CN117187225A - 一种橙花叔醇合成酶及应用 - Google Patents

一种橙花叔醇合成酶及应用 Download PDF

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CN117187225A CN202311043804.5A CN202311043804A CN117187225A CN 117187225 A CN117187225 A CN 117187225A CN 202311043804 A CN202311043804 A CN 202311043804A CN 117187225 A CN117187225 A CN 117187225A
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recombinant bacterium
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叶紫玲
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Abstract

本申请公开了一种橙花叔醇合成酶及应用，包括采用本申请的橙花叔醇合成酶的编码基因整合入核酸构建体中导入宿主细胞，获得重组菌，从而使所述编码基因在重组菌中表达，进而实现橙花叔醇的生物合成。采用本申请的重组菌和生物合成橙花叔醇的方法，橙花叔醇的产量显著提高。

Description

一种橙花叔醇合成酶及应用
本申请是申请日为2022年04月29日的中国专利申请号2022104734884、发明名称为“一种橙花叔醇合成酶及应用”的分案申请。
技术领域
本申请属于橙花叔醇生物合成领域，具体涉及一种橙花叔醇合成酶及应用。
背景技术
橙花叔醇是一种倍半萜化合物，最初是从橙花中发现的，所以被命名为橙花叔醇，后来它被发现存在于香茅、薰衣草、柠檬草和生姜等芳香植物中。橙花叔醇具有广泛的生物功能，如杀螨、抗草食动物、抗菌、抗氧化、抗炎和抗焦虑等活性，是一种很有发展前景的植物化学药物。同时它也是草食动物诱导的挥发性物质DMNT的合成中间体，可以保护植物免受草食动物的伤害。另外，橙花叔醇被美国食品和药物管理局(FDA)允许作为食品调味剂使用。
橙花叔醇的合成方式主要有三种，植物提取、化学合成以及生物合成。植物提取与化学合成受到种种限制如工艺过程复杂，受季节影响产率低，提取成本高；此外，植物提取和化学合成往往有有毒试剂参与反应，对坏境影响大、同时产物中可能有较多的溶剂残留以及有毒试剂残留，产品安全性有待提高。代谢工程和合成生物学为工程微生物细胞工厂可持续高效地生产橙花叔醇提供了另一种途径。
发明内容
本申请的目的在于提供一种橙花叔醇合成酶，以及其在生物合成橙花叔醇中的应用。
本申请为解决上述技术问题，提出了如下技术方案：
本申请第一方面提供了一种橙花叔醇合成酶，其包含Pfam编号为PF01397和PF03936的结构域，且具有橙花叔醇合成酶活性。
本申请第二方面提供了一种多核苷酸分子，其包含编码本申请第一方面所提供的橙花叔醇合成酶的核苷酸序列或其互补序列的至少一种。
本申请第三方面提供了一种核酸构建体，其包含本申请第二方面所提供的多核苷酸分子的至少一种。
本申请第四方面提供了一种重组菌，其包含本申请第二方面所提供的多核苷酸分子，或本申请第三方面所提供的核酸构建体。
本申请第五方面提供了采用本申请第一方面的橙花叔醇合成酶、本申请第二方面的多核苷酸分子、本申请第三方面的核酸构建体或本申请第四方面的重组菌生产橙花叔醇的用途。
本申请第六方面提供了一种橙花叔醇的制备方法，其包括采用本申请第四方面的重组菌生物合成橙花叔醇。
本申请鉴定出一种新型的橙花叔醇合成酶以及其编码基因，将所述橙花叔醇合成酶的编码基因整合入核酸构建体中导入宿主细胞，获得重组菌，从而使所述编码基因在重组菌中表达，进而实现橙花叔醇的生物合成。采用本申请的重组菌和生物合成橙花叔醇的方法，橙花叔醇的产量显著提高。
附图说明
图1显示了质粒pZY900构建示意图；
图2显示了质粒pYR013、pYR007、pArar-TPS27、pArar-TPS28、pYR006、pYR010构建示意图；
图3为菌株CCJ-1、S900发酵产物中橙花叔醇特征离子m/z＝93提取离子流色谱图；
图4为菌株CCJ-1、S900发酵产物中橙花叔醇的质谱图；
图5为菌株LXF-1、LXF-1-1、LXF-1-2、S900发酵产物中橙花叔醇特征离子m/z＝93提取离子流色谱图；
图6为菌株LXF-1、LXF-1-1、LXF-1-2、S900发酵产物中橙花叔醇的质谱图；
图7为菌株AH-1、AH-2、S900发酵产物中橙花叔醇特征离子m/z＝93提取离子流色谱图；
图8为菌株AH-1、AH-2、S900发酵产物中橙花叔醇的质谱图；
图9显示了质粒pYR020、pYR021、pYR017、pYR018构建示意图；
图10A显示了质粒pYH395构建示意图；
图10B显示了ERG9启动子上游激活顺式元件(-220至-175)敲除元件构建示意图；
图11为pZY521敲除盒构建示意图；
图12显示了含橙花叔醇合酶CCJ_TPS23的菌株摇瓶发酵产量；
图13显示了含橙花叔醇合酶ACH_TPS07的菌株摇瓶发酵产量。
具体实施方式
本文使用的术语和说明仅仅是为了描述特定的实施方案，而不意在限制本申请。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
定义
如本文所用，术语“一个”和“一种”以及“所述”和类似的指代物指示单数和复数，除非本文另外指明或上下文明显矛盾。
如本文所用，术语“约”和“类似于”是指在本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，所述误差范围可部分取决于该值的测量或确定方式，或取决于测量系统的局限性。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其呈单链或双链形式的聚合物。除非明确地限制，否则术语“核酸”或“多核苷酸”还包括含有已知的天然核苷酸的类似物的核酸，其具有与参照核酸相似的结合性质，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢(参见，属于Kariko等人的美国专利No.8278036，其公开了尿苷被假尿苷替代的mRNA分子，合成所述mRNA分子的方法以及用于在体内递送治疗性蛋白的方法)。除非另有所指，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、单核苷酸多态性(SNP)和互补序列以及明确指出的序列。
“构建体”是指任何重组多核苷酸分子(例如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体、线性或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子)，其可衍生自任何来源，能够与基因组整合或自主复制，其可以以可操作的方式连接一个或多个多核苷酸分子。本申请中，构建体通常包含本申请的多核苷酸分子，其可操作地连接至转录起始调节序列，这些序列会导引本申请的多核苷酸分子在宿主细胞中的转录。可使用异源启动子或内源启动子导引本申请的核酸的表达。
“载体”是指任何重组核酸构建体，该构建体可用于转化的目的(即将异源DNA引入到宿主细胞中)。载体可以包含用于在生物体中生长的抗性基因和用于在生物体中表达目的蛋白质的启动子。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。其他载体可以引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。此外，某些优选的载体能够指导与它们连接的外源基因的表达。一种类型的载体是“质粒”，其通常是指可以连接入另外的DNA区段(外源基因)的环状双链DNA环，也可以包括线性双链分子，诸如从通过聚合酶链式反应(PCR)的扩增或用限制酶处理环状质粒得到线性双链分子。
质粒载体包括载体骨架(即空载体)与表达框架。
术语“表达框架”是指具有编码蛋白质潜能的序列。
术语"宿主细胞"指的是能够将目的基因导入，并为目的基因克隆和/或表达提供条件的细胞，诸如微生物，具体地可以为细菌(诸如大肠杆菌)、酵母菌(诸如酿酒酵母)、放线菌等。
术语“重组菌”指的经过基因工程改造的菌(如细菌、酵母菌、放线菌等)，这意味着它们的菌体中引入了外源基因片段，其中，改造的一种方式包括菌体基因组被引入新的DNA片段后发生了改变，另一种方式包括菌体中引入了经过人工构建或改造过的质粒，从而使菌体获得表达目的基因的能力。
本申请第一方面提供了一种橙花叔醇合成酶，其包含Pfam编号为PF01397和PF03936的结构域，且具有橙花叔醇合成酶活性。
在一些实施方式中，所述橙花叔醇合成酶来自除虫菊、落新妇或艾蒿。
在一些实施方式中，所述的橙花叔醇合成酶具有与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述橙花叔醇合成酶具有以下氨基酸序列(氨基末端至羧基末端)：
CCJ_TPS23(除虫菊来源)
MIINNCVTPKDTQPAPLPSETDIVSNDINIKNELSLKHLELLEEVRYLLKNYSSEPLDMVDALQKLCINHYYEDEIGLILKLLYARMSNNGDYKHDKSLYEVSLSFRILRQEGYYVSADVFADFKQKDGKFKEEIAQDVKGLMALYEASQLSLDGERILEEASDFSSGALKDMVPSLDLHQAMIATNTLQHTYQRTSSTFMVKKFMKVYTGTPMCELAQLELTTKVQSLHRTELEQISRWWKDLGLAQELKLARNQPLHWYLWPMASLTDLSLSEQRIELTKPIAFIFLIDDIFDVYGTLDQLVILTQAVNRWESNSLERLPHHLRICIQALFDVTNEISDNIYKKHGFNPIDFLKQSWINLCEAFLVEAKWFAEGYMPTAEDYLNNGMVSTGAHVVIVHMFFLLGGGPNIKSASVVNENQGITSCLAKILRLWDDLGSAEDVDQDGNDGSYVTYYMKENAGCSIQKAHEHVMEMISNTWKQLNAECLYSSHLSRTFTKACLNLARMIPMMYDYDENHSLPFIKEYINSMF(SEQ ID NO.1)
ACH-TPS07(落新妇来源)
MAPPPSSYPPSARNNFTQVGTGLSDTMNEPSTQKWSITSHDGTLVSSPIILHNSKANNACYTDEFHVDHESKLNEVRDLLNKVGEDYQLEGLVMIDAIQCLNIDYRFRKEIESILQSQDETSRVHENDEHDLYQTALRFRLLRQEGHFVSAEVFDKFKNKEGKFKQELVEDIRGMMGLYEAAQLRIEGEHILDEAESFCRRLFKGCMPYLNSHEAKLVESTLKHPYRKSLSRIGAKNFANNFQGNFKWITVLEELSNLDLKIVQSIHQKELQQISHWWEELGLAKELKLARDQPLKWHMWSMEVLQDPSLSEQRIELTKPISLVYIIDDIFDVYGTLDELTLFTEAVTRWEFTDANQLPNYMRTCFQTLFDITYEIGYKFFIVHGWNPIDTLRKSWVTLCKAFLAEAKWFASGELPKADKYLKNGIISSGVHVVLVHMFFLLGQDLTKECLDLVNDNNNIPGIINYTATILRLWDDLGSAKDENQDGYDGSYLECFMNEHKGLLMKTAREHMIGMISDAWKCLNKECLSPNPFSSSFTKASLNAARMVPLMYNYDDNHCLPDLEEHIQCLF(SEQ ID NO.2)
