CN103468585A

CN103468585A - 一株红曲菌株及其在制备功能性红曲中的应用

Info

Publication number: CN103468585A
Application number: CN2013103785894A
Authority: CN
Inventors: 陈福生; 冯艳丽
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-08-27
Filing date: 2013-08-27
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2033-08-27
Also published as: CN103468585B

Abstract

本发明公开了一株红曲菌株及其在制备功能性红曲中的应用。本发明提供的红曲（Monascus sp.）菌株MS-1，于2013年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2013295。通过形态学及ITS序列分析的方法将该菌株鉴定为丛毛红曲菌（M.pilosus）。该红曲菌株MS-1基因组中不含与桔霉素合成相关的ctnA、ctnE、ctnR、pksCT基因，不具有桔霉素合成的能力。本发明还提供了生产富含莫纳克林K（monacolin K）且不含桔霉素的功能性红曲的方法，包括：（1）将红曲菌MS-1接入种子培养基进行增殖培养，获得种子液；（2）将种子液接入发酵培养基进行固态发酵，采用变温培养，首先在30℃培养3d，后转入25℃培养11d。（3）发酵产物在55℃烘干后，即为功能性红曲。该功能性红曲monacolin K含量高，且无桔霉素检出。

Description

一株红曲菌株及其在制备功能性红曲中的应用

技术领域

本发明属于发酵工程与生物技术领域，尤其涉及一株高产莫那可林K（monacolin K）而不产桔霉素的丛毛红曲菌（Monascus pilosus）及其应用。

背景技术

红曲菌（Monascus spp.），又称为红曲霉，是我国重要的食用微生物资源，其以米饭为培养基质的固态发酵产品——红曲，在我国及东南亚地区作为食品着色剂、防腐剂、发酵剂与中药配伍等已有上千年的应用历史。研究表明，红曲菌能产生丰富的次级代谢产物，如莫那可林类物质（monacolins）、红曲色素（Monascus pigments）、γ-氨基丁酸、dimerumic acid等。但部分红曲菌株也可能产生真菌毒素——桔霉素（citrinin），从而污染红曲产品，带来安全隐患。为此，筛选不产或低产桔霉素的红曲菌株成为红曲菌研究的一个热点。

1979年，日本的远藤章从红色红曲菌（M.ruber）发酵液中分离得到一种可抑制体内胆固醇合成的活性物质莫那可林K(monacolin K,MK)。它通过抑制胆固醇合成限速酶——3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA）的活性，从而抑制胆固醇合成。另外，MK还具有抑制胶质瘤生长以及减少肿瘤恶化和肺癌细胞转移等功能。

近年来，研究人员通过分离筛选和诱变育种等传统方法选育高产MK且低产桔霉素的红曲菌株，或通过基因敲除技术对桔霉素的合成基因进行敲除，进而获得不产桔霉素的基因工程菌。但由于传统筛选方法工作量大，且目的性不强，很难获得理想的高产MK且不产桔霉素的红曲菌株；而采用基因工程技术构建的不产桔霉素的工程菌由于存在传代不稳定和潜在的安全隐患等备受争议。因此，如何获取高产MK且不产桔霉素的野生红曲菌株一直是困扰科研工作者的难题。而高产MK且不产桔霉素野生红曲菌株的获取及其生产特性研究将为红曲菌发酵生产MK带来新的契机。

发明内容

本发明提供一株丛毛红曲菌（Monascus pilosus）菌株MS-1。

本发明提供的丛毛红曲菌MS-1，其保藏编号为：CCTCC M2013295。

上述丛毛红曲菌MS-1在制备高MK含量红曲中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第二个目的是提供一种生产高MK含量红曲产品的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：采用固态发酵上述丛毛红曲菌MS-1,收集发酵产物，即可得到富含MK且不含桔霉素的红曲产品。

上述方法中，所述发酵的条件为首先在30℃培养3d，后转入25℃培养11d。

上述方法中，固态发酵生产富含MK红曲的培养基配方如下：将55g（20目）的早稻米粉和豆粉以6:4（w/w）的比例装入250mL三角瓶，用营养液[含有可将培养基中Mg²⁺调整至0.007mol/kg的MgSO₄·7H₂O和占培养基0.6%（v/w）冰醋酸的水溶液]将培养基含水量调整至20%，搅拌均匀后在121℃湿热灭菌20min并趁热打散。接种前，以无菌水将培养基含水量调整至35%。

