID NO：1)；以K.lactis基因组DNA为模板，通过上游引物(引物3)：5’- AGATCTATGACGTACTTAGCAGAAACAG-3’，下游引物(引物4)5’- CTCGAGGATGAAAGTTGGGAATTCGTTG-3’进行PCR扩增所得到的醛酮还原酶基因产物(核苷酸序列为SEQ ID NO：3)；以Z.bailii基因组DNA为模板，通过上游引物(引物5)：5’- AGATCTATGTCTTTCCATCAAGAATTCT-3’，下游引物(引物6)5’- CTCGAGAGGCTTCTGAGCTTCCTCATCG-3’进行PCR扩增所得到的醛酮还原酶基因产物(核苷酸序列为SEQ ID NO：5)与pGEM-T Easy载体连接，所得重组载体pGEM-T Easy-kakr、pGEM-T Easy-kxr和pGEM-T Easy-zbakr用限制性内切酶Nde I和Not I双酶切，形成的醛酮还原酶基因粘性末端分别与表达载体pET28a经相同限制性内切酶双酶切反应形成的互补的粘性末端用T4 DNA连接酶连接，生成含有本发明的醛酮还原酶基因片段的重组表达载体pET28a-kakr、pET28a-kxr和pET28a-zbakr。

本发明提供一种由所述重组表达载体转化得到的重组基因工程菌。通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的醛酮还原酶能被有效表达即可。本发明优选E.coli BL21(DE3)。将本发明前述的表达质粒pET28a-kakr、pET28a-kxr和pET28a-zbakr通过常规转化方法，转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET28a-kakr、E.coli BL21(DE3)/pET28a-kxr和E.coli BL21(DE3)/pET28a-zbakr。

本发明涉及一种所述醛酮还原酶基因在制备重组醛酮还原酶中的应用，所述的应用为：构建含有所述醛酮还原酶基因的重组载体，将重组载体转化至宿主中，优选E.coli BL21(DE3)，获得的重组基因工程菌诱导培养，培养液分离，获得含重组醛酮还原酶的菌体细胞。所述的诱导培养所用的培养基可为本领域任何可使菌体生长并产生本发明的醛酮还原酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体能够生长并产生本发明所述的醛酮还原酶即可。其他培养转化体具体操作可按本领域常规操作进行，优选下述方法：将本发明涉及的重组菌接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养基光密度OD₆₀₀达到0.6～0.8(优选0.6)时，在终浓度为1.0～15.0g/L(优选9.0g/L)乳糖的诱导下，高效表达本发明的重组醛酮还原酶。

此外，本发明还提供一种所述醛酮还原酶在催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原中的应用，具体所述的应用为：以携带醛酮还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞经超声破碎后的破碎混合液离心获得的上清液为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅助底物(以葡萄糖为辅助底物时，在菌体葡萄糖脱氢酶催化作用下将菌体内源性氧化型NAD(P)⁺还原成NAD(P)H，NAD(P)H作为氢供体参与还原反应)或者添加外源性还原型NADH作为底物，以pH7.0磷酸钾缓冲液为反应介质构成反应体系，在30℃、200转/分钟条件下进行转化反应，反应完全后，获得含6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的转化液，转化液经固液分离后，将液体用乙酸乙酯萃取、取乙酸乙酯层减压蒸馏，获得油状液体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯；所述底物的初始浓度为0.01～0.1mol/L缓冲液(优选0.05mol/L)，所述催化剂的的用量以菌体细胞湿重计为50～300g/L缓冲液(优选200g/L)，所述葡萄糖的用量为5～50g/L反应体系(优选5g/L)，所述NADH的用量为0.02～0.1mol/L反应体系(优选0.022mol/L)。制备的样品6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯d.e.值大于99.5％，萃取收率94.5wt％。本发明所述反应体系包括下列两种：(1)以携带醛酮还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的菌体细胞为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅助底物，以pH7.0磷酸钾缓冲液为反应介质构成反应体系；(2)以携带醛酮还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的菌体细胞经超声破碎后的破碎混合液离心获得的上清液为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以外源性还原型NADH作为底物构成反应体系。