Arar-TPS27(艾蒿来源)
MTISVTRKDTQPTPFPSETDIVSNDINIKNELSIRHLELLEEVRNLLKNCSSKPLVMVDTLQKLCINHHYEEEIGLILKSLYTRMSNNDDYKHDKSLYEVSLSFRILRQHGYYVSADVFANFKQKDGKFKGEITQDLKGLIALYEASQLSLEGEQILKEASDFSSGALKEMMPSLDQDQAMIVTNTLQHTYQRTTSTFMVKKFMKVYTGTPMCELAQLELTKVQSLHRTEVDQISRWWKGLGLAQELKLARNQPLHWYLWPMASLTDLSLSEQRVELTKPIAFIFLIDDIFDVYGTLDQLVILTQAVNRWESNRLEQLPYHLRICIQALFDVTNEISDKIYKKHGFNPIEFLKQSWINLCDAFLVEAKWFAEGYMPTAEDYLNNGMVSTGVHVVIVHMFFLLGGGPNIKSASVVNENQGIMSCLAKILRLWDDLGSAKDVDQDGNDGSYVTYYMKENAGCSIQKAHEHVMEMISNTWKQLNAECLYSSHFSRTFTKACLNLAKMIPMMYDYDENHSLPFIEEYINSMF(SEQ ID NO.3)
Arar-TPS28(艾蒿来源)
MSINILHGDLPDVKVMSPQADATEKIDELKEKIRRVLMTTSDPKMSLKLVDTIQRLRIGYYFQEDINEILEKLKQCLPDDELHIVALCFRLLRQNGIPTNSEVFRKFIDMNGEFIKSTSEDIEGLLSLYEASYMGSNEEIFLVHAKKITTRELNICVPKLSPKLSKKVLQALELPMHLRMETLEARRYIEDYGNEEDHNPLLLELAKLDYNHVQSLFRRELVEMARWWNHLGIARKFSFVRDRHVECFLWTVGVLPEPKYSATRIVMAKITSILLLLDDIYDTYGSYDDLVLLTKIIQRWDMTEIEQLPEYMQACYMALYNTTSEICDKVLRERGLYVEQFLRKTWIKIVEGYMVEVKWLKTGTIPNFKEYMDNAVTTSGSYMAFVHMFFLICDEVNKENMADLLEPYPKFFTLAGTILRLWDDLGTVKEEQERGEVLSSIQLLMKEKKITCDKDERKQILELIHELWKDLNAELVAPNAVLWPMIRVAL NMSRTSQVVYQHNEDSYLSSVKDHVKNLFFKAIDM(SEQ ID NO.4)
ACH-TPS08(落新妇来源)
MAPPPSSYPPSARNNFTQVGTGLGDTMNEPSTQKWSITSHDGTLVSSPIILHNSKANNACYTDEFHVDHERKLNEVRDLLNKVGEDYQLEGLVMIDAIQCLNIDYHFRKEIESILQCQDETSRVHENDEHDLYQTALRFRLLRQEGHFVSAEVFDKFKNKEGKFKQELVEDIRGMMGLYEAAQLRIEGEHILDEAESFCRRLFKACMPYLNSHEARLVESMIKHPYRKSLSRIGAKNFANNFQGNFKWITVLEELSNLDLKIVQSIHQKELQQISHWWEELGLAKELKLARDQPLKWHMWSMEVLTDPSLSEQRIELTKPISLVYIIDDIFDVYGTLDELTLFTEAVTRWEFTDVNQLPNYMRTCFQTLFDITYEIGYKFFIVHGWNPINTLRKSWVTLCKAFLAEAKWFASGELPKADKYLKNGIISSGVHVVLVHMFFLLGQDLTKECLDLVNDNNNIPGIINYTATILRLWDDLGSAKDENQDGYDGSYLECFMNEHKGLLMKTAREHMIGMISDAWKCLNKECLSPNPFSSSFTKASLNAARMVPLMYNYDDNHCLPDLEEHAMFVLNMINVT(SEQ ID NO.11)
ACH-TPS09(落新妇来源)
MAPPPSSYPPSARNNFTQVGTGLGDTMNEPSTQKWSITSHDGTLVSSPIILHNSKANNACYTDEFHVDHERKLNEVRDLLNKVGEDYQLEGLVMIDAIQCLNIDYHFRKEIESILQCQDETSRVHENDEHDLYQTALRFRLLRQEGHFVSAEVFDKFKNKEGKFKQELVEDIRGMMGLYEAAQLRIEGEHILDEAESFCRRLFKACMPYLNSHEARLVESMIKHPYRKSLSRIGAKNFTNNFQGNFKWITVLEELSNLDLKIVQSIHQKELQQISHWWEELGLAKELKLARDQPLKWHMWSMEVLTDPSLSEQRIELTKPISLVYIIDDIFDVYGTLDELTLFTEAVTRWEFTDVNQLPNYMRTCFQTLFDITYEIGYKFFIVHGWNPIDTLRKSWVTLCKAFLAEAKWFASGELPKADKYLKNGIISSGVHVVLVHMFFLLGQDLSKECLDLVNDNNNIPGIINYTATILRLWDDLGSAKDENQDGYDGSYLECFMNEHKGLLMKTAREHMIGMISDAWKCLNKECLSPNPFSSSFTKASLNAARMVPLMYNYDDNHCLPDLEEHAMFVLNMINVT(SEQ ID NO.12)。
本申请第二方面提供了一种多核苷酸分子，其包含编码本申请第一方面所提供的橙花叔醇合成酶的核苷酸序列或其互补序列的至少一种。
在一些实施方式中，所述多核苷酸分子包含与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述多核苷酸分子包含如下所示的核苷酸序列(5’末端至3’末端)：
CCJ_TPS23(除虫菊来源)
atgatcatcaacaattgtgttacaccgaaagacacccagccagcccctctcccatctgaaacagatattgtgtcaaatgacattaacattaagaatgaattgtccctcaaacatctagaattgttagaagaagtccgatatcttctaaagaattattcttccgaacctttggacatggttgacgctcttcaaaaactttgcatcaaccattactatgaagacgagattggcttgattttgaaattgctctacgctagaatgtcgaataatggcgactacaagcatgataaaagtctttatgaggtttccctttcttttcgcatccttcgtcaagaaggttactatgtctcagctgatgtttttgctgatttcaaacaaaaggatgggaagtttaaagaagaaatagcacaagatgttaagggtctaatggcgttatatgaagcttcacagctaagcctggatggagaacgaatacttgaagaggcttcagattttagcagtggtgctcttaaagacatggtgccttctttagatctacatcaagctatgattgctactaacacattacaacatacgtatcaaagaacctcatcaactttcatggttaaaaaattcatgaaagtatacacgggtacacccatgtgtgaactagcccaattagagttgactactaaagtccagtcactacatcgaacagaactagaacaaatctccagatggtggaaggacttggggttggcgcaagagttgaagcttgcaagaaaccaaccgttgcact ggtacttatggccaatggctagcctcacagatctcagcttgtccgagcagagaattgagctcacgaagcccattgctttcatctttctaattgatgacatttttgatgtttatggaactctagaccaacttgttatcttgacacaagcagtgaatagatgggaaagtaacagccttgaacgactcccacatcacctaaggatctgtattcaagctctatttgacgtaacaaacgaaataagtgacaatatctacaagaagcatgggttcaatcccattgattttttgaaacaatcgtggataaacctttgtgaagcttttctagtagaggcgaaatggtttgctgagggatacatgccgacggcagaggattacttgaataatgggatggttagtacaggggcacatgtcgtgatagtgcacatgttcttcctcctcggtggtggccctaacataaaaagtgctagcgttgtaaacgaaaaccaagggattacgtcttgtttggcaaagattcttcgtctttgggatgacttaggaagtgctgaggatgtggatcaagacggtaatgatggatcatatgtgacatattacatgaaagagaatgcaggttgttctattcaaaaggcacatgaacatgttatggaaatgatatcgaatacttggaagcaactaaatgcggagtgcctttactcaagtcatttatcacgtacattcaccaaagcttgcctcaatcttgcaagaatgattccaatgatgtacgattatgatgagaatcattcccttcctttcatcaaggaatatataaactccatgttttaa(SEQ ID NO.5)
ACH-TPS07(落新妇来源)