上述方法中，将10%（v/w）的丛毛红曲菌MS-1种子液接入培养基中。

上述方法中，丛毛红曲菌MS-1的种子液是将10%（v/v）的丛毛红曲菌孢子悬液接入种子培养基中,在28℃,110r/min培养36h。

上述孢子悬液为将上述丛毛红曲菌MS-1在PDA上，28℃培养7d的红曲菌孢子用无菌水洗下，孢子浓度调整为10⁶cfu/mL。

上述方法中，丛毛红曲菌MS-1的种子液培养基如下：葡萄糖50g，蛋白胨10g，NH₄H₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂O0.5g，CaCl₂0.1g，以土豆汁（200g土豆去皮切块，加入1000mL蒸馏水，煮沸20min，过滤）溶解、定容至1000mL，pH调整为6.0。每个500mL三角瓶装入100mL种子培养基，并于121℃灭菌20min。

上述方法中，收集发酵产物后还包括如下步骤：在55℃烘干12h至恒重，并粉碎至80目。

上述菌株丛毛红曲菌MS-1已于2013年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称为CCTCC，地址为：湖北省武汉市洪山区八一路），保藏编号为：CCTCC M2013295，分类命名为丛毛红曲菌（Monascus pilosus）。

本发明的实验证明，对丛毛红曲菌MS-1发酵培养，可获取高MK含量的红曲产品且无桔霉素检出。该菌株及其发酵获取高MK含量且不含桔霉素红曲的方法具有广阔的应用前景。

附图说明

图1丛毛红曲菌株MS-1的菌落形态和显微形态。a菌落形态b显微形态。PDA：马铃薯葡萄糖琼脂培养基；MA：麦芽汁琼脂培养基；CYA：察氏酵母提取粉琼脂培养基；G25N：甘油硝酸盐琼脂培养基；25℃培养25d。

图2基于ITS1序列的丛毛红曲菌株MS-1的系统进化树

图3丛毛红曲菌株MS-1及红色红曲菌（M.ruber）M-7产桔霉素相关基因扩增结果。a1-4为丛毛红曲菌MS-1采用引物1-4对目的片段的扩增结果；5-8为红色红曲菌M-7采用引物1-4对目的片段的扩增结果。b1-4为丛毛红曲菌MS-1采用引物5-6对目的片段的扩增结果；5-8为红色红曲菌M-7采用引物5-6对目的片段的扩增结果，均采用不同剂量重复点样一次。

图4Monacolin K标准品及丛毛红曲菌株MS-1固态发酵产品的色谱图。a酸式monacolin K及内酯式monacolin K标准品色谱图b丛毛红曲菌MS-1固态发酵产品的色谱图

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均来自常规生化试剂商店购买得到。下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下面结合附图进一步详细说明本发明。

实施例1红曲菌MS-1的鉴定

对一株由红曲中分离获得的可产MK但不产桔霉素的红曲菌进行鉴定，主要采用形态学和ITS序列分析对其进行鉴定。

一、红曲菌MS-1的形态学鉴定

1、培养基

（1）麦芽汁琼脂培养基（MA）：10°Bx麦芽汁1000mL，琼脂15g。

（2）察氏酵母提取物琼脂培养基（CYA）：NaNO₃3.0g，K₂HPO₄1.0g，KCl0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，FeSO₄·7H₂O0.01g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20g，琼脂15g，加蒸馏水至1000mL。

（3）甘油硝酸盐琼脂培养基（G25N）：CYA培养基中加入25%甘油（w/w）。

（4）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）培养基：200g土豆去皮后，切成小块，加入1000mL蒸馏水煮沸20min，过滤后，加入20g葡萄糖，15g琼脂粉，用蒸馏水定容至1000mL。

以上4种培养基均在121℃下湿热灭菌20min。PDA、MA、CYA、G25N均用于红曲菌的菌落形态观察，PDA还用于菌种的活化。

2、菌落形态及显微形态观察

（1）菌落形态观察

将在PDA上活化后的红曲菌MS-1菌株分别接种到PDA、MA、CYA、G25N平皿培养基上，25℃培养，观察第7d和25d的菌落形态特征，包括菌落大小、颜色、形态等(图1，表1)。

表1红曲菌MS-1在不同培养基上的菌落形态

（2）显微形态观察

将活化后的分离菌株进行插片培养：用接种环挑取少量红曲菌孢子，在MA培养基上划线接种。取无菌盖玻片，倾斜（约45°）插入培养基中，每皿插入5-8片。将平板倒置在25℃温箱中培养。分别于第4、7、10、14、20d取盖玻片在光学显微镜下观察红曲菌的显微形态特征，包括菌丝形态、分生孢子形态、闭囊壳形态、子囊孢子形态等（图1，表2）。

