CN116240233A - 一种提高灵芝三萜含量的方法 - Google Patents

Abstract

一种提高灵芝三萜含量的方法，是在灵芝中过表达SREBP基因。本发明方法使得灵芝中的三萜含量显著提高，与野生型灵芝对照菌株相比，总灵芝酸、羊毛甾醇、灵芝酸C2含量分别显著增加了1.87倍、1.89倍、2.75倍，为培养灵芝新菌株开辟了一条新的途径，具有良好的应用和开发前景；本发明方法工艺简单，成本低，适宜于工业化生产。

Description

一种提高灵芝三萜含量的方法

技术领域

本发明涉及一种提高灵芝三萜含量的方法，具体涉及一种通过转基因技术将SREBP基因转入灵芝细胞中过表达，从而提高灵芝三萜含量的方法。

背景技术

灵芝属（Ganoderma）是名贵的食用和药用真菌，药理学和生物化学研究表明，灵芝酸（ganoderic acids, Gas）是灵芝属中重要的药理活性成分，是一类高含氧的羊毛烷型三萜类化合物（Shiao, M.S. Natural products of the medicinal fungus Ganodermalucidum: occurrence, biological activities, and pharmacological functions.Chem Rec 3, 172-80 (2003)）。大量研究表明，灵芝酸具有多种生物学功能，如体外对多种肿瘤细胞的细胞毒作用、体内外抑制肿瘤侵袭、调节破骨细胞生成、保护肝脏、抗人类免疫缺陷病毒等。目前通过控制发酵策略、添加化学诱导剂和基因工程等方法，在提高灵芝酸产量的相关研究上已取得了一定的进展。

除了对灵芝酸进行药理分析和提高灵芝酸产量方面的研究外，还对灵芝酸生物合成的调控机制进行了一些研究。到目前为止，上游信号分子例如：活性氧、钙离子、cAMP和膜磷脂，在灵芝酸生物合成中的作用已被初步阐明。然而，这些已知信号分子的下游途径，特别是直接调控三萜生物合成基因表达的转录因子，对于三萜生物合成的调控机制仍然知之甚少。因此，目前还未见报导采用转基因技术过表达调控三萜生物合成基因表达的转录因子。

CN108929884A 公开了通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法，是通过将灵芝三萜生物合成相关的细胞色素P450酶（CYP）基因，在酿酒酵母细胞进行异源表达，对转基因酵母工程菌株的发酵产物进行分离纯化、质谱和核磁共振等分析，确定转基因酵母可以合成灵芝酸Z。但是，该技术并没有能够在灵芝细胞中提高灵芝三萜合成量。

CN101717782A公开了一种提高灵芝生物产量和多糖含量的方法，是通过转基因技术将来自水稻的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（OsUgo2）通过农杆菌介导转入灵芝细胞中，提高了灵芝生物产量和多糖含量。但是，并不涉及对灵芝三萜的含量影响。

固醇调节元件结合蛋白（Sterol Regulatory Element-Binding Protein，SREBP）是细胞核转录因子家族中的一员，是脂质代谢的重要调节者，具有basic helix-loop-helix leucine zipper，bHLH-ZIP结构，在哺乳动物中，SREBP直接调控固醇代谢以及脂质合成通路中关键酶基因的表达，在固醇代谢及脂肪酸代谢调控中发挥重要作用。动物细胞通过SREBP的反馈调节机制控制细胞内脂质和固醇含量的动态平衡（Horton, J.D.,Goldstein, J.L. & Brown, M.S. SREBPs: activators of the complete program ofcholesterol and fatty acid synthesis in the liver. J Clin Invest 109, 1125-1131 (2002)；Adam et al. The SREBP pathway in Drosophila: regulation bypalmitate, not sterols. Dev Cell 2, 229-238 (2002)）。在真菌烟曲霉菌中，SREBP可通过14-α-甾醇去甲基酶和C-4甲基甾醇氧化酶直接调节麦角甾醇的生物合成（Chung, D.,Barker, B.M., Carey, C.C., Merriman, B. & Werner, E.R. ChIP-seq and in vivotranscriptome analyses of the Aspergillus fumigatus SREBP SrbA Reveals a newregulator of the fungal hypoxia response and virulence. Plos Pathog 10,e1004487 (2014)）。此外，SREBP还能促进酵母叶黄菌的MVA途径（甲羟戊酸途径）中类胡萝卜素的合成和甾醇的合成（Gutierrez, M.S. et al. Sterol regulatory element-binding protein (Sre1) promotes the synthesis of carotenoids and sterols inXanthophyllomyces dendrorhous. Front Microbiol 10, 586 (2019)）。过表达SREBP研究表明，SREBP正向调控哺乳动物MVA通路中许多甾醇合成基因的表达，如3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶（甾醇生物合成的限速酶）、甲戊二酸激酶、角鲨烯合成酶和脂肪酸合成酶、长链脂肪酸酰基延长酶等脂肪酸合成基因（Horton, J.D., Goldstein, J.L. &Brown, M.S. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol andfatty acid synthesis in the liver. J Clin Invest 109, 1125-1131 (2002)）（Rawson & Robert, B. The SREBP pathway--insights from Insigs and insects. NatRev Mol Cell Bio 4, 631-640 (2003)）。但是，目前未见关于过表达SREBP提高灵芝三萜含量相关技术的报道。