atggcaccccctccttcctcctatcctccaagtgctcgaaacaattttacacaagttggcacaggacttagtgatacgatgaacgagccttctactcagaaatggagcattaccagccatgatggcaccttagtttcaagccctataatacttcacaactctaaagcaaacaatgcttgttatactgatgaatttcatgtcgatcatgaaagcaaattgaatgaagttagggatttgcttaacaaagttggagaagattatcaattagaaggtttggtcatgatcgacgccattcaatgcctaaacattgactatcgcttccgaaaggagattgagtccatcctacaaagtcaggatgagacatctagggttcatgaaaatgatgaacacgatctttaccagactgcacttcgttttcgactgctgagacaagaaggccattttgtgtctgcagaagtgtttgacaaattcaagaacaaagaggggaagtttaagcaagaactagttgaagatataaggggaatgatgggcttatatgaagctgcgcagcttagaattgaaggagaacatatacttgatgaagccgaaagcttttgtcgtcggctctttaaaggatgcatgccctatcttaactctcatgaagcaaaacttgtcgagagcacgctaaagcatccctatcgaaagagcttgtcacgcataggggccaaaaacttcgctaacaatttccaaggcaattttaaatggattactgttcttgaagaactatcaaatttagatttgaaaatagttcaatctatacaccagaaggaactacaacaaatttcccattggtgggaagaacttggtttagcaaaggaattgaagctcgcaagagaccaaccgctaaaatggcacatgtggtccatggaagtgttacaagatccaagcttgtctgagcaaaggattgagcttacaaagcccatttctcttgtatacataattgatgacattttcgacgtttatgggacgcttgatgaactcactctcttcacggaagcagtcactagatgggaattcaccgacgcaaatcaactgcctaactacatgaggacatgtttccagactctctttgatatcacttatgaaattggctacaagtttttcatagttcatggttggaaccctatagacacactacgaaaatcgtgggttactttgtgcaaagcatttttggcggaagcaaaatggtttgcttctggggaattgccaaaggcagataaatacttgaaaaatggaattattagttcaggagtgcatgtagtacttgttcacatgttttttctcttgggtcaagatttaacaaaggaatgtttagacctagtgaacgacaacaacaatattccaggcatcataaactatacggcaacgattcttcgtctttgggatgacttgggaagtgcaaaggatgagaatcaagatgggtacgacggatcatatctggaatgtttcatgaatgaacacaaaggtttattaatgaagactgcaagagagcatatgattggcatgatttcggatgcatggaagtgcttgaacaaggaatgcctctctccaaatccattttcatcatctttcacaaaggcttctcttaatgctgcaaggatggttccattgatgtacaattacgacgacaaccattgtctcccagatcttgaggagcatatacaatgtttgttttaa(SEQ ID NO.6)
Arar-TPS27(艾蒿来源)
atgacaatctctgttactagaaaggatactcaaccaacaccatttccatctgaaactgatattgtttctaacgatatcaacatcaagaacgaattgtctattagacatttggaattgttggaagaagttagaaatttgttgaagaactgttcttctaagccattagttatggttgatactttacaaaagctgtgtattaaccatcattacgaagaagaaatcggtttgattttgaaatctttgtacacaagaatgtccaataacgatgattataagcatgataagtccttatacgaagtttctttgtcttttagaatcttgagacaacatggttattacgtttctgctgatgtttttgctaattttaagcaaaaggacggtaaatttaagggtgaaattacacaagatctgaaaggtttaatcgctttatatgaagctagtcaattgtctttggaaggtgaacaaattttaaaggaagctagtgatttctcttctggtgctttgaaagaaatgatgccatctttggatcaagatcaagctatgattgttacaaatactttgcaacatacctaccaaagaacaacttctacttttatggttaagaagttcatgaaggtttacactggtacaccaatgtgtgaattggctcaattggaattgactaaagttcaatctttgcatagaacagaagttgatcaaatttctagatggtggaaaggtttaggtttggctcaagaattaaaattagctagaaaccaaccattgcattggtatttatggccaatggcttctttgactgatttgtctttgtctgaacaaagagttgaattgactaagccaattgcttttattttcttgatcgatgatatcttcgacgtttatggtactttggatcaattagttatcttgactcaagctgttaatagatgggaatctaatagattagagcaattaccataccatttgagaatttgtatccaagctctatttgatgttacaaatgaaatctctgacaagatttacaagaagcatggttttaatccaatcgaatttttgaagcaatcctggattaatttgtgtgatgcttttttggttgaggctaaatggtttgctgaaggttatatgccaactgctgaagattatttaaacaatggtatggtttccacaggtgttcatgttgttattgttcatatgtttttcctgttgggtggtggtccaaatattaaatctgcttctgttgttaacgagaatcaaggtattatgtcttgtttggctaaaattttgaggttatgggatgatttaggttctgctaaagatgttgatcaagatggtaatgatggttcttatgttacatattacatgaaggaaaacgctggttgttctattcaaaaagctcatgaacatgttatggaaatgatttctaacacttggaaacaattgaacgctgaatgtttatattcctctcatttttctaggacattcactaaagcatgtttgaatttggctaaaatgatcccaatgatgtatgattatgacgaaaatcattccttgccatttattgaagaatacattaactccatgttctaa(SEQ ID NO.7)
Arar-TPS28(艾蒿来源)
atgtctatcaacatcttgcatggtgatttgccagatgttaaagttatgtctccacaagctgatgctacagaaaaaattgatgaattaaaggagaagatcaggagagttttgatgactacatctgatccaaaaatgtctttaaagttggttgatactatccaaagattgagaattggttattacttccaagaagatatcaacgaaatcttggaaaaattgaagcaatgtttgccagatgatgaattgcatattgttgctttgtgttttagattgttgagacaaaatggtatcccaacaaattctgaagtttttagaaagttcatcgacatgaatggtgaatttattaagtctacttccgaagatatcgaaggtttgttatctttgtatgaagctagttatatgggttctaatgaagaaattttcctggttcatgctaaaaaaatcacaactagagaattgaacatctgtgttccaaaattgtctccaaaattgtcaaaaaaggtcttgcaagctctagaattgccaatgcatttgagaatggaaacattggaagctagaagatatattgaagattacggtaatgaggaagatcataatccattattactggaattggctaaattggattacaatcatgttcaatctctgtttagaagagaattagttgaaatggctagatggtggaatcatttgggtattgctagaaaattttcctttgttagagacagacatgttgaatgttttttgtggactgttggtgttttgccagaaccaaaatattctgctactagaattgttatggctaaaattacttccatcttgttattgttggacgatatttatgacacttacggttcttatgatgatttggttttattgacaaagatcatccaaagatgggatatgacagaaattgaacaattgccagaatatatgcaagcatgttatatggctttgtataatactacatccgaaatttgtgacaaggttttaagagaaagaggtttgtatgttgaacaatttttgagaaagacctggattaaaatcgttgaaggttatatggttgaggttaaatggttaaaaaccggtactattccaaattttaaggaatatatggacaacgctgttactacttctggttcttatatggcttttgttcatatgtttttcctgatttgtgacgaagttaataaggaaaatatggctgatttgttggaaccatatccaaaatttttcactttggctggtacaattttgagattgtgggatgatttaggtactgttaaagaagaacaagaaagaggtgaagttttgtcttctattcaattattgatgaaggagaagaagatcacttgtgataaagatgaaagaaagcaaatcttggaattgattcatgaattgtggaaagatttgaacgctgaattagttgctccaaatgctgttttgtggccaatgattagagttgctttaaatatgtctaggacatctcaagttgtttatcaacataatgaggattcttacttgtcttctgttaaagatcatgttaagaacttgttcttcaaggctattgatatgtaa(SEQ IDNO.8)
ACH-TPS08(落新妇来源)