表2红曲菌MS-1的显微形态

依据红曲菌分类学鉴定手册，红曲菌MS-1的显微形态与文献中描述的丛毛红曲菌特征相似，尤其是其分生孢子主要为单生，很少成链或仅成短链，其闭囊壳与红色红曲菌相比较小，子囊孢子为椭圆且较长。可初步认定该菌株属丛毛红曲菌。

二、红曲菌MS-1的ITS序列分析

1、ITS序列的扩增及测序

红曲菌MS-1基因组提取采用CTAB法，以红曲菌MS-1DNA为模板，ITS区域的扩增引物为ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。反应体系为25μL，其中包括红曲菌基因组DNA1μL，10μmol/L正向及反向引物各1μL，dNTP1μL，10×buffer2.5μL，2.5mmol/L Taq plus DNA Polymerase0.2μL，ddH₂O18.3μL。PCR反应程序：预变性95℃，5min，变性95℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃1min，共30循环，最后延伸72℃7min。采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，琼脂糖的加入量为0.8%，电压100v，25min，采用凝胶成像系统对结果进行分析。PCR产物采用试剂盒纯化，ITS片段的DNA测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。获得一条564bp的核苷酸序列（GenBank登录号：KF290997）。

2、ITS序列的同源比对及系统进化树的建立

将ITS完整序列及拆分后获得的ITS1和ITS2片段的基因序列与GenBank中相似性较高的菌株进行比对，选取同源性较高的序列比对建树。采用邻接法（Neighbor-joining，NJ），以MEGA v.5.0程序，选用Kimura-2-parameter间隔模型进行系统发育分析。置信度采用bootstrap分析重复1000次。图2为基于ITS1所构建的系统发育树。

依据红曲菌MS-1的ITS分析结果，结合上述形态学鉴定结果，进一步确认红曲菌MS-1为丛毛红曲菌。

上述菌株丛毛红曲菌MS-1已于2013年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称为CCTCC，地址为：湖北省武汉市洪山区八一路），保藏编号为：CCTCC M2013295，分类命名为丛毛红曲菌Monascus pilosus。

实施例2丛毛红曲菌株MS-1固态发酵产品的制备及MK和桔霉素检测

一、培养基

1、PDB培养基：PDA培养基不添加琼脂粉即为PDB培养基。

2、酵母提取物蔗糖（YES）培养基：酵母提取物40g/L，蔗糖160g/L，以蒸馏水定容至1000mL。

二、丛毛红曲菌株MS-1种子液的制备

同发明内容。

三、丛毛红曲菌株MS-1固态发酵产品的制备

将大米粉碎（20目），调整含水量为20%，在121℃灭菌20min并趁热打散，以10%(v/w)的接种量接种活化好的液体种子液并采用无菌水调整含水量，28℃培养14d。发酵完成的红曲米粉在55℃烘干12h，提取并分析MK及桔霉素的量。

四、丛毛红曲菌株MS-1固态发酵产品中MK及桔霉素的分析

1、丛毛红曲菌株MS-1固态发酵产品中MK分析

准确称取0.3g红曲米粉，加入10mL75%乙醇，超声提取1h，之后在12000r/min条件下离心10min，取上清液。上清液过0.22μm滤膜后进行高效液相色谱（HPLC）分析。

HPLC检测条件：液相色谱Waters2695，色谱柱inertsil ODS-34.6×250mm，流动相：乙腈:水:0.5%磷酸水溶液=60:37:3，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长238nm。

2、丛毛红曲菌株MS-1固态发酵产品中桔霉素分析

采用HPLC法检测红曲中桔霉素含量。在行标QB/T2847-2007基础上对固态发酵产品中桔霉素的提取进行部分修改，准确称取0.1～0.3g样品于试管中，以80%甲醇提取，料液比为1:10。混合均匀后超声提取40min（40KHz），在12000r/min，离心5min，将上清移除，沉淀中再加入与首次提取相同量的提取液，超声提取20min。离心后，合并上清液，将上清经膜（0.22μm）过滤后，进行HPLC分析。

HPLC检测条件为：液相色谱仪Waters2695，色谱柱inertsil ODS-34.6×250mm，流动相为乙腈:水:0.5%磷酸水溶液=70:25.5:4.5，流速0.8mL/min，柱温30℃，检测波长：激发波长300nm，发射波长500nm。