综上，亟待找到一种基因，并通过其在灵芝中的过表达，以提高灵芝三萜含量的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种使得灵芝中三萜含量显著提高，工艺简单，成本低，适宜于工业化生产的提高灵芝三萜含量的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种提高灵芝三萜含量的方法，是在灵芝中过表达SREBP基因。本发明人研究发现，甾醇和三萜的合成都是通过羊毛甾醇上游催化合成，即MVA途径进行的，实验证明本发明方法所选的SREBP基因就是灵芝中直接调控三萜合成的转录因子。本发明人采用DAP-Seq技术（DNA affinity purificationsequencing，DNA亲和纯化测序），分析了SREBP互作DNA，共获得2271个SREBP结合位点；进一步分析启动子结合位点附近编码基因，共获得了1144个SREBP潜在调控靶基因，功能注释显示，SREBP靶基因中有5个编码萜类合成相关蛋白，并采用EMSA验证了SREBP与靶基因的启动子DNA的互作。说明SREBP是潜在调控灵芝三萜合成的转录因子蛋白。

优选地，通过农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300，利用多克隆位点区，在灵芝中插入从灵芝中克隆的gpd基因启动子以及SREBP基因，得过表达载体，记为GLgpd-SREBP；以潮霉素抗性基因为标记基因，通过农杆菌介导转化法，将过表达载体GLgpd-SREBP转入灵芝原生质体细胞，得SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株。本发明方法的发明思路是：通过转基因技术将三萜合成的调控基因SREBP转入灵芝真菌中，获得灵芝三萜含量稳定提高的转基因灵芝菌株，就能提高灵芝中的三萜含量。所述GL为Ganoderma lingzhi的简写。

优选地，所述SREBP基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

优选地，所述gpd基因启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

优选地，所述方法包括以下步骤：

（1）以含gpd基因启动子的灵芝基因组DNA为模板，设计引物扩增gpd基因启动子片段，得gpd基因启动子的PCR扩增产物，连接到农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300上，得载体，记为GLgpd；

（2）以灵芝cDNA为模板，设计引物扩增SREBP基因，得SREBP基因的PCR扩增产物，连接到步骤（1）所得载体GLgpd上，得过表达载体GLgpd-SREBP；

（3）将步骤（2）所得过表达载体GLgpd-SREBP导入农杆菌感受态EHA105细胞中，活化后，加入灵芝原生质体细胞溶液中，以潮霉素作为筛选抗生素，介导转化灵芝原生质体细胞，筛选转基因灵芝菌株，得SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株。

本发明方法中所使用的灵芝Ganoderma lingzhi 1006（NO. CGMCC 18819），购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

优选地，步骤（1）中，所述gpd基因启动子的上游、下游引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:3、4。所述灵芝基因组DNA采用现有技术进行提取。

优选地，步骤（1）中，所述gpd基因启动子的PCR扩增产物连接到农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300的方法是：在gpd基因上游引物的5’端设计EcoR I酶切位点，下游引物的5’端设计BamH I酶切位点，进行PCR扩增后，扩增产物进行EcoR I和BamH I双酶切处理，并将其连接入经EcoR I和BamH I双酶切处理的农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300质粒中，即成。所述农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300购于Cambia - Canberra, Australia。

优选地，步骤（2）中，所述SREBP基因的上游、下游引物的核苷酸序列依次为SEQ IDNO:5、6。所述灵芝cDNA采用现有技术进行提取。

优选地，步骤（2）中，所述SREBP基因的PCR扩增产物连接到步骤（1）所得载体GLgpd的方法是：在SREBP基因上游引物的5’端设计Xba I酶切位点，下游引物的5’端设计HandIII酶切位点，进行PCR扩增后，扩增产物进行Xba I和Hand III双酶切处理，并将其连接入经Xba I和Hand III双酶切处理的载体GLgpd质粒中。

优选地，步骤（3）中，所述过表达载体GLgpd-SREBP导入农杆菌感受态EHA105细胞的方法是：1）取50μL 的EHA105农杆菌感受态，于冰盒解冻后，加入3～5μL的质粒，冰浴4～6min；2）液氮速冻4～6min后，36～38℃水浴4～6min，再冰浴1～3min；3）加入800μL带有利福平的YEB培养基，26～30℃，150～250rpm培养3～4 h；4）6000～10000rpm离心1～3min，富集菌体弃上清，重悬菌液后，涂布至带有卡那霉素和利福平的YEB培养基上，26～30℃，倒置培养36～48h；5）菌液PCR鉴定。所述农杆菌感受态EHA105细胞购于擎科生物公司（北京）。所述过表达载体GLgpd-SREBP经过测序鉴定序列正确后，再导入。