进一步，所述催化剂为菌体细胞经超声破碎后的破碎混合液离心获得的上清液，辅助底物为NADH时，所述底物的初始浓度为0.02～0.1mol/L反应体系，所述催化剂的体积用量以破碎前菌体细胞的湿重计为50～120g/L反应体系，所述NADH的用量为0.02～0.1mol/L反应体系；具体为：将含醛酮还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的菌体细胞用200mmol/L，pH7.0磷酸钾缓冲液重悬，然后将重悬液超声破碎，取破碎混合液离心，取上清液作为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以NADH为氢供体构成反应体系，在30℃、200转/分钟条件下进行转化反应，反应完全后，获得含6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的转化液，转化液经固液分离后，将液体用乙酸乙酯萃取、取乙酸乙酯层减压蒸馏，获得油状液体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯；所述底物的初始浓度为0.01～0.1mol/L反应体系(优选0.022mol/L)，所述催化剂的体积用量以破碎前菌体细胞湿重计为50～120g/L反应体系(优选100g/L)，所述NADH的用量为0.01～0.1mol/L反应体系(优选0.022mol/L)。本发明所述以NADH为氢供体是指直接以NADH作为第二底物参与6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯还原反应。

本发明中催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原得到光学纯的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物催化剂，可以是将发酵液(培养物)固液分离后得到的菌体细胞或者菌体裂解液(粗酶液)，也可以是进一步纯化得到的醛酮还原酶。

本发明所述生物催化剂按如下方法制备：(1)菌体细胞的制备：将含醛酮还原酶的重组基因工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养12小时，获得种子液；再将种子液以体积浓度1％的接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD₆₀₀0.6～0.8，然后加入终浓度为9.0g/L乳糖，28℃诱导培养12小时后，4℃、9000转/分钟离心10分钟，弃上清，沉淀用生理盐水洗涤两次，4℃、9000转/分钟离心10分钟，收集菌体细胞；(2)超声破碎：将步骤(1)收集的菌体细胞与200mmol/L、pH7.0磷酸钾缓冲液混合，在功率400W条件下超声破碎30分钟，获得破碎混合液，将破碎混合液离心，取上清液即为催化剂；所述缓冲液的体积用量以菌体细胞重量计为10mL/g。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明公开的3条来自K.lactis、Z.bailii的醛酮还原酶首次报道用于6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯生物催化合成，制得的样品6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯达到光学纯，几乎检测不到6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯的存在；得益于公开的醛酮还原酶的高差向选择性，产物提取收率高。

(四)附图说明

图1为PCR扩增电泳图谱，其中，(I)为kakr基因PCR扩增后电泳图；(II)为kxr基因PCR扩增后电泳图；(III)为zbakr基因PCR扩增后电泳图。

图2为pGEM-T Easy重组质粒物理图谱，其中，(I)为重组质粒pGEM-T Easy-kakr物理图谱；(II)为重组质粒pGEM-T Easy-kxr物理图谱；(III)为重组质粒pGEM-T Easy-zbakr物理图谱。

图3为pET28a重组表达质粒物理图谱，其中，(I)为重组质粒pET28a-kakr物理图谱；(II)为重组质粒pET28a-kxr物理图谱；(III)为重组质粒pET28a-zbakr物理图谱。

图4为重组pGEM-T Easy质粒转化子PCR鉴定图，其中，(a)为重组菌KAKR的PCR电泳图；(b)为重组菌KXR的PCR电泳图；(c)为重组菌ZBAKR的PCR电泳图。

图5为重组pET28a质粒转化子PCR鉴定图，其中，(I)为重组菌KAKR的PCR电泳图；(II)为重组菌KXR的PCR电泳图；(III)为重组转菌ZBAKR的PCR电泳图。

图6为重组工程菌醛酮还原酶SDS-PAGE电泳图，其中，(I)为BL21(DE3)/pET28a-kakr醛酮还原酶SDS-PAGE电泳图；(II)为 BL21(DE3)//pET28a-kxr醛酮还原酶SDS-PAGE电泳图；(III)为BL21(DE3)//pET28a-zbakr醛酮还原酶SDS-PAGE电泳图；1：标准蛋白质分子；2：未诱导醛酮还原酶工程菌细胞破碎液；3：乳糖诱导醛酮还原酶工程菌细胞破碎液；4：乳糖诱导醛酮还原酶工程菌细胞破碎液上清。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1产醛酮还原酶微生物筛选

富集培养基(豆芽汁培养基)：新鲜豆芽汁(新鲜黄豆芽，按100g/L加水煮沸30分钟，过滤取豆芽汁，补水至初始体积)100mL/L，葡萄糖50g/L，自然pH，250mL摇瓶分装，装液量50mL，115℃灭菌30分钟。添加无菌6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯2g/L。固体培养基：豆芽汁培养基，添加20g/L琼脂，自然pH。

