CN114774442B - 一种产灯盏乙素的重组解脂耶氏酵母及其构建方法和用途 - Google Patents

一种产灯盏乙素的重组解脂耶氏酵母及其构建方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产灯盏乙素的重组解脂耶氏酵母及其构建方法和用途。所述的构建方法包括如下步骤：首先通过在解脂耶氏酵母中异源表达灯盏乙素通路合成的9个关键酶实现了灯盏乙素在解脂耶氏酵母中的从头生产，并进一步通过优化改造使灯盏乙素的产量在摇瓶条件下达到94.79mg/L，经补料分批发酵以后灯盏乙素产量可达346mg/L，所占比例达到80％以上，副产物占比少。本发明的方法为人工细胞高效合成灯盏乙素奠定了基础。

Description

一种产灯盏乙素的重组解脂耶氏酵母及其构建方法和用途
技术领域
本发明属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及异源合成灯盏乙素的重组解脂耶氏酵母菌及用途。
背景技术
灯盏乙素作为灯盏花黄酮苷的生物活性成分之一，不仅可用于治疗心脑血管疾病，还可用于其他几种慢性疾病，如糖尿病并发症、中风、肾病和非酒精性脂肪性肝病等。灯盏乙素主要来源仍然是从植物中提取，极大地耗尽了该物种的野生资源。化学合成因使用昂贵的起始原料和繁琐的合成程序而黯然失色。因此，利用合成生物学技术合成灯盏乙素是解决灯盏花资源短缺的有效手段。
近年来，微生物细胞工厂引起了人们的极大关注，在酿酒酵母中构建的灯盏乙素工程菌，灯盏乙素的产量是108mg/L，然而副产物灯盏甲素的产量是185mg/L，灯盏乙素的比例仅占36.9％(Liu X,Jian C,Zhang G,et al.Nature Communications 2018,9(1):1-10.)，因此构建副产物占比少的工程菌株尤为重要。
与传统宿主酿酒酵母和大肠杆菌不同，解脂耶氏酵母因其自身代谢潜力脱颖而出，富含关键前体乙酰辅酶A、NADPH、ATP，独特的疏水环境，富含膜细胞和亚细胞腔，缺乏Crabtree效应，在高糖或呼吸受限条件下不会产生乙醇等，并且已有研究报道解脂耶氏酵母合成柚皮素等黄酮类化合物，使其成为生产灯盏乙素的代谢工程的极佳宿主。然而，利用合成生物学方法在解脂耶氏酵母中异源合成灯盏乙素还未见报道。
发明内容
为克服现有技术中存在的不足，本发明首要目的是提供一种产灯盏乙素的解脂耶氏酵母工程菌。通过在解脂耶氏酵母中异源表达灯盏乙素通路合成的9个关键酶实现了灯盏乙素在解脂耶氏酵母中的从头生产，并且此工程菌中副产物占比少，灯盏乙素产量较高。本发明的方法为人工细胞高效合成灯盏乙素奠定了基础
本发明的第二个目的是提供一种产灯盏乙素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法。
本发明的第三个目的是提供一种产灯盏乙素的解脂耶氏酵母基因工程菌的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种产灯盏乙素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：向解脂耶氏酵母中导入优化的灯盏花来源的苯丙氨酸解氨酶编码基因PAL、肉桂酸4-羟化酶编码基因C4H、对香豆酰辅酶A连接酶编码基因4CL、查尔酮合酶编码基因CHS、黄酮合酶II连接酶编码基因FSII、黄酮-7-O-葡萄糖醛酸转移酶编码基因F7GAT、UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因UDPGDH，黄芩来源的黄酮-6-羟化酶编码基因CYP82D4、拟南芥来源的细胞色素P450还原酶编码基因ATR2进行表达。
上述工程菌的构建方法中，
所述苯丙氨酸解氨酶编码基因PAL为如下a1)-a3)中任一种DNA分子：
a1)如SEQ ID NO：1所示的cNDA分子或基因组DNA分子；
a2)在严格条件下与a1)限定的DNA分子杂交且编码所述苯丙氨酸解氨酶编码基因PAL的cDNA分子或基因组DNA分子；
a3)与a1)或a2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述苯丙氨酸解氨酶编码基因PAL的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述肉桂酸4-羟化酶编码基因C4H为如下b1)-b3)中任一种DNA分子：
b1)如SEQ ID NO：2所示的cNDA分子或基因组DNA分子；
