CN114525212B

CN114525212B - 一株丛毛红曲霉工程菌及其应用

Info

Publication number: CN114525212B
Application number: CN202210099583.2A
Authority: CN
Inventors: 黄志伟; 张亚如; 陈志挺; 潘梦雨; 陈丽晨; 叶燕芳; 郑政淮
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2022-01-27
Filing date: 2022-01-27
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2042-01-27
Also published as: CN114525212A

Abstract

本发明公开了一株丛毛红曲霉工程菌及其应用，属于食品生物技术领域。本发明将红曲霉monacolin K(MK)合成基因簇上的外排泵基因mok I构建到真核表达载体pNeo0380上，获得了过表达载体pNeo‑mkI，进而遗传转化到丛毛红曲霉菌株CICC 5045中，经过筛选培养、红曲米发酵和检测分析，获得了一株MK产量大幅度提高且不产桔霉素的丛毛红曲霉工程菌Ti‑02，其固态发酵产物红曲米的MK总产量比出发菌株提高了87.8%，其中酸式MK的含量提高了1.3倍。本发明显著提高了丛毛红曲霉合成MK的能力，能显著降低降血脂药物的生产成本，具有很好的应用前景。

Description

一株丛毛红曲霉工程菌及其应用

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，尤其涉及一株丛毛红曲霉工程菌及其应用。

背景技术

红曲起源于中国，已有上千年历史，是近年来备受关注的功能性食品，经红曲霉发酵后的大米就是红曲米，其中含有多种活性物质，以色素、莫纳可林K（monacolin K, MK）和γ-氨基丁酸为主，有益于人体健康。近年来，研究人员通过发酵条件优化和筛选高产MK的红曲霉突变菌株等方法，提高了红曲霉的MK产量及其应用价值。同时，随着现代生物技术的不断发展，基因工程技术为改良红曲霉菌株提供了有效的手段，即通过基因工程手段促进次生代谢物合成关键基因的表达，从而提高其MK合成能力。

1979年，Endo首次从红色红曲霉（Monascus ruber）的培养物中分离出一种可抑制体内胆固醇合成的活性物质，并命名为monacolin K，该物质与Albert等从土曲霉（Aspergillus terreus）的培养物中分离获得的洛伐他汀（lovastatin）具有相同的分子结构。

MK具有降血脂、抗癌防癌、抗炎抑菌、保护神经等功效。MK降血脂功效的主要作用机理为：MK与人体内胆固醇合成途径的限速酶HMG-CoA还原酶（HMGR）的结构相似，能够对HMGR形成高效的竞争性抑制，从而达到降低胆固醇合成的效果。

如何提升MK的发酵产量是研究红曲的一大热点，首先选育高产MK突变菌株，优化发酵条件都能够在一定程度上提高MK的合成产量，例如利用紫外诱变筛选出来的红曲菌株合成MK的能力是初始菌株的2到5倍不等（常聪，2018）。另外，优化发酵基质也能起到显著效果，zhang等（2018）采用大米、小米、小麦和大麦等不同种类的谷物进行红色红曲霉（M. ruber）的固态发酵，结果发现小米为基质的MK产量最高（7.25mg/g）。

如今，利用分子生物技术研究MK的生物合成途径是研究红曲霉的新方向，红曲霉MK合成基因簇中部分基因的功能已经得到解析，其过表达能够显著提升红曲霉的MK产量，而且还可以实现异源表达。Sakai等（2012）以米曲霉(A. oryzae）作为宿主，成功地将MK合成基因簇在米曲霉中进行异源表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一株丛毛红曲霉工程菌及其应用。该丛毛红曲霉工程菌不仅高产莫纳可林K（monacolin K，MK），而且不产桔霉素。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株丛毛红曲霉工程菌Ti-02，其分类命名为：丛毛红曲霉（Monascus pilosus），该菌株已于2021年1月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO. 21449，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

上述一株丛毛红曲霉工程菌的制备方法，具体包括以下步骤：

1）将莫纳可林K（MK）合成基因簇上的外排泵基因mok I（其序列如SEQ ID No.1所示）构建到真核表达载体pNeo0380上，获得mok I基因的过表达载体pNeo-mkI。