将采集于全国各地的土样用生理盐水按一定的比例分散后接种至富集培养基中，在30℃、150转/分钟条件下，摇床振荡培养24小时。富集培养液逐级稀释、涂布到固体平板培养基上30℃培养至形成可观察到的单菌落。挑取单菌落转接至无菌斜面，30℃培养2天，斜面置于4℃冰箱保藏。

将保藏在试管斜面中的菌株逐一接种到发酵培养基中，在30℃、150转/分钟条件下培养48小时。分别移取20mL培养物，离心，收集菌体，并用50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)洗涤菌体2次。将菌体分散于10.0mL上述缓冲液中，添加6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，使其终浓度达到5.0g/L，添加葡萄糖，使其终浓度达到5.0g/L，35℃,200转/分钟转化12小时，转化液经离心、0.22μm微孔滤膜过滤，液相色谱分析醛酮还原酶活性和选择性，最终筛选到两株菌，在上述反应条件下，产物得率和d.e.值分别为25.6％和89.7％，以及30.4％和92.5％，记为菌株XP1461和菌株XP1462。

检测方法：高效液相色谱法层顶底物与产物的浓度，检测条件：ODS-2C18柱(4.6×250mm，5μm)，流动相乙腈：水＝1:3(v/v)，柱温40℃，流速1mL/min，紫外检测波长210nm，进样量20μL。6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯、6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯、6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯保留时间分别为7.4分钟、8.1分钟、12.5分钟。

表1：利用Vitek 2微生物自动鉴定系统分析菌种XP1461结果

注：+，阳性；－，阴性。

表2：利用Vitek 2微生物自动鉴定系统分析菌种XP1462结果

注：+，阳性；－，阴性。

实施例2菌种鉴定

将实施例1中筛选获得的醛酮还原酶活性菌株进行生理生化鉴定和18S rDNA序列分析。

生理生化鉴定：利用利用Vitek 2微生物自动鉴定系统测定菌株XP1461和菌株XP1462对46种鉴定试验的鉴定结果(如表1、表2所示)，经Vitek 2读数仪分析代谢指纹分析，确定菌株XP1461属于克鲁维酵母属(kluyveromyces)的lactis种，同源性96％，菌株XP1462属于接合酵母属(Zygosaccharomyces)的bailii种，同源性98％。

18S rDNA序列分析：以提取到的菌株XP1461和菌株XP1462细胞总DNA为模板，利用设计的引物：pITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和pITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'分别扩增两菌株的18S rDNA序列。扩增的片段克隆到T载体后，抽提质粒获得含菌株XP1461和菌株XP1462 的18S rDNA片段的重组质粒，测序后分别与GenBank中保存的数据进行相似性分析发现，菌株XP1461属于kluyveromyces属，菌株XP1462属于Zygosaccharomyces属。

综上所述，菌株XP1461鉴定为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，命名为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)XP1461，菌株XP1462鉴定为拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)，命名为拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)XP1462。

实施例3：醛酮还原酶基因克隆与重组质粒构建

(1)目的基因的克隆

用核酸快速提取仪(购自美国MP Bio公司)分别提取乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)XP1461(保藏编号为CCTCC M 2014380)和拜尔接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)XP1462(保藏编号为CCTCC M 2014381)菌体的总基因组DNA。

以K.lactis M 2014380基因组DNA为模板，通过上游引物(引物1)：5’-CATATGACTACTCAAAAGTTCTTTACTT-3’，下游引物(引物2)：5’-GCGGCCGCTCACTTCTGGGATTCAGAAT-3’进行PCR扩增，获得扩增产物1。取10μL PCR扩增产物1用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶电泳图见图1中(Ⅰ)所示，在1000bp左右出现条带；

以K.lactis CCTCC M 2014380基因组DNA为模板，通过上游引物(引物3)：5’-AGATCTATGACGTACTTAGCAGAAACAG-3’，下游引物(引物4)5’-CTCGAGGATGAAAGTTGGGAATTCGTTG-3’进行PCR扩增，获得扩增产物2。取10μL PCR扩增产物2用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶电泳图见图1中(Ⅱ)所示，在1000bp左右出现条带；