b2)在严格条件下与b1)限定的DNA分子杂交且编码所述肉桂酸4-羟化酶编码基因C4H的cDNA分子或基因组DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述肉桂酸4-羟化酶编码基因C4H的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述对香豆酰辅酶A连接酶编码基因4CL为如下c1)-c3)中任一种DNA分子：
c1)如SEQ ID NO：3所示的cNDA分子或基因组DNA分子；
c2)在严格条件下与c1)限定的DNA分子杂交且编码所述对香豆酰辅酶A连接酶编码基因4CL的cDNA分子或基因组DNA分子；
c3)与c1)或c2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述对香豆酰辅酶A连接酶编码基因4CL的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述查尔酮合酶编码基因CHS为如下d1)-d3)中任一种DNA分子：
d1)如SEQ ID NO：4所示的cNDA分子或基因组DNA分子；
d2)在严格条件下与d1)限定的DNA分子杂交且编码所述查尔酮合酶编码基因CHS的cDNA分子或基因组DNA分子；
d3)与d1)或d2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述查尔酮合酶编码基因CHS的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述黄酮合酶II连接酶编码基因FSII为如下e1)-e3)中任一种DNA分子：
e1)如SEQ ID NO：5所示的cNDA分子或基因组DNA分子；
e2)在严格条件下与e1)限定的DNA分子杂交且编码所述黄酮合酶II连接酶编码基因FSII的cDNA分子或基因组DNA分子；
e3)与e1)或e2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述黄酮合酶II连接酶编码基因FSII的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述黄酮-7-O-葡萄糖醛酸转移酶编码基因F7GAT为如下f1)-f3)中任一种DNA分子：
f1)如SEQ ID NO：6所示的cNDA分子或基因组DNA分子；
f2)在严格条件下与e1)限定的DNA分子杂交且编码所述黄酮-7-O-葡萄糖醛酸转移酶编码基因F7GAT的cDNA分子或基因组DNA分子；
f3)与f1)或f2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述黄酮-7-O-葡萄糖醛酸转移酶编码基因F7GAT的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因UDPGDH为如下g1)-g3)中任一种DNA分子：
g1)如SEQ ID NO：7所示的cNDA分子或基因组DNA分子；
g2)在严格条件下与g1)限定的DNA分子杂交且编码所述UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因UDPGDH的cDNA分子或基因组DNA分子；
g3)与g1)或g2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因UDPGDH的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述黄酮-6-羟化酶编码基因CYP82D4为如下h1)-h3)中任一种DNA分子：
h1)如SEQ ID NO：8所示的cNDA分子或基因组DNA分子；
h2)在严格条件下与h1)限定的DNA分子杂交且编码所述黄酮-6-羟化酶编码基因CYP82D4的cDNA分子或基因组DNA分子；
h3)与h1)或h2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述黄酮-6-羟化酶编码基因CYP82D4的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述细胞色素P450还原酶编码基因ATR2为如下g1)-g3)中任一种DNA分子：
g1)如SEQ ID NO：9所示的cNDA分子或基因组DNA分子；
g2)在严格条件下与h1)限定的DNA分子杂交且编码所述细胞色素P450还原酶编码基因ATR2的cDNA分子或基因组DNA分子；
g3)与h1)或h2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述细胞色素P450还原酶编码基因ATR2的cDNA分子或基因组DNA分子。