2）采用农杆菌介导法，将过表达载体pNeo-mkI转化到丛毛红曲霉模式菌株CICC5045中，经筛选培育、红曲米发酵和检测分析，得到高产莫纳可林K（MK）且不产桔霉素的丛毛红曲霉工程菌Ti-02。

上述步骤1）具体为：设计合成mok I基因编码区两端的特异引物mkI1-4（5′-CCCAAGCTTATGGCTTCCCACCAGTCTGAGA-3′）和mkI2-4（5′-CGAGCTCCTAGACTCGTTCA TCGCGGC-3′），采用RT-PCR技术，从丛毛红曲霉模式菌株CICC 5045中克隆出mok I基因的编码区，其序列如SEQ ID No.1所示；将mok I基因的编码区构建到真核表达载体pNeo0380上，获得含有mok I基因的过表达载体pNeo-mkI。

上述步骤2）具体为：采用冻融法，将过表达载体pNeo-mkI转化到农杆菌AGL1中，获得含有mok I基因过表达载体的重组农杆菌AGL1/pNeo-mkI；将获得的重组农杆菌与丛毛红曲霉模式菌株CICC 5045进行共培养，经过筛选培育（利用含有80 µg/ml遗传霉素G418的培养基进行筛选培养）、红曲米发酵和检测分析，获得了高产monacolin K且不产桔霉素的丛毛红曲霉工程菌Ti-02。

上述一株丛毛红曲霉工程菌在莫纳可林K生产中的应用。

本发明的显著优点在于：

①成功获得了过表达mok I基因的丛毛红曲霉转化菌株Ti-02。

②丛毛红曲霉转化菌株Ti-02固态发酵产物红曲米的MK总产量分别比出发菌株相对提高了87.8%，其中酸式MK的含量分别比出发菌株提高了1.3倍。

③丛毛红曲霉不同转化菌株的固态发酵产物红曲米中均未检出桔霉素，市售红曲米样品的桔霉素含量为10.36 mg/kg。

附图说明

图1为mok I基因编码区的PCR扩增结果；M：DNA Marker DL2000，1：mok I基因编码区的PCR扩增产物。

图2为mok I基因过表达载体pNeo-mkI的示意图。

图3为丛毛红曲霉转化子的PCR鉴定结果；M：DNA Marker DL2000，1-3：阳性转化子，4：阴性对照（出发菌株CICC 5045），5：阳性对照（质粒pNeo-mkI）。

图4为丛毛红曲霉固态发酵产物中MK含量检测的HPLC图谱；A：酸式MK标准品的色谱图，B：内酯式MK标准品的色谱图，C：丛毛红曲霉转化菌株待测样品的色谱图，D：出发菌株待测样品的色谱图。

图5为丛毛红曲霉固态发酵产物中MK产量的HPLC检测结果。

图6为丛毛红曲霉固态发酵产物中桔霉素含量检测的HPLC图谱；A：桔霉素标准品的色谱图，B：丛毛红曲霉转化菌株待测样品的色谱图，C：市售红曲米待测样品的色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如：分子克隆实验指南（第三版）（Sambrook等著，黄培堂译，2002）中所述的条件，或者按照试剂制造厂商所建议的条件。

实施例：

（1）丛毛红曲霉mok I基因的克隆

①丛毛红曲霉总RNA的提取与检测

将丛毛红曲霉（Monascus pilosus）模式菌株CICC 5045接种于麦芽汁液体培养基中，培养4-5天后，采用美国Invitrogen公司的TRIzol试剂，按照其说明书的方法，从丛毛红曲霉的菌丝体中提取出总RNA。

总RNA完整性的检测：取5µl丛毛红曲霉总RNA，经1wt%琼脂糖凝胶电泳（6V/cm）20min后，呈现出三条清晰可区分的条带，分别为28S、18S和5.8S RNA，其中28S RNA和18SRNA的比例大约为2∶1，说明获得的丛毛红曲霉总RNA较为完整，可用于后续的RT-PCR等实验。