以Z.bailii CCTCC M 2014381基因组DNA为模板，通过上游引物(引物5)：5’-AGATCTATGTCTTTCCATCAAGAATTCT-3’，下游引物(引物6)5’-CTCGAGAGGCTTCTGAGCTTCCTCATCG-3’进行PCR扩增，获得扩增产物3。取10μL PCR扩增产物3用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶电泳图见图1中(Ⅲ)所示，在1000bp左右出现条带。

PCR反应体系组成(总体积100μL)：10倍Pfu DNA聚合酶缓冲液(含Mg²⁺)10μL，10mmol/L dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mmol/L)0.5μL，浓度为50μmol/L的克隆上游引物、下游引物各0.5μL，基因组DNA 1μL，Pfu Taq DNA聚合酶1μL，无核酸水86.5μL。采用Biorad PCR仪，PCR反应条件为：预变性94℃4分钟，然后进入温度循环94℃30秒，55℃30秒，72℃1.5分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟，终止温度为4℃。

(2)目的基因的检测

将步骤(1)获得PCR扩增产物1、PCR扩增产物2和PCR扩增产物3琼脂糖凝胶电泳，采用回收试剂盒(购自Axygen，美国爱思进)回收，纯化后的片段分别记为片段kakr、片段kxr和片段zbakr，依次直接与pGE-T Easy载体(购自Promega，美国普洛麦格)连接，分别得到重组质粒pGEM-T Easy-kakr、pGEM-T Easy-kxr和pGEM-T Easy-zbakr(质粒图谱参见图2)。将重组质粒转化至宿主E.coli JM109中，利用含氨苄青霉素(Amp，终浓度为50μg/mL)的LB平板筛选。随机挑取菌落至无菌EP管，加入50μL无菌水，沸水浴30分钟。分别以上述沸水浴处理液为模板，在引物7和引物8作用下进行菌落PCR。M13上游引物(引物7)：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’和M13下游引物(引物8)：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3。PCR反应体系组成：10倍Taq DNA聚合酶缓冲液(含Mg²⁺)10μL，10mmol/L dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mmol/L)0.5μL，浓度为50μmol/L的引物7和引物8各0.5μL，Taq DNA聚合酶1μL，无核酸水87.5μL。充分混匀，分装至PCR管，每管9μL，加入模板1μL。采用Biorad PCR仪进行扩增，PCR反应条件为：预变性94℃4分钟，然后进入温度循环94℃30秒，55℃30秒，72℃1.5分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟，终止温度为4℃。获得如图4所示阳性克隆，均在1000bp左右出现明显条带，提取阳性克隆质粒测序，利用软件分析测序结果，结果表明：引物1和引物2扩增得到的核苷酸序列长度为930bp(SEQ ID No.1)、引物3和引物4扩增得到的核苷酸序列长度为990bp(SEQ ID No.3)，引物5和引物6扩增得到的核苷酸序列长度为939bp(SEQ ID No.5)。三条序列编码完整的开放阅读框依次对应的氨基酸序列为SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6。

实施例4：重组表达质粒的构建和重组表达转化体的制备

分别用限制性内切酶Nde I和Not I对实施例3制备的重组质粒pGEM-T Easy-kakr、pGEM-T Easy-kxr和pGEM-T Easy-zbakr进行双酶切，形成的醛酮还原酶基因粘性末端，然后分别与经相同限制性内切酶双酶切反应形成的互补的粘性末端的表达载体pET28a用T4 DNA连接酶连接，构建表达载体pET28a-kakr、pET28a-kxr和pET28a-zbakr(质粒图谱参见图3)。分别将构建的表达载体pET28a-kakrr、pET28a-kxr和pET28a-zbakr转化至E.coli BL21(DE3)中，涂布含终浓度50μg/mL卡那霉素(Kan)的LB抗性平板、37℃培养过夜，随机挑取菌落至无菌EP管，加入无菌水50μL，沸水浴30分钟。分别以上述沸水浴处理液为模板，在引物9和引物10作用下分别进行菌落PCR。T7引物(引物9)：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；T7引物(引物10)：5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’。PCR反应体系组成：10倍Taq DNA聚合酶缓冲液(含Mg²⁺)10μL，10mmol/L dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mmol/L)0.5μL，浓度为50μmol/L的引物9和引物 10各0.5μL，Taq DNA聚合酶1μL，无核酸水87.5μL。充分混匀，分装至PCR管，每管9μL，加入模板1μL。采用Biorad PCR仪进行扩增，PCR反应条件为：预变性94℃4分钟，然后进入温度循环94℃30秒，55℃30秒，72℃1.5分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟，终止温度为4℃。获得如图5所示的阳性克隆，均在1000bp附近出现明显条带，提取阳性克隆质粒测序，利用软件分析测序结果，结果表明：重组质粒pGEM-T Easy-kakr、pGEM-T Easy-kxr和pGEM-T Easy-zbakr扩增得到的核苷酸序列长度分别为930bp(SEQ ID No.1)、990bp(SEQ ID No.3)和939bp(SEQ ID No.5)，三条序列的开放阅读框完整，说明重组表达质粒及重组表达转化体构建成功，即获得了分别含有胞内表达重组质粒pET28a-kakr、pET28a-kxr和pET28a-zbakr的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-kakr、E.coli BL21(DE3)/pET28a-kxr和E.coli BL21(DE3)/pET28a-zbakr。