atggcaccccctccttcctcctatcctccaagtgctcgaaacaattttacacaagttggcacaggacttggtgatacgatgaacgagccttctactcagaaatggagcattaccagccatgatggcaccttagtttcaagccctataatacttcacaactctaaagcaaacaatgcttgttatactgatgaatttcatgtcgatcatgaaagaaaattgaatgaagttagggatttgcttaacaaagttggagaagattatcaattagaaggtttggtcatgatcgacgccattcaatgcctaaacattgactatcacttccgaaaggagattgagtccatcctacaatgtcaggatgagacatctagggttcatgaaaatgatgaacacgatctttaccagactgcacttcgttttcgactgctgagacaagaaggccattttgtgtctgcagaagtgtttgacaaattcaagaacaaagaggggaagtttaagcaagaactagttgaagatataaggggaatgatgggcttatatgaagctgcgcagcttagaattgaaggagaacatatacttgatgaagccgaaagcttttgtcgtcggctctttaaagcatgcatgccctatcttaactctcatgaagcaagacttgtcgagagcatgataaagcatccctatcgaaagagcttgtcacgcataggggccaaaaacttcgctaacaatttccaaggcaatttcaaatggattactgttcttgaagaactatcaaatttagatttgaaaatagttcaatctatacaccagaaggaactacaacaaatttcccattggtgggaagaactgggtttagcaaaggaattgaagctcgcaagagaccaaccgctaaaatggcacatgtggtccatggaagtgttaacagatccaagcttgtctgagcaaaggattgagcttacaaagcccatttctcttgtatacataattgatgacattttcgacgtttatgggacgcttgatgaactcactctcttcacggaagcagtcacaagatgggaattcaccgacgtaaatcaactgcctaactacatgaggacatgtttccagactctctttgatatcacttatgaaattggctataagtttttcatagttcatggttggaaccctataaacacactacgaaaatcgtgggttactttgtgcaaagcatttttggcggaagcaaaatggtttgcttctggggaattgccaaaggcagataaatacttgaaaaatgggattattagttcaggagtgcatgtagtacttgttcacatgttttttctcttgggtcaagatttaacaaaggaatgtttagacctagtgaacgacaacaacaatattccaggcatcataaactatacggcaacgattcttcgtctttgggatgacttgggaagtgcaaaggatgagaatcaagacgggtacgacggatcatatctggaatgtttcatgaatgaacacaaaggtttattaatgaagactgcaagagagcatatgattggcatgatttcggatgcatggaagtgcttgaacaaggaatgcctctctccaaatccattttcatcatctttcacaaaggcttctcttaatgctgcaaggatggttcctttgatgtacaattacgacgacaaccattgtctcccagatcttgaggaacatgcaatgtttgttttaaatatgataaacgttacatag(SEQ IDNO.9)
ACH-TPS09(落新妇来源)
atggcaccccctccttcctcctatcctccaagtgctcgaaacaattttacacaagttggcacaggacttggtgatacgatgaacgagccttctactcagaaatggagcattaccagccatgatggcaccttagtttcaagccctataatacttcacaactctaaagcaaacaatgcttgttatactgatgaatttcatgtcgatcatgaaagaaaattgaatgaagttagggatttgcttaacaaagttggagaagattatcaattagaaggtttggtcatgatcgacgccattcaatgcctaaacattgactatcacttccgaaaggagattgagtccatcctacaatgtcaggatgagacatctagggttcatgaaaatgatgaacacgatctttaccagactgcacttcgttttcgactgctgagacaagaaggccattttgtgtctgcagaagtgtttgacaaattcaagaacaaagaggggaagttcaagcaagaactagttgaagatataaggggaatgatgggcttatatgaagctgcgcagcttagaattgaaggagaacatatacttgatgaagccgaaagcttttgtcgtcggctctttaaagcatgcatgccctatcttaactctcatgaagcaagacttgtcgagagcatgataaagcatccctatcgaaagagcttgtcccgcataggggccaaaaacttcactaacaatttccaaggcaatttcaaatggattactgttcttgaagaactatcaaatttagatttgaaaatagttcaatctatacaccagaaggaactacaacaaatttcccattggtgggaagaactgggtttagcaaaggaattgaagctcgcaagagaccaaccgctaaaatggcacatgtggtccatggaagtgttaacagatccaagcttgtctgagcaaaggattgagcttacaaagcccatttctcttgtatacataattgatgacattttcgacgtttatgggacgcttgatgaactcactctcttcacggaagcagtcacaagatgggaattcaccgacgtaaatcaactgcctaactacatgaggacatgtttccagactctctttgatatcacttatgaaattggctacaagtttttcatagttcatggttggaaccctatagacacactacgaaaatcgtgggttactttgtgcaaagcatttttggcggaagcaaaatggtttgcttctggggaattgccaaaggcagataaatacttgaaaaatgggattattagttcaggagtgcatgtagtacttgttcacatgttttttctcttgggtcaagatttatcaaaggaatgtttagacctagtgaacgacaacaacaatattccaggcatcataaactatacggcaacgattcttcgtctttgggatgacttgggaagtgcaaaggatgagaatcaagacgggtacgacggatcatatctggaatgtttcatgaatgaacacaaaggtttattaatgaagactgcaagagagcatatgattggcatgatttcggatgcatggaagtgcttgaacaaggaatgcctctctccaaatccattttcatcatctttcacaaaggcttctcttaatgctgcaaggatggttcctttgatgtacaattacgacgacaaccattgtctcccagatcttgaggaacatgcaatgtttgttttaaatatgataaacgttacatag(SEQ IDNO.10)。
本申请第三方面提供了一种核酸构建体，其包含本申请第二方面所提供的多核苷酸分子的至少一种。本申请中，将连接入所述核酸构建体的多核苷酸分子称为目的基因，将所述多核苷酸分子编码的酶称为目标蛋白。
在一些实施方式中，所述核酸构建体中还包含调控编码目的基因表达的调控元件，例如启动子、终止子等，示例性的，所述启动子可以为组成型启动子如PTEF1、PTDH3、PGPM1、PTPI1等，诱导型启动子如PHXT1(高浓度葡萄糖诱导)、PCUP1(铜离子诱导)、PGAL1、PGAL2、PGAL7、PGAL10(半乳糖诱导)等，本领域技术人员可根据需要选择，本申请在此不做限定。
在一些实施方式中，所述核酸构建体中还包含用于筛选包含目的基因或目标蛋白的重组菌的标记基因，例如亮氨酸筛选标记、组氨酸筛选标记、色氨酸筛选标记、尿嘧啶筛选标记等，本领域技术人员可根据需要具体选择，本申请在此不做限定。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列位于两个插入元件之间，所述插入元件用于将所述核苷酸序列整合入宿主细胞的基因组中。
在一些实施方式中，两端连接有插入元件的核苷酸序列连接于核酸构建体，例如质粒载体的质粒骨架中，所述核酸构建体用于向宿主细胞导入目的基因时，可以通过限制性内切酶等工具，将所述核酸构建体酶切，从而获得两端连接有插入元件的线性化的目的基因片段，通过将所述线性化的目的基因片段导入宿主细胞中，使其通过两端的插入元件插入宿主细胞基因组的相应位置，从而获得本申请的重组菌。
本领域技术人员可采用常规的方法将线性化的目的基因片段导入宿主细胞中，例如对于酵母菌，可采用醋酸锂法，对于大肠杆菌，可采用钙转法等，此为本领域的常规操作，本申请在此不做限定。
在一些实施方式中，所述两个插入元件成对出现，例如可以是leu2的左右同源臂、Ura3的左右同源臂、YPRCdelta15左右同源臂等，不同基因的同源臂可以将目的基因整合入宿主细胞基因组的不同位置，本领域技术人员可根据希望整合入宿主细胞基因组的位置具体选择同源臂的种类，本申请在此不做限定。
在一些实施方式中，所述两个插入元件之间还包括用于调控目的基因表达的启动子、终止子等调控元件。本申请对所述启动子和终止子的种类不做限定。
在一些实施方式中，所述核酸构建体还包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶(ERG10)、羟甲基戊二酰辅酶A合酶(ERG13)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG1)、甲羟戊酸激酶(ERG12)、甲羟戊酸-5-磷酸激酶(ERG8)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD1)、异戊二烯焦磷酸异构酶(IDI1)、法尼烯焦磷酸合酶(ERG20)的核苷酸序列的至少一种；其中括号中显示了编码这些酶的基因名称。
在一些实施方式中，所述羟甲基戊二酰辅酶A还原酶为截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(tHMG1)，tHMG1截去了内质网定位序列，增强了酶在细胞质中的稳定性。
编码以上酶的基因的示例性而非限制性的公开如下：
ERG10(Accession/GENE ID:856079)、ERG13(Accession/GENE ID:854913)、tHMG1(Accession/GENE ID:854900，截去4-1659bp)、ERG12(Accession/GENE ID:NM_001182715.1)、ERG8(Accession/GENE ID:CP046093.1，689693..691048)、MVD1(Accession/GENE ID:NM_001183220.1)、IDI1(Accession/GENE ID:NM_001183931.1)、ERG20(Accession/GENE ID:853272)。
发明人发现，乙酰乙酰辅酶A硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶属于甲羟戊酸途径中的酶，甲羟戊酸途径可以合成异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，二者可以作为前体，在法尼烯焦磷酸合酶的催化下合成法尼烯焦磷酸(FPP)，而FPP是生物合成橙花叔醇的底物，因此，当所述核酸构建体中包含甲羟戊酸途径中的酶和法尼烯焦磷酸合酶的至少一种时，有利于FPP的合成，进而有利于橙花叔醇的生物合成。