总RNA浓度和OD值的检测：取1µl丛毛红曲霉总RNA，用超微量紫外分光光度计（ND-2000C）检测其浓度和OD_260/280值，结果显示，丛毛红曲霉总RNA的浓度为1592.9 ng/µl，OD₂₆₀/OD₂₈₀=2.1，说明获得的总RNA纯度较高，可用于后续RT-PCR等实验。

②丛毛红曲霉mok I基因编码区的RT-PCR

采用宝生物工程（大连）有限公司的PrimeScript^® RT reagent Kit（PerfectReal Time），参照其说明书的方法（将37℃的反应时间改为60 min），将丛毛红曲霉总RNA反转录合成第一链cDNA。

根据GenBank已报道的丛毛红曲霉mok I基因的核苷酸序列（DQ176595.1），设计合成mok I基因编码序列两端的特异引物mkI1-4（5′-CCCAAGCTTAT GGCTTCCCACCAGTCTGAGA-3′）和mkI2-4（5′-CGAGCTCCTAGACTCGTTCA TCGCGGC-3′），分别在引物的5’端添加合适的酶切位点Hind Ⅲ和SacⅠ（引物序列的下划线部分）和保护碱基，用高保真酶PrimerSTAR^®HSDNA Polymerase进行PCR扩增，PCR反应条件：98℃ 5min；随之以98℃ 10sec，55℃ 5sec，72℃ 1.5min进行35个循环后，以72℃延伸10min，结果得到了约1.6kb的目的条带（图1）。对PCR扩增产物进行电泳和胶回收后，送往铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序。

测序结果表明，采用RT-PCR技术获得的丛毛红曲霉模式菌株CICC 5045的mok I基因的编码序列如SEQ ID No.1所示；序列分析结果表明，其与GenBank报道的mok I基因同源性为100%，编码区长度为1632 bp，编码543个氨基酸，其蛋白质的分子量约为57.3 kDa。

（2）mok I基因转化丛毛红曲霉

①mok I基因过表达载体的构建

对上述RT-PCR获得的mok I基因的编码区进行酶切后，将酶切产物回收并连接到pNeo0380载体上，然后对重组载体进行PCR和酶切鉴定以及测序验证，结果表明成功构建了mok I基因的过表达载体pNeo-mkI，载体图谱如图2所示。

②含有mok I基因的过表达载体pNeo-mkI转化丛毛红曲霉

采用冻融法，将过表达载体pNeo-mkI转化到农杆菌AGL-1中，经PCR和酶切鉴定，成功获得了含有mok I基因过表达载体pNeo-mkI的重组农杆菌AGL-1/pNeo-mkI。

制备丛毛红曲霉模式菌株CICC 5045的孢子悬浮液，然后将含有mok I基因的重组农杆菌AGL-1/pNeo-mkI与丛毛红曲霉孢子进行共培养，经过筛选培养，得到了一批丛毛红曲霉抗性转化子。

（3）丛毛红曲霉转化菌株的获得及其发酵培养和检测分析

①丛毛红曲霉抗性转化子的PCR鉴定

用软件Vector NTI 7.0设计一对正反向特异引物PgpdA-F1（5′-CTGCACTCGACCTGCTGAGGTC-3′）和mkI2-8（5′-CAATTTGGCTCAGACCCATCAT-3′），用于丛毛红曲霉抗性转化子的PCR鉴定，其扩增产物的大小为847bp。

先将重组农杆菌AGL1/pNeo-mkI与丛毛红曲霉菌株CICC 5045的分生孢子进行共培养后，利用含有80 µg/ml遗传霉素G418的筛选培养基进行筛选培养，得到丛毛红曲霉的一批抗性转化子。然后，将抗性转化子分别接种于麦芽汁液体培养基中，培养3-4天后，采用基因组DNA快速提取试剂盒（北京鼎国生物技术有限责任公司），从其菌丝体中提取基因组DNA，用引物PgpdA-F1和mkI2-8进行PCR扩增，结果表明：成功获得了一批过表达mok I基因的丛毛红曲霉转化菌株，命名为Ti-01、Ti-02、Ti-03、Ti-04、Ti-05、Ti-06（图3）。

②丛毛红曲霉转化菌株的发酵培养及其MK产量的HPLC检测

PDA培养基的配制：取200 g新鲜土豆削皮，切块，20 min沸水煮烂成汁，经四层纱布过滤后加入葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，加水溶解后定容至1000 mL，pH自然，121℃下高压灭菌20 min。