优选地，步骤（3）中，所述活化至OD₆₀₀=0.4～0.6。细菌一般都冻存，使用时通常重新活化培养至OD₆₀₀=0.4～0.6，此时细菌活性较高。

优选地，步骤（3）中，所述活化的具体方法是：将导入过表达载体GLgpd-SREBP的农杆菌感受态EHA105细胞菌液，加至含有利福平和卡那霉素的液体YEB培养基中，一次摇床培养，离心，弃上清，用含乙酰丁香酮的IM诱导培养液重悬菌体后，二次摇床培养，即成。所述YEB培养基（1 L）的制备方法为：蛋白胨5.0 g，酵母粉1.0 g，牛肉膏5.0 g，七水合硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）0.493 g，蔗糖0.5g，用NaOH调节pH值至7.2，定容。固体YEB培养基中额外添加15.0 g琼脂粉，121℃，高压蒸汽灭菌20～25 min，即成。所述IM诱导培养液（100 mL）的成分为：诱导培养基（IM）：每升含有如下成分：K-Buffer：10 mL，M-N Solution：20 mL，1%CaCl₂：1 mL，0.01%FeSO₄：10 mL，20%NH₄NO₃：2.5 mL，Spore elements：5 mL，50%甘油：10 mL，1mol/L MES 40 mL，2 mol/L葡萄糖：5 mL；所述K-Buffer的成分为：K₂HPO₄ 200g/L，NaH₂PO₄145g/L；所述M-N Solution的成分为： MgSO₄·7H₂O 30g/L，NaCl 15g/L；所述Sporeelements的成分为：ZnSO₄·7H₂O 500mg/L，CuSO₄·5H₂O 500mg/L，H₃BO₃ 50 mg/L，MnSO₄·H₂O 500mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 500mg/L；所述MES（4-吗啉乙磺酸，1mol/L）的制备方法为：将19.524 g的MES溶至水中，用NaOH调节pH至5.5，最后定容至100 mL，水系滤膜（型号0.22 μm）过滤除菌后，分装8.5 mL至10 mL离心管中。

优选地，所述菌液与液体YEB培养基的体积比为1:400～600。

优选地，所述液体YEB培养基中，利福平和卡那霉素的浓度均为50～150μg/mL。

优选地，所述一次摇床培养的温度为25～30℃，转速为150～250rpm，时间为36～48h。

优选地，所述离心的相对离心力为7000～8000g，时间为4～6min。

优选地，所述菌液与IM诱导培养液的体积比为1:50～150。

优选地，所述乙酰丁香酮在IM诱导培养液中的浓度为150～250μmol/L。

优选地，所述重悬菌体至OD₆₀₀=0.25～0.30。

优选地，所述二次摇床培养的温度为25～30℃，转速为150～250rpm，时间为4～6h。

优选地，步骤（3）中，所述灵芝原生质体细胞溶液的制备方法是：在灵芝菌丝中，加入溶壁酶酶解液，混匀，水浴酶解，过滤，离心，弃上清，重悬洗涤，回溶，即成。

优选地，所述灵芝菌丝与溶壁酶酶解液的质量体积比g/mL为1:1～6。

优选地，所述溶壁酶酶解液的质量分数为1～3%。

优选地，所述水浴酶解的温度为25～35℃，时间为3～4h，酶解过程中，每隔25～35min颠倒混匀一次。

优选地，所述过滤是指：用灭菌的装有棉花的玻璃注射器过滤酶解后的原生质体2～3次。

优选地，所述过滤的温度为0～8℃。

优选地，所述离心的温度为0～8℃，相对离心力为10000～15000g，时间为8～12min。

优选地，用无菌甘露醇-MES溶液重悬洗涤2～3次。所述甘露醇-MES溶液的制备方法为：取14.5736 g甘露醇溶解至50 mL ddH₂O，再称取0.39048 g MES溶解后，定容至100mL，调节pH至4.5，过滤除菌后，分装9 mL至10 mL离心管中。

优选地，重悬洗涤时，每次无菌甘露醇-MES溶液的用量与灵芝菌丝的体积质量比mL/g为1～4:1。

优选地，用无菌甘露醇-MES溶液回溶。

优选地，所述回溶后的灵芝原生质体细胞溶液的浓度为10⁵～10⁷cfu/mL。

优选地，所述灵芝菌丝的培养方法是：取灵芝菌丝块接种至液体SDB培养基中，黑暗恒温培养后，将灵芝菌丝悬液离心，弃上清，重悬润洗，离心，弃上清，吸干菌丝体的水分，即成。

优选地，所述灵芝菌丝块与液体SDB培养基的质量体积比g/mL为1:30～150。所述液体SDB培养基（1 L）的制备方法为：将30 g SDB粉末溶解于蒸馏水中，即成。固体SDA培养基中另添加琼脂粉15.0 g，121℃，高压蒸汽灭菌15 min，即成。

优选地，所述恒温培养的温度为20～30℃，时间为3～5d，恒温培养过程中，每隔6～8h剧烈摇匀一次。

优选地，所述离心的相对离心力均为4000～6000g，每次离心的时间均为5～10min。

优选地，用PBS缓冲液重悬润洗2～4次。所述PBS缓冲液的制备方法为：将8 gNaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄和0.24 g KH₂PO₄溶于800 mL ddH₂O中，用盐酸溶液调节溶液pH值至7.4，定容至1000 mL，高压蒸汽灭菌，于4℃保存。