在一些实施方式中，所述的核酸构建体为质粒载体；优选地，所述质粒载体为真核表达载体。
在一些实施方式中，所述的核酸构建体包括pRS426质粒骨架。发明人发现，pRS426质粒骨架中包含适用于大肠杆菌的AmpR筛选标记，适用于酿酒酵母的URA3筛选标记，以及适用于大肠杆菌的复制子和酿酒酵母的多拷贝复制子，采用所述pRS426质粒骨架有利于含有目的基因的质粒在导入酿酒酵母中后维持质粒的高拷贝。
在一些实施方式中，所述pRS426质粒骨架中存在的突变，所述突变消除了pRS426质粒骨架中的酶切位点BsaI，从而可以在使用Goldengate方法构建载体时，以BsaI作为限制性内切酶。
在一些实施方式中，所述的核酸构建体为质粒载体pYR006、pYR007、pYR010、pYR013、pAra-TPS27、pAra-TPS28、pYR017、pYR018、pYR020、pYR021的至少一种；所述质粒载体的构建示意图如图2或图9所示。
在一些实施方式中，可以将所述质粒载体直接导入宿主细胞中，也可以通过酶切所述质粒载体，获得包含插入元件的目的基因片段，进一步将所述基因片段整合入所述宿主细胞的基因组中。
本申请第四方面提供了一种重组菌，其包含本申请第二方面所提供的多核苷酸分子，或本申请第三方面所提供的核酸构建体。
在一些实施方式中，所述多核苷酸分子整合入所述宿主细胞的基因组中；优选地，所述宿主细胞为真核细胞；更优选为酿酒酵母。
在一些实施方式中，所述重组菌中可以直接包含含有编码所述橙花叔醇合成酶的核苷酸序列的核酸构建体，例如，所述核酸构建体以质粒的形式单独存在于宿主细胞中，表达所述橙花叔醇合成酶。
在另一些实施方式中，所述多核苷酸分子整合入所述宿主细胞的基因组中。所述多核苷酸分子整合入所述宿主细胞的基因组中，有利于所述目的基因的长期稳定表达，从而获得能够稳定遗传的重组菌。
本领域技术人员可采用常规的方法将多核苷酸分子整合入所述宿主细胞的基因组中，本申请在此不做限定，例如可以将目的基因连接于两个插入元件之间，通过插入元件将所述目的基因插入宿主细胞的基因组中，示例性的，所述插入元件可以为leu2的左右同源臂、Ura3的左右同源臂、YPRCdelta15左右同源臂，不同基因的同源臂用于将目的基因插入宿主细胞基因组的不同位置，发明人发现，将目的基因插入不干扰宿主细胞正常生理代谢的位点，均能够获得本申请的重组菌。
在一些实施方式中，所述多核苷酸分子在所述重组菌的基因组中的拷贝数为1-3个。
在一些实施方式中，所述的重组菌能够内源和/或外源表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶、法尼烯焦磷酸合酶的至少一种。
在一些实施方式中，所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶和法尼烯焦磷酸合酶在所述重组菌基因组中的拷贝数各自独立地为2、2、4、2、2、2、2、2个。
发明人发现，酿酒酵母可以内源合成FPP，因此在一些优选地实施方式中，采用酿酒酵母作为宿主细胞，有利于获得高效合成橙花叔醇的重组菌。
在一些实施方式中，所述重组菌还包括FPP水解酶DPP1、FPP水解酶LPP1、柠檬酸合酶、苹果酸合酶或角鲨烯合成酶的编码基因的至少一种的敲除或下调。发明人发现，FPP水解酶DPP1(diacylglycerol pyrophosphate phosphatase 1)和FPP水解酶LPP1(lipidphosphate phosphatase 1)具有水解FPP生成法尼醇的能力，柠檬酸合酶(CIT2)和苹果酸合酶(MLS1)能够消耗乙酰辅酶A；角鲨烯合成酶(ERG9)以FPP为底物合成角鲨烯，这些酶均竞争性消耗橙花叔醇生物合成所需要的底物，因此，敲除或下调这些酶的编码基因，减少重组菌中这些酶的表达，有利于提高重组菌中橙花叔醇的高效合成。
本申请中所述的下调具有其一般含义，在本申请中可以理解为基因的表达受到抑制，导致基因调控的蛋白表达量减少。
本申请中所述的敲除具有其一般含义，是指通过一定的途径使特定的基因失活或缺失，从而使其所编码的蛋白减少表达或不表达。
本申请第五方面提供了采用本申请第一方面的橙花叔醇合成酶、本申请第二方面的多核苷酸分子、本申请第三方面的核酸构建体或本申请第四方面的重组菌生产橙花叔醇的用途。
本申请第六方面提供了一种橙花叔醇的制备方法，其包括采用本申请第四方面的重组菌生物合成橙花叔醇。
在一些实施方式中，所述重组菌能够内源和/或外源表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶、法尼烯焦磷酸合酶的至少一种。
发明人发现，采用能够内源表达甲羟戊酸途径中的酶和法尼烯焦磷酸合酶的至少一种的宿主细胞中导入所述目的基因，有利于进一步提高橙花叔醇的产量。
在一些实施方式中，还可以在所述核酸构建体中连接编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶、法尼烯焦磷酸合酶的核苷酸序列的至少一种，使所述重组菌能够高效合成FPP，从而有利于橙花叔醇产量的进一步提高。
在一些实施方式中，所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶和法尼烯焦磷酸合酶在所述重组菌基因组中的拷贝数各自独立地为2、2、4、2、2、2、2、2个。
在一些实施方式中，还包括FPP水解酶DPP1、FPP水解酶LPP1、柠檬酸合酶、苹果酸合酶或角鲨烯合成酶的编码基因的至少一种的敲除或下调。
在一些实施方式中，当采用的核酸构建体中包含诱导型启动子时，还可以包括重组菌转录抑制因子的敲除，例如采用GAL(半乳糖诱导)启动子时，可以对转录抑制因子GAL80进行敲除，转录抑制因子的敲除可以使所述重组菌在不需要诱导剂的情况下即可自主表达目的基因，降低了发酵成本。
下面通过具体实施例来说明本申请的橙花叔醇合成酶及其应用。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。以下实施例中所涉及的质粒均为本领域技术人员公知质粒。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1除虫菊中橙花叔醇合成酶的功能鉴定
1.1除虫菊来源的潜在橙花叔醇合成基因筛选
对除虫菊不同时期和不同部位的组织进行取样，对样品进行RNA提取，并进行了二代、三代转录组测序；从二代和三代转录组数据中，寻找同时含有萜类合酶PF01397和PF03936两个Pfam结构域的除虫菊转录组蛋白质序列，共获得166条潜在的蛋白质序列；使用CD-Hit对所找到的蛋白质序列进行去冗余聚类，将序列相似的大于90％的序列定义为同一类，如此共获得了33类；在每一类中，按照序列完整度，选择出蛋白质序列长度大于500的作为候选基因，进一步从中选择出表达量最高的基因作为测试基因，共获得了24条待验证基因，基因命名为CCJ-TPS01至CCJ-TPS24。
1.2除虫菊中橙花叔醇合成酶及基因的鉴定
1.2.1酵母表达通用载体的构建
质粒pZY900具体构建过程：以酿酒酵母S288c基因组(提取方法见：李晓伟.工程乙酰辅酶A通路构建酿酒酵母高效合成平台[D].武汉大学,2015.2.3.6酵母基因组DNA提取方法)为模板，用引物900-1F/1R、900-2F/2R、900-6F/6R、900-7F/7R分别扩增获得片段9001(Leu2的左同源臂)、9002(终止子tTDH2)、9006(基因ERG20与终止子tERG20)、9007(Leu2右同源臂)；以酿酒酵母CEN.PK2-1D的基因组(提取方法见：李晓伟.工程乙酰辅酶A通路构建酿酒酵母高效合成平台[D].武汉大学,2015.2.3.6酵母基因组DNA提取方法)为模板，用引物900-3F/3R、900-5F/5R分别扩增获得片段9003(终止子tCYC1)和9005(启动子pGAL1和pGAL10)；用引物900-4F/4R以pCAS(见文献Zhang,Yueping et al.“A gRNA-tRNAarray forCRISPR-Cas9 based rapid multiplexed genome editing in Saccharomycescerevisiae.”Nature communications vol.10,1 1053.5Mar.2019,doi:10.1038/s41467-019-09005-3)为模板扩增获得片段9004(无义基因lacZ，用于目的基因的替换)；以pRS426为模板，用引物900-8F/8R、900-9F/9R、900-10F/10R扩增获得质粒骨架(引入MssI酶切位点，筛选标记(AmpR、URA3等))。通过DNAassemble(又称酵母组装，李晓伟.工程乙酰辅酶A通路构建酿酒酵母高效合成平台[D].武汉大学,2015.)的方法将以上片段在酿酒酵母体内重组构建pZY900，然后在大肠杆菌内扩增，酶切验证以及测序正确后，得到pZY900。质粒pZY900构建示意图见图1，其中，片段9001(HA)、9002(T)、9003(T)、9004、9005、9006、9007(HA)从左至右依次连接，其余部分来自pRS426的质粒骨架。
构建质粒pZY900所用引物的序列见下表1。
表1
1.2.2酵母表达载体的构建
设计引物将待验证基因连接在通用载体上。此处展示了除虫菊中最终验证有橙花叔醇合成酶活性的基因CCJ_TPS23的验证过程。
设计特异基因引物对CCJ_TPS23-F/R，以除虫菊的cDNA(采用TIANGEN公司RNAprepPure Plant Plus Kit试剂盒(货号DP441)提取除虫菊胚珠组织RNA，使用Vazyme的HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒(货号R212)对RNA进行反转录获得cDNA)为模板，利用诺唯赞公司的Phanta高保真酶通过PCR扩增获得CCJ_TPS23基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达载体pZY900中，经过测序确认无误后，获得含有CCJ_TPS23基因的酵母表达载体，命名为pYR013，其质粒构建示意图见图2中的pYR013，其中，以CCJ_TPS23基因替代了pZY900中的lacZ基因。
CCJ_TPS23-F/R引物序列如下表2所示：
表2
引物 序列(5’-3’)
CCJ_TPS23-F acaaaggaaaaggggcctgtttaaaacatggagtttatatattccttgatg(SEQ ID NO.33)
CCJ_TPS23-R tttttgaaaattcaatataaatgatcatcaacaattgtgttacac(SEQ ID NO.34)
1.2.3菌株构建
将质粒pYR013通过醋酸锂法(李晓伟.工程乙酰辅酶A通路构建酿酒酵母高效合成平台[D].武汉大学,2015.2.3.14酿酒酵母LiAc转化)导入菌株JCR27中(酵母菌株JCR27的构建见文献Siemon,Thomas et al.“Semisynthesis of Plant-Derived Englerin AEnabled by Microbe Engineering of Guaia-6,10(14)-diene as Building Block.”Journal of the American Chemical Society vol.142,6(2020):2760-2765.doi:10.1021/jacs.9b12940)，将改造菌株命名为CCJ-1。