实施例5：重组醛酮还原酶的表达

将实施例4验证后的分别含有胞内表达重组质粒pET28a-kakr、pET28a-kxr和pET28a-zbakr的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-kakr、E.coli BL21(DE3)/pET28a-kxr和E.coli BL21(DE3)/pET28a-zbakr依次接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养12小时，再以1％(v/v)接种量接种到新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD₆₀₀0.6～0.8，再向LB液体培养基中加入终浓度为9.0g/L乳糖，28℃诱导培养12小时后，4℃、9000转/分钟离心10分钟，弃上清，菌体用生理盐水洗涤两次，收集含有重组醛酮还原酶的菌体细胞，分别获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-kakr菌体细胞、E.coli BL21(DE3)/pET28a-kxr菌体细胞和E.coli BL21(DE3)/pET28a-zbakr菌体细胞。

实施例6：重组醛酮还原酶对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯催化活力的测定

将实施例5中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-kakr、E.coli BL21(DE3)/pET28a-kxr和E.coli BL21(DE3)/pET28a-zbakr菌体细胞3g分别用30ml磷酸钾缓冲液(200mmol/L，pH7.0)重悬，超声破碎(功率400W，时间30分钟)，获得的细胞破碎液在12000转/分钟离心10分钟，以获得的上清液作为转化用酶(粗酶液)30ml，利用酶标仪测定重组醛酮还原酶的活力，方法如下：总反应体系为200μL，分别加入终浓度0.5mmol/L的NADH，终浓度0.5mmol/L 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，以pH7.0、200.0mmol/L磷酸钾缓冲盐为反应介质，30℃保温5分钟，加入0.1mL(相当于超声破碎前0.01g菌体细胞制备得到)粗酶液，检测340nm处吸光值的变化。酶活力定义为：在30℃条件下，1分钟消耗1微摩尔NADH所需的酶量为一个活力单位(1U)。活力测定均进行3次平行试验，取其平均值为最后结果。测定结果见表3。

实施例7：重组醛酮还原酶工程菌粗酶液催化6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯合成

分别将实施例6中获得的粗酶液为转化用酶，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行转化反应制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。转化体系(总体积10mL)组成及转化操作如下：10mL上述粗酶液(相当于超声破碎前菌体细胞1g)中添加了0.05g(0.22mmol)6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、0.22mmol NADH，30℃水浴摇床200转/分钟条件下反应12小时，12000转/分钟离心10分钟终止反应，取上清液检测6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生成及其d.e.值。

采用液相色谱检测生成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的d.e.值。检测条件：ODS-2C₁₈柱(4.6×250mm，5μm)，流动相乙腈：水＝1:3(v/v)，柱温40℃，流速1mL/分钟，紫外检测波长210nm，进样量20μL。6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯、6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯、6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯保留时间分别为7.4分钟、8.1分钟、12.5分钟。d.e.值测定均进行3次平行试验，取其平均值为最后结果。测定结果示于表3。

表3：重组醛酮还原酶酶活及立体选择性分析

转化液固液分离去除菌体等固形物后，加入1/3体积乙酸乙酯萃取澄清转化液三次，萃取条件为常温、常压、自然pH值。合并萃取相，静置分层，取有机相30℃减压蒸馏回收乙酸乙酯，所得油状液体即为6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯粗品。样品6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯萃取收率及d.e.值示于表4。