优选地，步骤（3）中，所述介导转化的方法是：将活化后的导入过表达载体GLgpd-SREBP的农杆菌感受态EHA105细胞菌液加入灵芝原生质体细胞溶液中，混匀，涂板到覆盖有玻璃纸的IM固体培养基上，避光共培养后，揭下IM固体培养基上的玻璃纸，将玻璃纸转移到含有羧苄青霉素和潮霉素的M-100固体培养基上，培养，长出菌落后，将菌落转移到含有羧苄青霉素和潮霉素的M-100固体培养基的24孔板内，复筛，即成。在介导转化过程中，灵芝原生质体细胞会由单细胞逐渐生长为白色丝状多细胞。所述IM固体培养基（100 mL）的制备方法为：在前述IM诱导培养液（100 mL）中，加入1.5 g琼脂粉，121℃，15 min高压蒸汽灭菌，即成。所述M-100固体培养基（100 mL）的成分为：M-100大量元素母液6.25%，葡萄糖1%、硝酸钾（KNO₃）0.3%、琼脂粉1.5%；所述M-100大量元素母液（500 mL）的成分为：磷酸二氢钾（KH₂PO₄）8 g，硫酸钠（Na₂SO₄）2 g，氯化钾（KCl）4 g，七水合硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）1 g，氯化钙（CaCl₂）0.5 g，M-100微量元素母液4 mL；所述M-100微量元素母液（500 mL）的成分为：硼酸（H₃BO₃）30 mg，四水合氯化锰（MnCl₂·4H₂O）70 mg，氯化锌（ZnCl₂）200 mg，二水合钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）20 mg，六水合氯化铁（FeCl₃·6H₂O）50 mg，五水合硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）200 mg。

优选地，所述农杆菌感受态EHA105细胞菌液与灵芝原生质体细胞溶液的体积比为1:0.8～1.2。

优选地，所述避光共培养的时间为1～3d。

优选地，所述M-100固体培养基中，羧苄青霉素和潮霉素的浓度均为50～150μg/mL。

优选地，所述M-100固体培养基上培养的时间为7～10d。

优选地，所述复筛的时间为5～7d。

本发明方法中，采用有机溶剂提取法提取总灵芝酸（GA）；采用高效液相色谱法测定总GA、羊毛甾醇和灵芝酸C2（GA-C2）含量。

本发明方法的有益效果如下：

（1）本发明方法通过转基因技术将调控基因SREBP转到灵芝细胞中去，获得三萜含量明显提高的转基因灵芝菌株，对转基因灵芝菌株进行融合基因PCR，qRT-PCR和Westernblotting鉴定，证明获得的转基因灵芝菌株成功过量表达了SREBP基因；

（2）本发明方法所得SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株中的三萜含量显著提高，与野生型灵芝对照菌株相比，总灵芝酸、羊毛甾醇、灵芝酸C2含量分别显著增加了1.87倍、1.89倍、2.75倍，为培养灵芝新菌株开辟了一条新的途径，具有良好的应用和开发前景；

（3）本发明方法工艺简单，成本低，适宜于工业化生产。

附图说明

图1是本发明实施例1中SREBP过表达载体GLgpd-SREBP示意图；

图2是本发明实施例1中SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株在含有潮霉素（100 μg/mL）的M-100固体培养基生长5d的情况；

图3是对本发明实施例1中的gpd基因启动子和SREBP基因融合的PCR鉴定；

图4是对本发明实施例1所得SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株中SREBP基因表达水平的qRT-PCR分析；

图5是用Western blotting分析本发明实施例1所得SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株中的SREBP蛋白质水平；

图6是野生型灵芝菌株和本发明实施例1所得SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株中的总GA含量对比；

图7是野生型灵芝菌株和本发明实施例1所得SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株中的羊毛甾醇含量对比；

图8是野生型灵芝菌株和本发明实施例1所得SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株中的GA-C2含量对比；

图中，所述野生型菌株即未进行载体导入的灵芝菌株。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的灵芝Ganoderma lingzhi 1006（NO. CGMCC 18819），购于中国普通微生物菌种保藏管理中心；所使用的农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300购于Cambia - Canberra, Australia；所使用的农杆菌感受态EHA105细胞购于擎科生物公司（北京）；所使用的YEB培养基、IM诱导培养液、甘露醇-MES溶液、液体SDB培养基、PBS缓冲液、IM固体培养基的制备方法详见说明书；所使用的M-100固体培养基的成分详见说明书；本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

本发明实施例中，采用有机溶剂提取法提取总GA；采用高效液相色谱法测定总GA、羊毛甾醇和GA-C2含量。

实施例1

一种提高灵芝三萜含量的方法，是在灵芝中过表达SREBP基因；

即通过农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300，利用多克隆位点区，在灵芝中插入从灵芝中克隆的gpd基因启动子以及SREBP基因，得过表达载体，记为GLgpd-SREBP；以潮霉素抗性基因为标记基因，通过农杆菌介导转化法，将过表达载体GLgpd-SREBP转入灵芝原生质体细胞，得SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株；所述SREBP基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；所述gpd基因启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

具体包括以下步骤：

（1）以含gpd基因启动子的灵芝基因组DNA为模板，设计引物扩增gpd基因启动子片段，得gpd基因启动子的PCR扩增产物，连接到农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300上，得载体，记为GLgpd；

所述gpd基因启动子的上游、下游引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:3、4；

所述gpd基因启动子的PCR扩增产物连接到农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300的方法是：在gpd基因上游引物的5’端设计EcoR I酶切位点，下游引物的5’端设计BamH I酶切位点，进行PCR扩增后，扩增产物进行EcoR I和BamH I双酶切处理，并将其连接入经EcoR I和BamH I双酶切处理的农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300质粒中，即成（如图1所示）；