以同样的方法，将质粒pZY900导入菌株JCR27中，作为对照菌株，命名为S900。
1.2.4菌株发酵和产物鉴定
将菌株CCJ-1、S900分别接菌至SC-URA液体培养基(李晓伟.工程乙酰辅酶A通路构建酿酒酵母高效合成平台[D].武汉大学,2015，缺尿嘧啶培养基)，30℃，200rpm摇床培养过夜；次日按照初始OD600＝0.1转接至45毫升YPDHG液体培养基(20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，10g/L葡萄糖，10g/L半乳糖)中，加入5毫升肉豆蔻酸异丙酯，30℃，200rpm摇床培养72小时，收集油层，使用正己烷稀释至合适的浓度，使用GC-MS检测产物。
Thermo Fisher Scientific配备AS 3000自动进样，分流/不分流进样器的TRACEGC ULTRA气相色谱，以及配备三重四极杆检测器的TSQ QUANTUM XLS MS。
色谱柱为TR-5MS column(30m×0.25mm×0.25um)。载气为高纯氦气，流速1mL/min。丙酮作为洗针液。进样量1uL，分流比50。进样口温度240℃，离子传输管温度270℃。
检测程序：起始柱温为50℃，保持1min；按15℃/min升温至280℃，保持1min；按20℃/min升温至300℃，保持2min。
CCJ-1、S900发酵产物中橙花叔醇特征离子m/z＝93提取离子流色谱图如图3所示，橙花叔醇的质谱图如图4所示，通过和橙花叔醇标准品进行色谱图保留时间，质谱图碎片比对，可以确定菌株CCJ-1中可以合成橙花叔醇，而菌株S900不能合成。此结果表明了CCJ_TPS23基因所编码的蛋白为橙花叔醇合成酶。
实施例2落新妇中橙花叔醇合成酶的功能鉴定
2.1落新妇来源的潜在橙花叔醇合成基因筛选
按照同样的方式，对落新妇不同时期和不同部位的组织进行取样，对样品进行RNA提取，并进行了二代、三代转录组测序；从二代和三代转录组数据中，寻找同时含有萜类合酶PF01397和PF03936两个Pfam结构域的落新妇转录组蛋白质序列，共获得89条潜在的蛋白质序列；使用CD-Hit对所找到的蛋白质序列进行去冗余聚类，将序列相似的大于90％的序列定义为同一类，如此共获得了25类；在每一类中，按照序列完整度，选择出蛋白质序列长度大于500的作为候选基因，进一步从中选择出表达量最高的基因作为测试基因，共获得了17条待验证基因，基因命名为ACH-TPS01至ACH-TPS17。
2.2落新妇中橙花叔醇合成酶及基因的鉴定
2.2.1酵母表达载体的构建
设计引物将待验证基因构建在通用载体上。此处展示了落新妇中最终验证有橙花叔醇合成酶活性的基因ACH_TPS07、ACH_TPS08、ACH_TPS09的验证过程。
设计特异基因引物对ACH_TPS07-F/R，ACH_TPS08-F/R，ACH_TPS09-F/R，以落新妇的cDNA(采用TIANGEN公司RNAprep Pure Plant Plus Kit试剂盒(货号DP441)提取落新妇叶片，使用Vazyme的HiScript II 1st Strand cDNASynthesis Kit(+gDNAwiper)试剂盒(货号R212)对RNA进行反转录获得cDNA)为模板，利用诺唯赞公司的Phanta高保真酶通过PCR扩增获得ACH_TPS07、ACH_TPS08、ACH_TPS09基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法分别将获得的基因片段连接到BsaI切后的酵母表达载体pZY900中，经过测序确认无误后，获得分别含有ACH_TPS07、ACH_TPS08、ACH_TPS09基因的酵母表达载体，命名为pYR007、pYR006、pYR010。质粒pYR007、pYR006、pYR010构建示意图见图2中的pYR007、pYR006、pYR010，其分别以基因ACH_TPS07、ACH_TPS08、ACH_TPS09替代pZY900中的lacZ基因。
引物序列如下表3所示。
表3
2.2.2菌株构建
采用与实施例1的1.2.3相同的方法，将质粒pYR007导入菌株JCR27中，将改造菌株命名为LXF-1；将质粒pYR006导入菌株JCR27中，将改造菌株命名为LXF-1-1；将质粒pYR010导入菌株JCR27中，将改造菌株命名为LXF-1-2。将质粒pZY900导入菌株JCR27中，作为对照菌株，命名为S900。
2.2.3菌株发酵和产物鉴定
将菌株LXF-1、LXF-1-1、LXF-1-2、S900分别接菌至SC-URA液体培养基，30℃，200rpm摇床培养过夜；次日按照初始OD600＝0.1转接至45毫升YPDHG液体培养基中，加入5毫升肉豆蔻酸异丙酯，30℃，200rpm摇床培养72小时，收集油层，使用GC-MS检测产物，检测条件与实施例1的1.2.4相同。
LXF-1、LXF-1-1、LXF-1-2、S900发酵产物中橙花叔醇的特征离子m/z＝93提取离子流色谱图如图5所示，橙花叔醇的质谱图如图6所示，通过和橙花叔醇标准品进行色谱图保留时间，质谱图碎片比对，可以确定菌株LXF-1、LXF-1-1、LXF-1-2中可以合成橙花叔醇，而菌株S900不能合成。此结果表明了ACH_TPS07、ACH_TPS08、ACH_TPS09基因所编码的蛋白为橙花叔醇合成酶。
实施例3艾蒿中橙花叔醇合成酶的功能鉴定
3.1艾蒿来源的潜在橙花叔醇合成基因筛选
从艾蒿的转录组数据(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA722539)中，寻找同时含有萜类合酶PF01397和PF03936两个Pfam结构域的艾蒿转录组蛋白质序列，共获得167条潜在的蛋白质序列；使用CD-Hit对所找到的蛋白质序列进行去冗余聚类，将序列相似的大于90％的序列定义为同一类，如此共获得了47类；在每一类中，按照序列完整度，选择出蛋白质序列长度大于500的作为候选基因，进一步从中选择出表达量最高的基因作为测试基因，共获得了29条待验证基因，基因命名为Arar-TPS01至Arar-TPS29。
3.2艾蒿中橙花叔醇合成酶及基因的鉴定
3.2.1酵母表达载体的构建
设计引物将待验证基因构建在通用载体上。此处展示了艾蒿中最终验证有橙花叔醇合成酶活性的基因Arar-TPS27、Arar-TPS28的验证过程。艾蒿来源的基因Arar-TPS27、Arar-TPS28直接按照酿酒酵母密码子优化合成，序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
设计特异基因引物对Arar-TPS27-F/R，Arar-TPS28-F/R以合成的基因为模板，利用诺唯赞公司的Phanta高保真酶通过PCR扩增获得Arar-TPS27、Arar-TPS28基因片段，利用天根胶回收试剂盒进行胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法分别连接到BsaI切后的酵母表达载体pZY900中，经过测序确认无误后，获得分别含有Arar-TPS27、Arar-TPS28的酵母表达载体，命名为pArar-TPS27、pArar-TPS28。质粒pArar-TPS27、pArar-TPS28构建示意图见图2中的pArar-TPS27、pArar-TPS28，其分别以基因pArar-TPS27、pArar-TPS28替代pZY900中的lacZ基因。
引物序列如下表4所示。
表4
3.2.2菌株构建
采用与实施例1的1.2.3相同的方法，将质粒pArar-TPS27导入菌株JCR27中，将改造菌株命名为AH-1；将质粒pArar-TPS28导入菌株JCR27中，将改造菌株命名为AH-2；将质粒pZY900导入菌株JCR27中，作为对照菌株，命名为S900。
3.2.3菌株发酵和产物鉴定
将菌株AH-1、AH-2、S900分别接菌至SC-URA液体培养基，30℃，200rpm摇床培养过夜；次日按照初始OD600＝0.1转接至45毫升YPDHG液体培养基中，加入5毫升肉豆蔻酸异丙酯，30℃，200rpm摇床培养72小时，收集油层，使用GC-MS检测产物，检测条件与实施例1的1.2.4相同。
AH-1、AH-2、S900发酵产物中橙花叔醇的特征离子m/z＝93提取离子流色谱图如图7所示，橙花叔醇的质谱图如图8所示，通过和橙花叔醇标准品进行色谱图保留时间，质谱图碎片比对，可以确定菌株AH-1、AH-2均可以合成橙花叔醇，而菌株S900不能合成。此结果表明了Arar-TPS27、Arar-TPS28基因所编码的蛋白为橙花叔醇合成酶。
实施例4含有除虫菊来源的橙花叔醇合成酶CCJ_TPS23的高产菌株的构建
4.1高产质粒构建
使用引物020-1F/R、020-2F/R、020-3F/R、020-4F/R、020-5F/R、020-6F/R、020-7F/R、020-8F/R、020-9F/R，分别以酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、pRS423质粒、酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、酿酒酵母S288C全基因组、酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、除虫菊cDNA、CEN.PK2-1D的全基因组、CEN.PK2-1D的全基因组、pRS426质粒为模板扩增获得片段Ura3左同源臂(HA)、组氨酸筛选标记(HIS3)、CYC1终止子(T)、tHMG1基因、GAL1-GAL10启动子(PGAL10和PGAL1)、CCJ_TPS23、PGK1终止子(T)、Ura3右同源臂(HA)、质粒骨架。随后采用与实施例1相同酵母组装的方法，在酿酒酵母体内重组构建，将以上片段顺序连接，获得质粒pYR020。质粒pYR020构建示意图见图9中的pYR020，其中还包含MssI酶切位点，其余部分来自pRS426质粒骨架。
引物序列见下表5。
表5
引物 序列(5’-3’)
020-1F attaaccctcactaaagggaacaaaagcgtttaaacacgcagataattccaggtatttt(SEQ ID NO.45)
020-1R aatacgactcactatagggcgaattgggtaccttcgtttcctgcaggtttttgt(SEQ ID NO.46)
020-2F caaaaacctgcaggaaacgaaggtacccaattcgccctatagtgag(SEQ ID NO.47)
020-2R gttttgggacgctcgaaggctttaatttgctcacagcttgtctgtaagcg(SEQ ID NO.48)
020-3F ttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgagcaaattaaagccttcgagcg(SEQ ID NO.49)