上述工程菌的构建方法中，所述优化的灯盏乙素通路基因表达盒利用CRISPR/Cas9系统通过基因敲入的方法整合到解脂耶氏酵母基因组中。
优选地，上述工程菌的构建方法中，所述解脂耶氏酵母出发菌株为Yarrowialipolytica W29Δku70，其KU70位点整合Cas9蛋白。
进一步优选地，上述工程菌的构建方法中，利用CRISPR/Cas9系统向解脂耶氏酵母KU80位点整合对香豆酰辅酶A连接酶编码基因4CL和查尔酮合酶编码基因CHS表达盒，4CL和CHS分别在启动子pGPD、pTEFIN和终止子tPEX20、tLIP2的控制下，IntC-2位点整合黄酮合酶II连接酶编码基因FSII表达盒，FSII在启动子pTEFIN和终止子tLIP2的控制下，IntC-3位点整合黄酮-6-羟化酶编码基因CYP82D4和细胞色素P450还原酶编码基因ATR2表达盒，CYP82D4和ATR2分别在启动子pTEFIN、pGPD和终止子tLIP2、tPEX20的控制下，IntD-1位点整合黄酮-7-O-葡萄糖醛酸转移酶编码基因F7GAT和UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因UDPGDH表达盒，F7GAT和UDPGDH分别在启动子pTEFIN、pGPD和终止子tLIP2、tPEX20的控制下，IntE-3位点整合苯丙氨酸解氨酶编码基因PAL和肉桂酸4-羟化酶编码基因C4H表达盒，PAL和C4H分别在启动子pTEFIN、pGPD和终止子tLIP2、tPEX20的控制下。
更进一步优选地，上述工程菌的构建方法中，所述优化的苯丙氨酸解氨酶编码基因PAL的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述优化的肉桂酸4-羟化酶编码基因C4H的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述优化的对香豆酰辅酶A连接酶编码基因4CL的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述优化的查尔酮合酶编码基因CHS的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述优化的黄酮合酶II连接酶编码基因FSII的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述优化的黄酮-7-O-葡萄糖醛酸转移酶编码基因F7GAT的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述优化的UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因EbUDPGDH的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述优化的黄酮-6-羟化酶编码基因CYP82D4的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述优化的细胞色素P450还原酶编码基因ATR2的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
第二方面，本发明提供第一方面所述的构建方法构建得到的解脂耶氏酵母基因工程菌。
第三方面，提供一种产灯盏乙素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统向第二方面所述的解脂耶氏酵母基因工程菌的ARO10位点整合查尔酮合酶编码基因CHS和黄酮合酶II连接酶编码基因FSII表达盒，CHS和FSII分别在启动子pGPD、pTEFIN和终止子tPEX20、tLIP2的控制下，所述优化的查尔酮合酶编码基因CHS的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述优化的黄酮合酶II连接酶编码基因FSII的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
第四方面，本发明提供第三方面所述的构建方法构建得到的解脂耶氏酵母基因工程菌。
第五方面，提供一种产灯盏乙素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统向第四方面所述的解脂耶氏酵母基因工程菌的D17位点整合黄酮-6-羟化酶编码基因CYP82D4和细胞色素P450还原酶编码基因ATR2表达盒，CYP82D4和ATR2分别在启动子pGPD、pTEFIN和终止子tPEX20、tLIP2的控制下，所述优化的黄酮-6-羟化酶编码基因CYP82D4的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述优化的细胞色素P450还原酶编码基因ATR2的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