灵芝基因组DNA的提取：采用 CTAB 法，具体操作为：取适量灵芝菌丝体在液氮中快速研磨成粉末状；在 2 mL 离心管中提前加入2×CTAB抽提缓冲液（65℃），然后将灵芝粉末转入离心管中，65℃孵育1.5h，间或轻摇混匀；4℃，12000g下，离心5min；取上清液，加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），轻轻缓慢混匀，并保证混合均匀；4℃，12000g下，离心10min；取出离心管，此时液体分为三相，小心用移液枪转移顶部水相到新的离心管中，加入相同体积的氯仿，混匀后，在12000g下，离心10min；小心用移液枪转移上层水相至新的离心管中，加入无水乙醇（2倍体积）和醋酸钠（3mol/L，1/10 体积），混匀后于-20℃下，放置1h进行沉淀；4℃，12000g下，离心10 min；弃上清，用700μL乙醇（70%）清洗DNA沉淀，4℃，12000g下，离心10min；将DNA沉淀放置于超净工作台中进行风干，最后溶解于超纯水中并加入适量RNAase于37℃消化RNA，取5μL DNA样品经电泳检测后，于-20℃保藏备用；

（2）以灵芝cDNA为模板，设计引物扩增SREBP基因，得SREBP基因的PCR扩增产物，连接到步骤（1）所得载体GLgpd上，得过表达载体GLgpd-SREBP；

所述SREBP基因的上游、下游引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:5、6；

所述SREBP基因的PCR扩增产物连接到步骤（1）所得载体GLgpd的方法是：在SREBP基因上游引物的5’端设计Xba I酶切位点，下游引物的5’端设计Hand III酶切位点，进行PCR扩增后，扩增产物进行Xba I和Hand III双酶切处理，并将其连接入经Xba I和Hand III双酶切处理的载体GLgpd质粒中（如图1所示）；

灵芝cDNA的制备方法：在新的1.5 mL的离心管中加入17μL RNA溶液，然后加入3μL的Oligo（dT）（100 mmol/L）；72℃下，保温10 min后，冰浴10 min；离心20s；在上述离心管中配制下列反转录反应液：5×M-MLV Buffer，6μL；dNTPs（each 10 mmol/L），3μL；RNaseInhibitor（40U/μL），0.5μL；M-MLV（RNaseHˉ），0.5μL；总体积10 μL；42℃下，保温45min；95℃下，变性5min后，冰上冷却，即成；

（3）将步骤（2）所得过表达载体GLgpd-SREBP导入农杆菌感受态EHA105细胞中，活化至OD₆₀₀=0.5后，加入灵芝原生质体细胞溶液中，以潮霉素作为筛选抗生素，介导转化灵芝原生质体细胞，筛选转基因灵芝菌株，得SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株（挑选3株分别命名为SREBP过表达菌株-1、2、3，如图2所示）；

所述过表达载体GLgpd-SREBP导入农杆菌感受态EHA105细胞的方法是：1）取出一管50μL的EHA105农杆菌感受态，于冰盒解冻后，加入4μL的质粒，冰浴5min；2）液氮速冻5min后，37℃水浴5 min，再冰浴2min；3）加入800μL带有利福平的YEB培养基，28℃，200rpm培养3.5h；4）8000 rpm离心2min，富集菌体弃上清，重悬菌液后，涂布棒涂布至带有卡那霉素和利福平的YEB培养基上，28℃，倒置培养42h；5）菌液PCR鉴定；所述过表达载体GLgpd-SREBP经过测序鉴定序列正确后，再导入；

所述活化的具体方法是：将10μL导入过表达载体GLgpd-SREBP的农杆菌感受态EHA105细胞菌液，加至含有利福平（100μg/mL）和卡那霉素（100μg/mL）的5mL液体YEB培养基中，在28℃、转速为200rpm下，一次摇床培养42h，在相对离心力为7500g下，离心5min，弃上清，用1mL含乙酰丁香酮（200 μmol/L）的IM诱导培养液重悬菌体至OD₆₀₀=0.3后，在28℃、转速为200 rpm下，二次摇床培养5h，至OD₆₀₀=0.55，即成；

所述灵芝原生质体细胞溶液的制备方法是：在2mL灭菌EP管内的1g灵芝菌丝中，加入1mL溶壁酶酶解液（质量分数为2%），混匀，在30℃下，水浴酶解3.5h（酶解过程中，每隔30min颠倒混匀一次），在4℃下，用灭菌的装有棉花的玻璃注射器过滤酶解后的原生质体3次，将滤液置于2 mL EP管中，在4℃、相对离心力为12000g下，离心10min，弃上清，每次用1mL无菌甘露醇-MES溶液重悬洗涤2次，用1 mL无菌甘露醇-MES溶液回溶，得浓度为10⁶cfu/mL的灵芝原生质体细胞溶液；

所述灵芝菌丝的培养方法是：取5块1 cm²的灵芝菌丝块，共2g，接种至100mL液体SDB培养基中，在25℃下，在恒温培养箱中，黑暗恒温培养4d（恒温培养过程中，每隔7h剧烈摇匀一次）后，将灵芝菌丝悬液移到50 mL EP管中，在相对离心力为5000g下，离心8min，弃上清，用PBS缓冲液重悬润洗3次，每次在相对离心力为5000g下，离心8min，弃上清，用移液枪吸干菌丝体的水分，即成；