种子培养基的配制：葡萄糖50 g，蛋白胨5 g，酵母膏1 g，KH₂PO₄ 1 g，FeSO₄•7H₂O0.01 g，MgSO₄•7H₂O 0.5 g，加水溶解后定容至1000 mL，pH自然，121℃下高压灭菌20 min。

固态发酵培养基的配制：称取30 g大米，置于250 ml塑料发酵瓶中，加入6 g甘油与20 mL水，封口后于121℃下杀菌20 min。

不同菌株的发酵培养：丛毛红曲霉的转化菌株和出发菌株CICC 5045，分别接种在PDA平板上活化培养7天后，用无菌水冲取孢子，经三层擦镜纸过滤后，调整孢子的浓度至1×10⁶个/ml。按1wt%接种量接种于种子培养基中，28℃，220 rpm培养48h后备用。将种子液稀释至孢子浓度约为1×10⁷个/ml后，按照10wt%接种量接种至固态发酵培养基中，每个菌株分别做4个重复，28℃培养15天。

待测样品的前处理：将发酵完成的红曲米样品置于50℃的鼓风干燥箱中烘干至恒重，研磨粉碎后过80目筛子，称取1.0 g样品置于10 mL棕色容量瓶中，用75vol%乙醇定容至10 mL，超声处理30 min，期间摇匀一次，待超声完成后再摇匀一次，并静置5 min，随后取上清液经0.45 μm滤膜过滤后，用于HPLC进样检测。

酸式MK标准溶液的配制：称取1.5 mg MK标准样品，置于10 mL棕色容量瓶中，加入2 mL的0.2 mol/L NaOH溶液，再用75vol%乙醇溶解后定容至10 mL，50℃水浴30 min，期间振摇2次，使内酯式MK转化为酸式MK，配制成150 μg/mL的标准液，置于4℃冰箱中保存备用。

内酯式MK标准溶液的配制：称取1.5 mg MK标准样品，置于10 mL棕色容量瓶中，用75vol%乙醇溶解后定容至10 mL，配制成150 μg/mL标准液，置于4℃冰箱中保存备用。

采用美国Waters公司的e2695高效液相色谱仪检测上述红曲米样品中的MK含量，色谱条件如下：色谱柱为Waters SunFire C18（5 μm，4.6×120 mm），流动相为乙腈∶0.18%磷酸水溶液=55∶45（V/V）；流速为1 mL/min；检测器的波长为238 nm；柱温为30℃；进样量为20 μL。检测结果如图4和图5所示，不同转化菌株（Ti-01~Ti-06）固态发酵红曲米中的MK总产量分别为254.78、267.30、198.22、247.40、241.87、234.20 mg/kg，分别比出发菌株相对提高了79.0%、87.8%、39.3%、73.8%、69.9%、64.5%；其中酸式MK的含量分别为60.89、82.80、57.91、73.04、82.22、76.36 mg/kg，分别比出发菌株提高了0.7倍、1.3倍、0.6倍、1.1倍、1.3倍、1.1倍。

③丛毛红曲霉转化菌株发酵产物中桔霉素含量的HPLC检测

待测样品的前处理：将经过研磨并过80目筛子的红曲米粉末，称取1.0 g置于棕色容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，超声处理30 min，60℃水浴浸提60 min，5000 g离心20min，取上清液经0.45 μm滤膜过滤后，用于HPLC进样检测，并以市售红曲米作为对照。

桔霉素标准溶液的配制：精确称取桔霉素标准品1 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解后定容至10 mL，质量浓度为100 μg/mL，置于4℃冰箱中保存备用。

采用美国Agilent公司的1200infinity series高效液相色谱仪检测上述红曲米样品的桔霉素含量，色谱条件如下：色谱柱为Waters SunFire C18（5 μm，4.6 mm×250mm）；流动相为超纯水（用磷酸调pH至 2.5）∶乙腈=50∶50（V/V）；流速为1 mL/min；荧光检测器的波长为λex=331 nm，λem=500 nm；柱温为28℃；进样量为20 μL。检测结果如图6所示，丛毛红曲霉不同转化菌株（Ti-01~Ti-06）的固态发酵产物红曲米中均未检出桔霉素，而市售红曲米样品的桔霉素含量为10.36 mg/kg。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一株丛毛红曲霉工程菌及其应用