第六方面，本发明提供第五方面所述的构建方法构建得到的解脂耶氏酵母基因工程菌。
第七方面，提供一种产灯盏乙素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统向第六方面所述的解脂耶氏酵母基因工程菌的IntE-1位点整合对香豆酰辅酶A连接酶编码基因4CL和黄酮合酶II连接酶编码基因FSII表达盒，4CL和FSII分别在启动子pGPD、pTEFIN和终止子tPEX20、tLIP2的控制下，所述优化的对香豆酰辅酶A连接酶编码基因4CL的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述优化的黄酮合酶II连接酶编码基因FSII的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
第八方面，本发明提供第七方面所述的构建方法构建得到的解脂耶氏酵母基因工程菌。
第九方面，提供第二、四、六、八方面所述的解脂耶氏酵母基因工程菌在生产灯盏乙素中的应用。
第十方面，提供第二、四、六、八方面所述的解脂耶氏酵母基因工程菌在以葡萄糖为底物生产灯盏乙素中的应用。
第十一方面，提供第二、四、六、八方面所述的解脂耶氏酵母基因工程菌在以葡萄糖为底物生产灯盏乙素中降低副产物的应用。
第十二方面，提供一种生产灯盏乙素的方法，包括如下步骤：以葡萄糖为底物，将按照上述构建方法构建得到的工程菌在发酵培养基中培养发酵，获得灯盏乙素，所述发酵培养基的配方为20g/L葡萄糖、1.7g/L YNB、5g/L硫酸铵，余量为水。
优选地，上述生产灯盏乙素的方法，包括如下步骤：
1)从甘油保种管中取出按照上述构建方法构建得到的工程菌菌液，在YPD固体平板上划线，培养48h，从平板中挑取一个单菌落到4mL矿物培养基中，在230rpm，30℃的条件下培养48小时，再转接到40mL的矿物培养基中，培养1天，获得种子液；
2)将步骤1)的种子液接种到1.3L的发酵罐中进行补料分批发酵，在整个发酵过程中，温度保持在30℃；通过自动添加10％的氨水将pH值维持在5.0，溶解氧(DO)被设定为40％，初始通气量被设定为0.5L/min；每6小时取样检测发酵罐中葡萄糖浓度，同时对样品的灯盏乙素，菌体的生物量进行检测；得到发酵产物；
所述YPD培养基的成分为：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，溶剂为去离子水；
所述矿物培养基的成分为：初始培养基400mL含有硫酸铵(5g/L)、磷酸二氢钾(3g/L)、硫酸镁(0.5g/L)、葡萄糖(40g/L)，2mL微量金属盐溶液、2mL维生素溶液；
所述补料培养基(1L)：葡萄糖(600g/L)、硫酸铵(25g/L)、磷酸二氢钾(15g/L)、硫酸镁(2.5g/L)、10mL维生素溶液、10mL微量金属盐溶液。
本发明的有益效果
本发明构建的一种产灯盏乙素的解脂耶氏酵母基因工程菌能够利用葡萄糖产灯盏乙素，代替植物提取的方法降低生产成本，并且此工程菌中灯盏乙素所占的比例达到80％以上，有效降低副产物灯盏甲素的产量。
附图说明
图1为灯盏乙素在解脂耶氏酵母中的生物合成路径示意图。其中多个箭头代表多个酶催化。
图2为整合载体P1-4CL-CHS图谱。
图3为整合载体P2-FSII图谱。
图4为整合载体P3-CYP82D4-ATR2图谱。
图5为整合载体P4-F7GAT-UDPGDH图谱。
图6为整合载体P6-PAL-C4H图谱。
图7为整合载体P5-4CL-FSII图谱。
图8为整合载体P8-CHS-FSII图谱。
图9为整合载体P10-CYP82D4-ATR2图谱。
图10为重组菌株1生产灯盏乙素的HPLC检测图和LC-MS检测图。
图11为重组菌株1、2、3、4生产灯盏乙素，灯盏甲素的产量柱状图。
图12为重组菌株4在1.3L发酵罐中分批补料发酵灯盏乙素，灯盏甲素产量图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、本发明涉及的菌株和质粒来源如下：
1、实施例中的解脂耶氏酵母W29Δku70(Yarrowia lipolytica W29Δku70)，其出发菌株为W29，KU70位点带Cas9蛋白，根据Holkenbrink C,Dam M I,Kildegaard K R,etal.EasyCloneYALI:CRISPR/Cas9-based synthetic toolbox for engineering of theyeast Yarrowia lipolytica[J].Biotechnology Journal,2018,13(9):1700543.所记载的制备方法制得。