020-3R gtttgaaagatgggtccgtcacctgcattaaatcctaaacaggccccttttcctttgtc(SEQ ID NO.50)
020-4F taattacatgatatcgacaaaggaaaaggggcctgtttaggatttaatgcaggtgacgg(SEQ ID NO.51)
020-4R gaatttttgaaaattcaatataaatggttttaaccaataaaacagtcat(SEQ ID NO.52)
020-5F gttttattggttaaaaccatttatattgaattttcaaaaattcttactttttttttgg(SEQ ID NO.53)
020-5R taacacaattgttgatgatcattatagttttttctccttgacgttaaagt(SEQ ID NO.54)
020-6F gtcaaggagaaaaaactataatgatcatcaacaattgtgttacac(SEQ ID NO.55)
020-6R cgatttcaattcaattcaatttaaaacatggagtttatatattccttgatg(SEQ ID NO.56)
020-7F tatataaactccatgttttaaattgaattgaattgaaatcgatagatcaat(SEQ ID NO.57)
020-7R ttgaagctctaatttgtgagtttagtatacatgcatttacaacgaacgcagaattttcg(SEQ ID NO.58)
020-8F gtttaataactcgaaaattctgcgttcgttgtaaatgcatgtatactaaactcacaaat(SEQ ID NO.59)
020-8R gacggtcacagcttgtctgtgtttaaaccgtttaagggcaaatgtactct(SEQ ID NO.60)
020-9F agagtacatttgcccttaaacggtttaaacacagacaagctgtgaccgtc(SEQ ID NO.61)
020-9R tgcttcaaaatacctggaattatctgcgtgtttaaacgcttttgttccctttagtgagg(SEQ ID NO.62)
使用引物021-1F/R、021-2F/R、021-3F/R、021-4F/R、021-5F/R、021-6F/R、021-7F/R、021-8F/R，分别以酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、pRS424质粒、酿酒酵母S288C全基因组、酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、除虫菊cDNA、酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、pRS426质粒为模板扩增获得片段YPRCdelta15左同源臂(HA)、色氨酸筛选标记(TRP1)、GPM1终止子(T)、GAL1-GAL10启动子(PGAL10和PGAL1)、CCJ_TPS23、PGK1终止子(T)、YPRCdelta15右同源臂(HA)、质粒骨架。随后使用与前述相同的酵母组装的方法，将以上片段在酿酒酵母体内重组构建，将以上片段顺序连接，获得质粒pYR021。质粒pYR021构建示意图见图9中的pYR021，其中还包含Not I酶切位点，其余部分来自pRS426质粒骨架。
引物序列见下表6。
表6
引物 序列(5’-3’)
021-1F ctaaagggaacaaaagcgcggccgcggcaatttggtacaaaaatcacg(SEQ ID NO.63)
021-1R ctatattatatatatagtaatgtcgtttttgcgaaaccctatgctc(SEQ ID NO.64)
021-2F gagcatagggtttcgcaaaaacgacattactatatatataatatag(SEQ ID NO.65)
021-2R gctgaatgggcagttcgaatacctgatgcggtattttctcc(SEQ ID NO.66)
021-3F ggagaaaataccgcatcaggtattcgaactgcccattcagc(SEQ ID NO.67)
021-3R gtaagaatttttgaaaattcaatataagtctgaagaatgaatgatttgatgat(SEQ ID NO.68)
021-4F aatcattcattcttcagacttatattgaattttcaaaaattcttactttttttttg(SEQ ID NO.69)
021-4R aacacaattgttgatgatcattatagttttttctccttgacg(SEQ ID NO.70)
021-5F gtcaaggagaaaaaactataatgatcatcaacaattgtgttacac(SEQ ID NO.71)
021-5R cgatttcaattcaattcaatttaaaacatggagtttatatattccttgatg(SEQ ID NO.72)
021-6F tatataaactccatgttttaaattgaattgaattgaaatcg(SEQ ID NO.73)
021-6R gctcatcccgaccttccattaacgaacgcagaattttcgag(SEQ ID NO.74)
021-7F ctcgaaaattctgcgttcgttaatggaaggtcgggatgagc(SEQ ID NO.75)
021-7R agacggtcacagcttgtctgtgcggccgcgcttctaataaaccgatgaacgc(SEQ ID NO.76)
021-8F gcgttcatcggtttattagaagcgcggccgcacagacaagctgtgaccgtct(SEQ ID NO.77)
021-8R ttttgtaccaaattgccgcggccgcgcttttgttccctttagtgagg(SEQ ID NO.78)
4.2基因编辑质粒以及敲除盒构建
使用引物3951-F/R以质粒pKlURA100(见文献Zhang,Yueping et al.“AgRNA-tRNAarray for CRISPR-Cas9 based rapid multiplexed genome editing in Saccharomycescerevisiae.”Nature communications vol.10,1 1053.5Mar.2019,doi:10.1038/s41467-019-09005-3)为模板扩增获得片段。随后使用Goldengate(Zhang,Yueping et al.“AgRNA-tRNAarray for CRISPR-Cas9 based rapid multiplexed genome editing inSaccharomyces cerevisiae.”Nature communications vol.10,1 1053.5Mar.2019,doi:10.1038/s41467-019-09005-3)的方法，将以上片段和pCas进行组装，构建获得质粒pYH395，质粒构建示意图如图10A所示。
引物序列见下表7。
表7
引物 序列(5’-3’)
3951-F aaaggtctcagatcttttccactgcactttgcatgttttagagctagaaatagcaagtt(SEQ ID NO.79)
3951-R aaaggtctcaaaactctagactttttcgatgatgtagtttct(SEQ ID NO.80)
使用引物ERG9-1F/R、ERG9-2F/R以酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组为模板扩增获得两个片段，随后使用引物ERG9-1F、ERG9-2R，以获得的两个片段为模板，进行重叠延伸PCR，获得ERG9敲除盒。ERG9启动子上游激活顺式元件(-220至-175)敲除元件构建示意图见图10B，其中，两个HA为分别代表序列(-220至-175)左侧的同源臂和序列(-220至-175)右侧的同源臂。
引物序列见下表8。
表8
/>
使用引物5211-F/R、5212-F/R、5213-F/R，分别以酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、pRS426质粒、酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组为模板扩增获得三个片段，随后使用引物5211-F、5213-R以获得的三个片段为模板，进行重叠延伸PCR，获得pZY521敲除盒。pZY521敲除盒构建示意图见图11，其中序列依次为GAL80左同源臂(HA)、URA3选择标记(启动子PURA3、URA3基因、终止子T)、GAL80右同源臂(HA)。
引物序列见下表9。
表9
引物 序列(5’-3’)
5211_F caatggtctaggtagtggcattcg(SEQ ID NO.85)
5211-R cgactcactatagggcgaattgggtacgacgggagtggaaagaacgg(SEQ ID NO.86)
5212-F tcccgttctttccactcccgtcgtacccaattcgccctatagtgag(SEQ ID NO.87)
5212-R gccaagcacagggcaagatgctttcacagcttgtctgtaagcgga(SEQ ID NO.88)
5213-F gcatccgcttacagacaagctgtgaaagcatcttgccctgtgctt(SEQ ID NO.89)
5213-R gattccatgctaccttccatggttg(SEQ ID NO.90)
4.3菌株构建
1)将质粒pYR013使用MssI酶切(酶切体条件参见MssI酶说明书)，获得线性化片段，将所述线性化片段通过醋酸锂法整合至菌株JCR27中，获得菌株CCJ-2。
2)将质粒pYR020使用MssI酶线性化后，采用与步骤1)相同的方法整合至菌株CCJ-2中，获得菌株CCJ-3。
3)将质粒pYR021使用NotI酶线性化后，采用与步骤1)相同的方法整合至菌株CCJ-3中，获得菌株CCJ-4。
4)将质粒pYH395和ERG9敲除盒通过醋酸锂法共同转入至菌株CCJ-4中，菌落经PCR验证敲除的正确性，随后使用YPD液体培养基(20g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、20g/L葡萄糖)培养，220rpm摇床，30度培养8小时后水洗，将菌划5-FOA平板(李晓伟.工程乙酰辅酶A通路构建酿酒酵母高效合成平台[D].武汉大学,2015.)，30℃培养箱培养3天，从平板上挑菌继续菌落PCR验证敲除的正确性，正确的菌株命名为CCJ-5。
本步骤用于敲除ERG9启动子上游激活顺式元件(-220至-175)，ERG9编码的角鲨烯合成酶以FPP为底物合成角鲨烯，为橙花叔醇合成途径的竞争途径，ERG9启动子上游激活顺式元件的敲除可下调角鲨烯合成途径，减少角鲨烯合成途径竞争消耗橙花叔醇合成所需的底物，有利于进一步提高橙花叔醇的产量。