所述介导转化的方法是：将100 μL活化后的导入过表达载体GLgpd-SREBP的农杆菌感受态EHA105细胞菌液加入100 μL灵芝原生质体细胞溶液中，混匀，涂板到覆盖有玻璃纸的IM固体培养基上，避光共培养2d后，揭下IM固体培养基上的玻璃纸，将玻璃纸转移到含有羧苄青霉素（100 μg/mL）和潮霉素（100 μg/mL）的M-100固体培养基上，培养8d，长出菌落后，将菌落转移到含有羧苄青霉素（100 μg/mL）和潮霉素（100 μg/mL）的M-100固体培养基的24孔板内，复筛6d，即成。

由图1可知，载体示意图展示了灵芝gpd基因启动子和SREBP基因装载到了pCAMBIA1300质粒，该质粒命名为GLgpd-SREBP。

由图2可知，SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株可以在潮霉素抗性平板上生长，而野生型灵芝菌株不能。

为了验证SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株已经成功导入了GLgpd-SREBP质粒，对本发明实施例1所得SREBP过表达菌株-1、2、3中的gpd基因启动子和SREBP基因的融合基因进行PCR，qRT-PCR和Western blotting鉴定。

（1）gpd基因启动子和SREBP基因的融合基因的PCR鉴定：

取灵芝基因组DNA进行gpd基因启动子和SREBP基因的融合PCR鉴定，PCR引物序列为：gpd-SREBP-F：CTTGACGGTTCACTGGTTT；gpd-SREBP-R：CGCTCTTGCTCCTCCTT；

PCR扩增体系为：组分名称：10.0 μL体系；2X Pro Taq Master Mix：5.0 μL；基因组DNA：1.0 μL；Primer F：0.2 μL（10 μmol/L）；Primer R：0.2 μL（10 μmol/L）；RNase freewater：3.6 μL；

PCR反应程序为：94℃，30s；98℃，10s；58℃，30s；72℃，1 kb/min；72℃，2 min；循环30次；PCR结果如图3所示；

由图3可知，SREBP过表达菌株-1、2、3中，能够PCR克隆到gpd基因启动子和SREBP基因的融合基因片段，其中，质粒为阳性对照。

（2）gpd基因启动子和SREBP基因的融合基因的qRT-PCR鉴定：

灵芝总RNA 的提取：采用Trizol法提取，具体操作为：取适量灵芝菌丝在研钵中用液氮快速研磨成粉末状，在无菌离心管中预先加入RNAiso plus（800μL），取适量研磨好的灵芝菌丝粉末加入离心管中，剧烈混匀，室温下，静置5 min；4℃，12000g下，离心5min，转移上清至新的离心管中，加入上清1/5体积的氯仿，上下颠倒混匀15s，室温下，静置5min；4℃，12000g下，离心15min，此时溶液分为三层，转移上清于到新的1.5mL离心管中，加入相同体积的异丙醇，混匀后，于室温下，静置10min；4℃，12000g下，离心10min，弃上清，加入500μL预冷的乙醇（70%(v/v)）洗涤沉淀；4℃，12000g下，离心1min，弃上清；将离心管放置于超净工作台内，室温干燥5min，加入适量DEPC水溶解，溶解好的灵芝总 RNA 于超低温保存；取适量提取的RNA样品用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，备用。

灵芝总RNA中DNA的消化：在50μL体系中加入如下试剂：10×DNase I buffer，5μL；RNase-Free DNaseI，2μL；RNA酶抑制剂（40 U/μL），0.5μL；RNA，25μL；ddH₂O，17.5μL。将消化液于37℃下，温浴30min；加入50μL ddH₂O混匀，加100μL的氯仿/异戊醇（24:1）振荡，冰浴10min；4℃，12000rpm下，离心5min，转移上清至新离心管；加2.5倍体积无水乙醇，1/10倍体积0.3mol/L NaAc 混匀，-70℃放置30min；4℃，12000rpm下，离心10min，弃去上清液，75%乙醇洗涤后，晾干；加50μL无RNase的水，电泳检测RNA的质量；剩余RNA于-70℃贮藏。

灵芝 cDNA 的制备：如前所述。

qRT-PCR扩增程序如下：95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40个循环；Meltingcurve；

qRT-PCR的数据处理：选以灵芝18S rRNA为内参基因，按照 2-ΔΔCT方法对目标基因的表达进行计算，SREBP基因在野生型菌株中的表达量设置为1；计算结果如图4所示。

qRT-PCR引物序列为：SREBP-F2：TGGCACTGTCGGAAACAC，SREBP-R2：GCTCGGTCGCCTTAGAAC；18S-F：TCGAGTTCTGACTGGGTTGT，18S-R：TCCGTTGCTGAAAGTTGTAT。

由图4可知，SREBP过表达菌株-1、2、3中，SREBP基因的转录水平显著高于野生型菌株，说明SREBP在转基因菌株中过量表达。

（3）gpd基因启动子和SREBP基因的融合基因的Western blotting鉴定：

SREBP多克隆抗体是通过将SREBP-bHLH蛋白结构域发送到具有专业资质的抗体制备公司（Chemgen Biotech, Shanghai, China），由兔子免疫所获得的。在12% (w/v) SDS-PAGE凝胶中分离野生型菌株和SREBP过表达菌株-1、2、3菌丝菌株的蛋白质，转移到聚偏二氟乙烯膜（Bio-Rad）上，与兔抗SREBP一抗抗体孵育，然后与HRP山羊抗兔IgG抗体孵育。β-Actin蛋白作为内参，用小鼠β-Actin特异性一级抗体（1:2000,a T0097, CMCTAG）和HRP山羊抗小鼠IgG抗体进行检测。