表4：重组醛酮还原酶粗酶液催化反应产物萃取收率及立体选择性

实施例8醛酮还原酶工程菌全细胞催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯

以实施例5中获得的重组醛酮还原酶菌体细胞为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行转化反应制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。转化体系组成及转化操作如下：总反应体系10mL，分别加入0.05g(0.22mmol)6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，0.05g 葡萄糖，1g重组醛酮还原酶菌体细胞，以10mL、200mmol/L磷酸钾缓冲盐(pH 7.0)为反应介质，30℃水浴摇床200转/分钟条件下反应12小时，12000转/分钟离心10分钟终止反应，取上清液检测产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯浓度及d.e.值。

采用液相色谱检测生成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的d.e.值。检测条件：ODS-2C₁₈柱(4.6×250mm，5μm)，流动相乙腈：水＝1:3(v/v)，柱温40℃，流速1mL/分钟，紫外检测波长210nm，进样量20μL。6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯、6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯、6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯保留时间分别为7.4分钟、8.1分钟、12.5分钟。d.e.值测定均进行3次平行试验，取其平均值为最后结果。测定结果示于表5。

表5：重组醛酮还原酶制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯

转化液固液分离去除菌体等固形物后，加入1/3体积乙酸乙酯萃取澄清转化液三次，萃取条件为常温、常压、自然pH值。合并萃取相，静置分层，取有机相30℃减压蒸馏回收乙酸乙酯，所得油状液体即为6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯粗品。样品6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯d.e.值99.5％以上，萃取收率94wt％(表6)。

表6：全细胞催化反应产物萃取收率及立体选择性

Claims

1.一种醛酮还原酶基因，其特征在于所述醛酮还原酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.5中的一种。

2.一种权利要求1所述醛酮还原酶基因编码的醛酮还原酶。

3.如权利要求2所述的酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6中的一种。

4.一种权利要求1所述醛酮还原酶基因构建的重组表达载体。

5.一种由权利要求4所述重组表达载体转化得到的重组基因工程菌。

6.一种权利要求2所述醛酮还原酶在催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原中的应用，其特征在于所述的应用为：以含醛酮还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞经超声破碎后的破碎混合液离心获得的上清液为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖或NADH为辅助底物，以pH7.0磷酸钾缓冲液为反应介质构成反应体系，在30℃、200转/分钟条件下进行转化反应，反应完全后，获得含6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的转化液，转化液经固液分离后，将液体用乙酸乙酯萃取、取乙酸乙酯层减压蒸馏，获得油状液体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯；所述底物的初始浓度为0.01～0.1mol/L反应体系，所述催化剂的用量以菌体细胞湿重计为50～300g/L反应体系，所述葡萄糖的用量为5～50g/L反应体系，所述NADH用量为0.02～0.1mol/L反应体系。

7.如权利要求6所述醛酮还原酶在催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原中的应用，其特征在于所述催化剂为菌体细胞经超声破碎后的破碎混合液离心获得的上清液，辅助底物为NADH时，所述底物的初始浓度为0.02～0.1mol/L反应体系，所述催化剂的体积用量以破碎前菌体细胞的湿重计为50～120g/L反应体系，所述NADH的用量为0.02～0.1mol/L反应体系。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于催化剂按如下方法制备：(1)菌体细胞的制备：将含醛酮还原酶的重组基因工程菌接种至含有终浓度50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养12小时，获得种子液；再将种子液以体积浓度1％的接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD₆₀₀0.6～0.8，然后加入终浓度为9.0g/L乳糖，28℃诱导培养12小时后，4℃、9000转/分钟离心10分钟，弃上清，沉淀用生理盐水洗涤两次，收集湿菌体；(2)超声破碎：将步骤(1)收集的湿菌体与200mmol/L、pH7.0磷酸钾缓冲液混合，在功率400W条件下超声破碎30分钟，获得破碎混合液，将破碎混合液离心，取上清液即为催化剂；所述缓冲液的体积用量以湿菌体重量计为10mL/g。

9.一种提供权利要求1所述SEQ ID No.1、SEQ ID No.3所示醛酮还原酶基因的菌株，所述菌株为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)XP1461，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年8月14日，保藏编号为CCTCC NO：M 2014380，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072。

10.一种提供权利要求1所述SEQ ID No.5所示醛酮还原酶基因的菌株，所述菌株为拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)XP1462，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年8月14日，保藏编号为CCTCC NO：M 2014381，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072。