2、PgRNA-YL原始敲除载体购买于Addgene(https://www.addgene.org/)。
3、同源供体质粒即整合载体以pMD-19T为骨架，构建而成带有不同的整合位点的整合载体p1-KU80、p2-IntC-2、p3-IntC-3、p4-IntD-4、p5-IntE-1、p6-IntE-3、p8-ARO10、p10-D17，终止子为tLIP2和tPEX2，整合位点序列参照文献Holkenbrink C,Dam M I,Kildegaard K R,et al.EasyCloneYALI:CRISPR/Cas9-based synthetic toolbox forengineering of the yeast Yarrowia lipolytica[J].Biotechnology Journal,2018,13(9):1700543.以及文献Schwartz C,Shabbir-Hussain M,Frogue K,et al.Standardizedmarkerless gene integration for pathway engineering in Yarrowia lipolytica[J].ACS synthetic biology,2017,6(3):402-409.
4、本实施例中的基因由金斯瑞优化合成，优化是指针对解脂耶式酵母密码子优化，具体涉及以下基因：
(1)优化后的苯丙氨酸解氨酶编码基因PAL：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
(2)优化后的肉桂酸4-羟化酶编码基因C4H：核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
(3)优化后的对香豆酰辅酶A连接酶编码基因4CL：核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
(4)优化后的查尔酮合酶编码基因CHS：核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
(5)优化后的黄酮合酶II连接酶编码基因FSII：核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
(6)优化后的黄酮-7-O-葡萄糖醛酸转移酶编码基因F7GAT：核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示。
(7)优化后的UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因EbUDPGDH：核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
(8)优化后的黄酮-6-羟化酶编码基因CYP82D4：核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
(9)优化后的细胞色素P450还原酶编码基因ATR2：核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
5、所用引物均由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列见表1。
表1
三、本发明涉及的培养基及配制
1.YNB培养基：20g/L葡萄糖、1.7g/L YNB、5g/L硫酸铵，溶剂为去离子水；配制：将各成分溶于去离子水，搅拌溶解，灭菌，即得；
2.YPD培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，溶剂为去离子水；配制：将各成分溶于去离子水，搅拌溶解，灭菌，即得；
3.补料分批发酵培养基：初始培养基400mL含有硫酸铵(5g/L)、磷酸二氢钾(3g/L)、硫酸镁(0.5g/L)、葡萄糖(40g/L)，2mL微量金属溶液、2mL维生素溶液。
4.补料培养基(1L)：葡萄糖(600g/L)、硫酸铵(25g/L)、磷酸二氢钾(15g/L)、硫酸镁(2.5g/L)、10mL维生素溶液、10mL微量金属盐溶液。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1：重组质粒构建