通过对丛毛红曲菌株MS-1红曲中MK及桔霉素的分析，发现该菌株具有高产MK的能力，但并未检测到其发酵产品中含有桔霉素。

实施例3丛毛红曲菌株MS-1桔霉素合成相关基因的分析

采用分子生物学手段，以桔霉素高产菌株红色红曲菌（M.ruber）M-7(CCAM070120)为阳性对照（Li L.,Shao Y.C.,Li Q.et al..Identification of Mga1,a G-protein α-subunit gene involved in regulating citrinin and pigment production in Monascus ruber M-7.FEMS Microbiology Letters.2010,308:108-114.），对其桔霉素合成相关基因（ctnA,ctnE,ctnR,pks CT）进行分析，红曲菌基因组提取方法同ITS序列分析，反应体系为25μL，其中包括红曲菌基因组DNA1μL，10μmol/L正向及反向引物各1μL，dNTP1μL，10×buffer2.5μL，2.5mmol/LTaq plus DNA Polymerase0.2μL，ddH₂O18.3μL。PCR反应程序为预变性95℃5min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，共30循环，最后延伸72℃7min。其中第5对及第6对引物（表3）采用的延伸时间为7min。采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，琼脂糖的加入量为0.8%，电压100v，25min-45min，采用凝胶成像系统对结果进行分析。由图3可知，在阳性对照菌株中均能扩增出桔霉素合成相关基因，而待测菌株中则未扩增出任何桔霉素合成相关基因。

表3扩增桔霉素相关基因所用引物

F:正向引物R:反向引物

证实该菌株至少缺失约15kb桔霉素合成相关基因，不具备合成桔霉素的能力。

实施例4丛毛红曲菌株MS-1产MK固态发酵条件的优化

一、丛毛红曲菌株MS-1产MK固态发酵条件优化

通过单因素实验对固态发酵过程中豆粉添加量、水分含量、乙酸添加量、金属离子添加量、变温培养时间、接种量和培养温度等进行优化。

二、优化后的工艺条件

将55g过20目筛的早稻米粉和豆粉以6:4（w/w）的比例装入250mL三角瓶，用蒸馏水（含有可将培养基中Mg²⁺调整至0.007mol/kg的MgSO₄·7H₂O和占培养基0.6%（v/w）的冰醋酸）将培养基含水量调整至20%，搅拌均匀后在121℃湿热灭菌20min并趁热打散。以无菌水将培养基含水量调整至35%，以10%的接种量接种培养好的种子液。首先在30℃培养3d后转入25℃培养11d。55℃烘干12h，粉碎至80目。

在上述优化条件下发酵14d，可获得MK含量17.74mg/g的红曲产品，其中酸式MK（monacolin K in acid form）占总量的90%以上，内酯式MK（monacolin K in lactone form）含量较少(图4)。

Claims

1.丛毛红曲菌（Monascus pilosus）MS-1，其保藏编号为：CCTCC M2013295。

2.权利要求1所述的丛毛红曲菌MS-1在制备富含monacolin K红曲中的应用。

3.一种生产富含monacoiln K的红曲产品的方法，是发酵权利要求1所述的红曲菌MS-1，收集发酵产物，即得到高monacolin K含量的红曲产品。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵条件采用变温培养，前期采用30℃培养3d，后转入25℃培养11d。

5.如权利要求4中所述方法，其特征在于：将55g（20目）早稻米粉和豆粉以6:4（w/w）的比例装入250mL三角瓶，用营养液（含有可将培养基中Mg²⁺调整至0.007mol/kg的MgSO₄·7H₂O和占培养基0.6%冰醋酸的水溶液）将培养基含水量调整至20%，搅拌均匀后在121℃湿热灭菌20min并趁热打散。接种前，以无菌水将培养基含水量调整至35%。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵为将权利要求1所述的丛毛红曲菌MS-1的种子液接种至所述的发酵培养基中培养，接种量为10%（v/w）。

所述种子液为将权利要求1所述的丛毛红曲菌MS-1的孢子溶液（10⁶cfu/mL）以10%（v/v）的接种量接入装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，28℃，110r/min，培养36h。所述的种子培养基配方如下：葡萄糖50g，蛋白胨10g，NH₄H₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂O0.5g，CaCl₂0.1g，以土豆汁（PDA配方中除去葡萄糖及琼脂粉）定容至1000mL，pH调整为6.0。

7.由权利要求4-6中所述方法制备的红曲产品在55℃烘干12h获得富含monacolin K的红曲产品。

8.由权利要求3-7中任一所述方法制备得到的红曲产品。

9.一种红曲产品，其活性成分为权利要求1所述的丛毛红曲菌MS-1或权利要求8所述的monacolin K。