5)将pZY521敲除盒使用醋酸锂法转入菌株CCJ-5中，获得菌株CCJ-6。本步骤的作用是敲除转录抑制因子GAL80，从而可以使转入菌中的目的基因可以在不需要诱导剂的情况下即可自主表达，有利于降低发酵成品，还可进一步提高橙花叔醇的产量。
4.4菌株摇瓶发酵
将菌株CCJ-2、CCJ-3、CCJ-4、CCJ-5、CCJ-6分别接菌至YPD液体培养基中，30℃，200rpm摇床培养过夜；次日按照初始OD600＝0.1转接至45毫升YPDHG液体培养基(CCJ-2、CCJ-3、CCJ-4、CCJ-5)或YPD液体培养基(CCJ-6)中，加入5毫升肉豆蔻酸异丙酯，30℃，200rpm摇床培养72小时，收集油层，使用GC-MS检测产物，检测条件与实施例1的1.2.4相同。不同菌株橙花叔醇产量数据如图12所示。从结果中可以看出，随着目的基因CCJ_TPS23拷贝数的增多，橙花叔醇的产量逐渐升高，CCJ-2为271mg/L，CCJ-3为557mg/L，CCJ-3为627mg/L；下调角鲨烯合成途径后(CCJ-5)，橙花叔醇产量进一步明显提高，产量达到1140mg/L；更进一步敲除半乳糖诱导的主要转录抑制因子GAL80(CCJ-6)，橙花叔醇产量进一步明显提高，产量可达到1942mg/L。
实施例5含有落新妇来源的橙花叔醇合成酶ACH_TPS07的高产菌株的构建
5.1高产质粒构建
使用引物020-1F/R、020-2F/R、020-3F/R、020-4F/R、020-5F/017-5R、017-6F/R、017-7F/020-7R、020-8F/R、020-9F/R，分别以酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、pRS423质粒、酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、酿酒酵母S288C的全基因组、酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、落新妇cDNA、酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、pRS426质粒为模板扩增获得片段Ura3左同源臂(HA)、组氨酸筛选标记(HIS3)、CYC1终止子(T)、tHMG1基因、GAL1-GAL10启动子(PGAL10和PGAL1)、ACH_TPS07、PGK1终止子(T)、Ura3右同源臂(HA)、质粒骨架。随后采用与实施例1相同酵母组装的方法，在酿酒酵母体内重组构建，将以上片段顺序连接，获得质粒pYR017。质粒pYR017构建示意图见图9中的pYR017，其中还包含MssI酶切位点，其余部分来自pRS426质粒骨架。
引物序列见下表10。
表10
引物 序列(5’-3’)
017-5R aggaggaaggagggggtgccattatagttttttctccttgacgttaaagt(SEQ ID NO.91)
017-6F gtcaaggagaaaaaactataatggcaccccctccttcc(SEQ ID NO.92)
017-6R cgatttcaattcaattcaatttaaaacaaacattgtatatgctcctcaag(SEQ ID NO.93)
017-7F catatacaatgtttgttttaaattgaattgaattgaaatcgatagatcaat(SEQ ID NO.94)
使用引物021-1F/R、021-2F/R、021-3F/R、021-4F/018-4R、018-5F/R、018-6F/021-6R、021-7F/R、021-8F/R，分别以酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、pRS424质粒、酿酒酵母S288C全基因组、酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、落新妇cDNA、酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、酿酒酵母CEN.PK2-1D的全基因组、pRS426质粒为模板扩增获得片段YPRCdelta15左同源臂(HA)、色氨酸筛选标记(TRP1)、GPM1终止子(T)、GAL1-GAL10启动子(PGAL10和PGAL1)、ACH_TPS07、PGK1终止子(T)、YPRCdelta15右同源臂(HA)、质粒骨架。随后使用与前述相同的酵母组装的方法，将以上片段在酿酒酵母体内重组构建，将以上片段顺序连接，获得质粒pYR018。质粒pYR018构建示意图见图9中的pYR018，其中还包含Not I酶切位点，其余部分来自pRS426质粒骨架。
引物序列见下表11。
表11
引物 序列(5’-3’)
018-4R ggaggaaggagggggtgccattatagttttttctccttgacg(SEQ ID NO.95)
018-5F gtcaaggagaaaaaactataatggcaccccctccttcc(SEQ ID NO.96)
018-5R cgatttcaattcaattcaatttaaaacaaacattgtatatgctcctc(SEQ ID NO.97)
018-6F catatacaatgtttgttttaaattgaattgaattgaaatcg(SEQ ID NO.98)
5.2菌株构建
采用与实施例4相同的方法，将质粒pYR007使用MssI线性化后整合至菌株JCR27中，获得菌株LXF-2；将质粒pYR017使用MssI线性化后整合至菌株LXF-2中，获得菌株LXF-3；将质粒pYR018使用NotI线性化后整合至菌株LXF-3中，获得菌株LXF-4；将质粒pYH395和ERG9敲除盒共同转入至菌株LXF-4中，菌落经PCR验证敲除的正确性，随后使用YPD培养后水洗，将菌划5-FOA平板，从平板上挑菌继续菌落PCR验证敲除的正确性，正确的菌株命名为LXF-5；将pZY521敲除盒转入菌株LXF-5中，获得菌株LXF-6。
5.3菌株摇瓶发酵
将菌株LXF-2、LXF-3、LXF-4、LXF-5、LXF-6分别接菌至YPD液体培养基，30℃，200rpm摇床培养过夜；次日按照初始OD600＝0.1转接至45毫升YPDHG液体培养基(LXF-2、LXF-3、LXF-4、LXF-5)或YPD液体培养基(LXF-6)中，加入5毫升肉豆蔻酸异丙酯，30℃，200rpm摇床培养72小时，收集油层，使用GC-MS检测产物，检测条件与实施例1的1.2.4相同。产量数据如图13所示。不同菌株橙花叔醇产量数据如图13所示。从结果中可以看出，随着目的基因ACH_TPS07拷贝数的增多，橙花叔醇的产量逐渐升高，LXF-2约269mg/L，LXF-3约436mg/L，LXF-4约556mg/L；下调角鲨烯合成途径后(LXF-5)，橙花叔醇产量进一步明显提高，产量达到1112mg/L；更进一步敲除转录抑制因子GAL80后(LXF-6)，橙花叔醇产量进一步明显提高，产量可达到2105mg/L。
实施例6橙花叔醇高产菌株的发酵罐发酵
参照文献(Ye Z,Huang Y,Shi B,et al.Coupling cell growth andbiochemical pathway induction in Saccharomyces cerevisiae for production of(+)-valencene and its chemical conversion to(+)-nootkatone[published onlineahead of print,2022Mar 13].Metab Eng.2022；72:107-115.doi:10.1016/j.ymben.2022.03.005)中所记载的发酵罐培养基和发酵方法，对所构建的菌株LXF-6进行分批补料发酵，在发酵过程中添加覆盖剂以实现原位萃取，覆盖剂为肉豆蔻酸异丙酯。发酵过程控制溶氧在20％以上，pH为5，葡萄糖浓度为1-2g/L，乙醇浓度为5g/L以下。最终在1L发酵罐上，橙花叔醇产量达到了55.7g/L，是目前报道的最高产量水平。

Claims (19)

1.一种橙花叔醇合成酶，其具有与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列具有至少97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且具有橙花叔醇合成酶活性。
2.根据权利要求1所述的橙花叔醇合成酶，其来自艾蒿。
3.一种多核苷酸分子，其包含编码权利要求1或2所述的橙花叔醇合成酶的核苷酸序列或其互补序列的至少一种。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸分子，其包含与SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列具有至少97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
5.一种核酸构建体，其包含权利要求3或4所述的多核苷酸分子的至少一种。
6.根据权利要求5所述的核酸构建体，其还包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶、法尼烯焦磷酸合酶的核苷酸序列的至少一种。
7.根据权利要求5或6所述的核酸构建体，所述核苷酸序列位于两个插入元件之间，所述插入元件用于将所述核苷酸序列整合入宿主细胞的基因组中。
8.根据权利要求5所述的核酸构建体，其为质粒载体；优选地，所述质粒载体为真核表达载体。
9.根据权利要求8所述的核酸构建体，其包括pRS426质粒骨架。
10.根据权利要求9所述的核酸构建体，其为质粒载体pAra-TPS27、pAra-TPS28的至少一种。
11.一种重组菌，其包含根据权利要求3或4所述的多核苷酸分子，或权利要求5-10中任一项所述的核酸构建体。
12.根据权利要求11所述的重组菌，其中，所述多核苷酸分子整合入宿主细胞的基因组中；所述宿主细胞为真核细胞。
13.根据权利要求12所述的重组菌，其中，所述宿主细胞为酿酒酵母。
14.根据权利要求12所述的重组菌，其中，所述多核苷酸分子在所述重组菌的基因组中的拷贝数为1-3个。
15.根据权利要求11所述的重组菌，其能够内源和/或外源表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶、法尼烯焦磷酸合酶的至少一种。
16.根据权利要求15所述的重组菌，其中，编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶和法尼烯焦磷酸合酶的核苷酸序列在所述重组菌基因组中的拷贝数各自独立地为2、2、4、2、2、2、2、2个。
17.根据权利要求11所述的重组菌，其还包括FPP水解酶DPP1、FPP水解酶LPP1、柠檬酸合酶、苹果酸合酶或角鲨烯合成酶的编码基因的至少一种的下调或敲除。
18.采用权利要求1或2所述的橙花叔醇合成酶、权利要求3或4所述的多核苷酸分子、权利要求5-10中任一项所述的核酸构建体或权利要求11-17中任一项所述的重组菌生产橙花叔醇的用途。
19.一种橙花叔醇的制备方法，其包括采用权利要求11-17中任一项所述的重组菌生物合成橙花叔醇。
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