灵芝菌丝细胞质和核蛋白组分分离：使用细胞核和细胞质分离提取试剂盒执行（Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents, Thermo Fisher Scientific, IL,USA）。β-Tubulin抗体（1:2000,A T0003, CMCTAG）和Histone-H3抗体（1:2000,A T0005,CMCTAG）分别作为细胞质和核内参。

由图5可知，Western blotting分析显示本发明实施例1所得SREBP过表达菌株-1、2、3中的SREBP蛋白质水平显著升高，特别是细胞核形式的SREBP蛋白显著增加，为野生型菌株的1.63～2.11倍，显著高于野生型菌株。

为了证明过表达SREBP对灵芝三萜含量的影响，在发酵培养7天后，检测野生型菌株和转基因菌株细胞中的总GA、羊毛甾醇和GA-C2含量。

a. 总GA含量的测定：2g干菌丝体用100 mL 75%(v/v)乙醇提取3h，提取2次，用离心法去除菌丝体后，在真空下干燥上清液；用水悬浮残留物，然后用100mL氯仿提取2 h，提取2次；样品经蒸发除去氯仿后，再用200mL 5%(w/v) NaHCO₃提取12h，加入2mol/L的盐酸溶液调节pH值至3；用200mL氯仿提取NaHCO₃层中的总灵芝酸12h，蒸发除去氯仿后，用无水乙醇溶解，以熊果酸为标准，在245nm处测定吸光度；根据熊果酸标准曲线，计算总GA含量；

b. 羊毛甾醇含量的测定：使用Agilent 1290超高效液液相色谱仪（UPLC）根据出峰时间和峰面积分别绘制羊毛甾醇的浓度梯度曲线，即标准曲线；收取发酵完成的灵芝菌丝，于60°C 烘干至恒重，并使用研钵研磨成粉末状；在2mL离心管中称取粉末0.03g，加入1.5mL 10% KOH-75%乙醇溶液，于50°C水浴锅中，孵育2h，间或轻轻摇匀；冷却后，12000g下，离心10min，取上清液于5mL离心管中，使用相同体积的正己烷萃取，取上层溶液到新的试管中，重复萃取3次；使用N₂吹干，在试管中加入500μL色谱级甲醇进行溶解，充分溶解后，使用0.22μm有机相滤器过滤；UPLC上样，使用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱子，上样条件为：以100%甲醇为流动相，进样流速为0.5 mL/min，进样量为1μL，检测波长为210nm；根据出峰时间和峰面积以及标准曲线计算鲨烯和羊毛甾醇的含量（Xu, J.W., Xu, Y .N. &Zhong, J.J. Production of individual ganoderic acids and expression ofbiosynthetic genes in liquid static and shaking cultures of Ganodermalucidum. Appl Microbiol Biotechnol 85, 941-8 (2010)）；

c. GA-C2含量的测定：用甲醇提取100mg干燥菌丝，上清液中GA-C2含量采用Agilent 1200系列高效液相色谱法，Agilent Zorbax b-c18色谱柱（250×4.6 mm，5µm）在254 nm处测定；以GA-C2（＞99%，MedChem Express）为标准构建了测定真菌菌丝体中GA-C2的校准曲线；根据出峰时间和峰面积以及标准曲线计算GA-C2的含量。

由图6～8可知，相较于野生型菌株，本发明实施例1所得SREBP过表达菌株-1的总GA、羊毛甾醇、GA-C2含量分别显著增加了1.87、1.89、2.75倍；SREBP过表达菌株-2的总GA、羊毛甾醇、GA-C2含量分别显著增加了1.81、1.83、2.52倍；SREBP过表达菌株-3的总GA、羊毛甾醇、GA-C2含量分别显著增加了1.86、1.79、2.51倍。说明本发明方法实施例1所得SREBP过表达菌株-1、2、3中的三萜含量均显著提高。

Claims (9)

1.一种提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：在灵芝中过表达SREBP基因。

2.根据权利要求1所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：通过农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300，利用多克隆位点区，在灵芝中插入从灵芝中克隆的gpd基因启动子以及SREBP基因，得过表达载体，记为GLgpd-SREBP；以潮霉素抗性基因为标记基因，通过农杆菌介导转化法，将过表达载体GLgpd-SREBP转入灵芝原生质体细胞，得SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株；所述SREBP基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；所述gpd基因启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.根据权利要求2所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以含gpd基因启动子的灵芝基因组DNA为模板，设计引物扩增gpd基因启动子片段，得gpd基因启动子的PCR扩增产物，连接到农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300上，得载体，记为GLgpd；

（2）以灵芝cDNA为模板，设计引物扩增SREBP基因，得SREBP基因的PCR扩增产物，连接到步骤（1）所得载体GLgpd上，得过表达载体GLgpd-SREBP；

（3）将步骤（2）所得过表达载体GLgpd-SREBP导入农杆菌感受态EHA105细胞中，活化后，加入灵芝原生质体细胞溶液中，以潮霉素作为筛选抗生素，介导转化灵芝原生质体细胞，筛选转基因灵芝菌株，得SREBP基因过表达的转基因灵芝菌株。