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> mkI1-4

<400> 1

cccaagctta tggcttccca ccagtctgag a 31

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> mkI2-4

<400> 2

cgagctccta gactcgttca tcgcggc 27

<210> 3

<211> 1632

<212> DNA

<213> SEQ ID No.1

<400> 3

atggcttccc accagtctga gaaagagaag ccacagagct gcaccactga agtccaggtc 60

agccatgtca ccggcctaaa gctaggactg gtagtaacct cggtgaccct ggtggtgttt 120

ttgatgttgt tggacatgtc tatcattgtg acagctatcc cccatatcac tgctcagttt 180

cattcccttg gggatgttgg atggtatgga agtgcgtatc ttttgtcgag ctgtgctcta 240

cagcccttgg cagggaagct ctacactctc ttgacattga agtatacctt cctagcattc 300

ctcggggtgt ttgaagtcgg atcagctctc tgtggcgccg cgcgttgttc aactatgttg 360

atcgtggggc gcgcagtggc tggcatggga ggatcggggc tcaccaatgg agccatcacc 420

atcctcgcct ctgcagctcc aaaacaacag caaccactgt taatcgggat catgatgggt 480

ctgagccaaa ttgccattgt ctgtggacca ttgctgggag gtgcttttac ccaacacgca 540

agttggcggt ggtgcttcta tatcaatctt cctgtcggag cgctggccgc catcctcctt 600

ctcgccatcc acattcctaa gagtgtgcca acatcggatt gcacaatgcc tgctcccaga 660

gctgttgggg tccgggtcat cctgagtcag ctcgatctcc tggggtttgt gctcttcgcc 720

gcctttgccg tgatgatctc acttgcgtta gaatggggcg ggtccgatta tatgtgggat 780

agctccgtaa tcatcggctt gttctgtggt gccggcatct cgctggtggt gtttgggttc 840

tgggaacgct acgtaggcaa ctcgatggcg atgattcctt tctcggtggc cagtcgtcga 900

caagtctggt gctcgtgtct tttcttgggc tttttctccg gggccttgct caccttctct 960

tactaccttc ctatctactt ccaggccgtg aaggacgtct ctcccaccat gagtggggtg 1020

tatatgcttc caggcatagg gggacaaatt gtgatggcga tcgtctccgg cgcaatcatc 1080

ggcaaaacgg ggtattacat tccctgggcg cttgccagtg ggatcatcgt atctatctcc 1140

gcaggcctgg tatcgacctt ccagccgcat acctcaatcg cagcgtgggt gatgtatcaa 1200

ttcatggggg gctttggtcg aggatgtgga atgcagaccc ccatcattgc cattcaacat 1260

gccctgccac cacaaatgag tgcgctcggt atctcgctgg ccatgttcgg ccagaccttc 1320

ggcggctccc tcttcctcac cttggccaag ctcgtcttca gcgccggcct tgacgccggc 1380

ttacgcgagt atgcgcccgc cgtcagcgca gaggcggtga cggccgcggg cgccacgggc 1440

ttccgcgatg tcgtccccgc aaatctcctt tctcaggttc tcctggcata ctgtaaaggg 1500

atagaccata cattctacct tgcggtcggg gcatcgggag ccactttttt gtttgcgtgg 1560

ggaatgggtc aggtcggttt gatttggtgg ggggaggaaa ggacggggtt cggccgcgat 1620

gaacgagtct ag 1632

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> PgpdA-F1

<400> 4

ctgcactcga cctgctgagg tc 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> mkI2-8

<400> 5

caatttggct cagacccatc at 22

Claims

1.一株丛毛红曲霉工程菌Ti-02，其特征在于：所述丛毛红曲霉工程菌Ti-02，其分类命名为：丛毛红曲霉（Monascus pilosus），该菌株已于2021年1月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.21449，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述的丛毛红曲霉工程菌Ti-02与其出发菌株相比，莫纳可林K生产能力显著提高。