4.根据权利要求3所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述gpd基因启动子的上游、下游引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:3、4；所述gpd基因启动子的PCR扩增产物连接到农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300的方法是：在gpd基因上游引物的5’端设计EcoR I酶切位点，下游引物的5’端设计BamH I酶切位点，进行PCR扩增后，扩增产物进行EcoR I和BamH I双酶切处理，并将其连接入经EcoR I和BamH I双酶切处理的农杆菌双元表达载体pCAMBIA1300质粒中，即成。

5.根据权利要求3或4所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述SREBP基因的上游、下游引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:5、6；所述SREBP基因的PCR扩增产物连接到步骤（1）所得载体GLgpd的方法是：在SREBP基因上游引物的5’端设计Xba I酶切位点，下游引物的5’端设计Hand III酶切位点，进行PCR扩增后，扩增产物进行Xba I和Hand III双酶切处理，并将其连接入经Xba I和Hand III双酶切处理的载体GLgpd质粒中。

6.根据权利要求3～5之一所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述过表达载体GLgpd-SREBP导入农杆菌感受态EHA105细胞的方法是：1）取50μL 的EHA105农杆菌感受态，于冰盒解冻后，加入3～5μL的质粒，冰浴4～6min；2）液氮速冻4～6min后，36～38℃水浴4～6min，再冰浴1～3min；3）加入800μL带有利福平的YEB培养基，26～30℃，150～250rpm培养3～4 h；4）6000～10000rpm离心1～3min，富集菌体弃上清，重悬菌液后，涂布至带有卡那霉素和利福平的YEB培养基上，26～30℃，倒置培养36～48h；5）菌液PCR鉴定。

7.根据权利要求3～6之一所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述活化至OD₆₀₀=0.4～0.6；所述活化的具体方法是：将导入过表达载体GLgpd-SREBP的农杆菌感受态EHA105细胞菌液，加至含有利福平和卡那霉素的液体YEB培养基中，一次摇床培养，离心，弃上清，用含乙酰丁香酮的IM诱导培养液重悬菌体后，二次摇床培养，即成；所述菌液与液体YEB培养基的体积比为1:400～600；所述液体YEB培养基中，利福平和卡那霉素的浓度均为50～150μg/mL；所述一次摇床培养的温度为25～30℃，转速为150～250rpm，时间为36～48h；所述离心的相对离心力为7000～8000g，时间为4～6min；所述菌液与IM诱导培养液的体积比为1:50～150；所述乙酰丁香酮在IM诱导培养液中的浓度为150～250μmol/L；所述重悬菌体至OD₆₀₀=0.25～0.30；所述二次摇床培养的温度为25～30℃，转速为150～250rpm，时间为4～6h。

8.根据权利要求3～7之一所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述灵芝原生质体细胞溶液的制备方法是：在灵芝菌丝中，加入溶壁酶酶解液，混匀，水浴酶解，过滤，离心，弃上清，重悬洗涤，回溶，即成；所述灵芝菌丝与溶壁酶酶解液的质量体积比g/mL为1:1～6；所述溶壁酶酶解液的质量分数为1～3%；所述水浴酶解的温度为25～35℃，时间为3～4h，酶解过程中，每隔25～35min颠倒混匀一次；所述过滤是指：用灭菌的装有棉花的玻璃注射器过滤酶解后的原生质体2～3次；所述过滤的温度为0～8℃；所述离心的温度为0～8℃，相对离心力为10000～15000g，时间为8～12min；用无菌甘露醇-MES溶液重悬洗涤2～3次；重悬洗涤时，每次无菌甘露醇-MES溶液的用量与灵芝菌丝的体积质量比mL/g为1～4:1；用无菌甘露醇-MES溶液回溶；所述回溶后的灵芝原生质体细胞溶液的浓度为10⁵～10⁷cfu/mL；所述灵芝菌丝的培养方法是：取灵芝菌丝块接种至液体SDB培养基中，黑暗恒温培养后，将灵芝菌丝悬液离心，弃上清，重悬润洗，离心，弃上清，吸干菌丝体的水分，即成；所述灵芝菌丝块与液体SDB培养基的质量体积比g/mL为1:30～150；所述恒温培养的温度为20～30℃，时间为3～5d，恒温培养过程中，每隔6～8h剧烈摇匀一次；所述离心的相对离心力均为4000～6000g，每次离心的时间均为5～10min；用PBS缓冲液重悬润洗2～4次。

9.根据权利要求3～8之一所述提高灵芝三萜含量的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述介导转化的方法是：将活化后的导入过表达载体GLgpd-SREBP的农杆菌感受态EHA105细胞菌液加入灵芝原生质体细胞溶液中，混匀，涂板到覆盖有玻璃纸的IM固体培养基上，避光共培养后，揭下IM固体培养基上的玻璃纸，将玻璃纸转移到含有羧苄青霉素和潮霉素的M-100固体培养基上，培养，长出菌落后，将菌落转移到含有羧苄青霉素和潮霉素的M-100固体培养基的24孔板内，复筛，即成；所述农杆菌感受态EHA105细胞菌液与灵芝原生质体细胞溶液的体积比为1:0.8～1.2；所述避光共培养的时间为1～3d；所述M-100固体培养基中，羧苄青霉素和潮霉素的浓度均为50～150μg/mL；所述M-100固体培养基上培养的时间为7～10d；所述复筛的时间为5～7d。

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