(一)、G1-KU80、G2-IntC-2、G3-IntC-3、G4-IntD-4、G5-IntE-1、G6-IntE-3、G8-ARO10、G10-D17敲除载体构建
以PgRNA-YL载体为模板，用引物pgRNA-ZHONG-5F/G1-3R以及引物pgRNA-ZHONG-3R/G1-5F扩增得到G1-KU80上下游片段，用引物pgRNA-ZHONG-5F/G2-3R以及引物pgRNA-ZHONG-3R/G2-5F扩增得到G2-IntC-2上下游片段，用引物pgRNA-ZHONG-5F/G3-3R以及引物pgRNA-ZHONG-3R/G3-5F扩增得到G3-IntC-3上下游片段，用引物pgRNA-ZHONG-5F/G4-3R以及引物pgRNA-ZHONG-3R/G4-5F扩增得到G4-IntD-4上下游片段，用引物pgRNA-ZHONG-5F/G5-3R以及引物pgRNA-ZHONG-3R/G5-5F扩增得到G5-IntE-1上下游片段，用引物pgRNA-ZHONG-5F/G6-3R以及引物pgRNA-ZHONG-3R/G6-5F扩增得到G6-IntE-3上下游片段，用引物pgRNA-ZHONG-5F/G8-3R以及引物pgRNA-ZHONG-3R/G8-5F扩增得到G8-ARO10上下游片段，用引物pgRNA-ZHONG-5F/G10-3R以及引物pgRNA-ZHONG-3R/G10-5F扩增得到G10-D17上下游片段，对于G1-KU80敲除载体的构建，将G1-KU80上下游片段通过Gibson assembly的方法组装得到G1-KU80敲除载体，同理可以得到其他敲除载体。
上述PCR反应中所用PCR酶为南京诺唯赞生物科技股份有限公司的2×Phanta MaxMaster Mix聚合酶。上述PCR扩增体系如下：
反应体系 体积(μL)
Phanta Max Master Mix聚合酶 25
引物F(10μM) 2
引物R(10μM) 2
模板 2
ddH2O 19
使用USINC.公司的无缝克隆试剂盒进行Gibson组装，体系如下：
反应体系 体积(μL)
Super-Fusion Cloning Mix(2×) 5
线性化载体片段 50～200ng
插入DNA片段 50～200ng
ddH2O 补充至总体积为10μL
将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒。
(二)、同源供体质粒p1-KU80、p2-IntC-2、p3-IntC-3、p4-IntD-4、p5-IntE-1、p6-IntE-3、p8-ARO10、p10-D17的构建。
首先用引物p-T1-F/R将载体pMD-19T线性化得到载体骨架片段，然后以解脂耶氏酵母W29Δku70基因组为模板，用引物p1-KU80-UP-F/R以及引物p1-KU80-DN-F/R扩增得到KU80整合位点的同源臂，用引物p2-IntC-2-UP-F/R以及引物p2-IntC-2-DN-F/R扩增得到整合位点IntC-2的同源臂，用引物p3-IntC-3-UP-F/R以及引物p3-IntC-3-DN-F/R扩增得到整合位点IntC-3的同源臂，用引物p4-IntD-1-UP-F/R以及引物p4-IntD-1-DN-F/R扩增得到整合位点IntD-4的同源臂，用引物p5-IntE-1-UP-F/R以及引物p5-IntE-1-DN-F/R扩增得到整合位点IntE-1的同源臂，用引物p6-IntE-3-UP-F/R以及引物p6-IntE-3-DN-F/R扩增得到整合位点IntE-3的同源臂，用引物p8-ARO10-UP-F/R以及引物P8-ARO10-DN-F/R扩增得到整合位点ARO10的同源臂，用引物P10-D17-UP-F/R以及引物P10-D17-DN-F/R扩增得到整合位点D17的同源臂，用引物p1-tPEX20-F/R扩增得到带有同源臂的终止子PEX20片段，用引物p1-tlip2-F/R扩增得到带有同源臂的终止子tlip2片段。
对于p1-KU80载体的构建，将线性化的pMD-19T载体片段，以及KU80位点同源臂片段，带有同源臂的终止子PEX20片段和终止子tlip2片段通过Gibson assembly的方法组装得到P1-KU80载体，同理可以得到其他整合载体。
(三)、P1-4CL-CHS载体构建
(1)以解脂耶氏酵母W29Δku70基因组为模板，以引物对p-T1-pGPD-F/R和p-T1-pTEFIN-F/R，分别扩增解脂耶氏酵母内源强启动子GPD和TEFIN，再以上述得到的启动子GPD和TEFIN片段为模板，用引物p-T1-pGPD-F/p-T1-pTEFIN-R扩增得到融合双向启动子片段。
(2)以合成的4CL基因为模板，用引物p1-Eb4CL-F/R扩增得到4CL片段，以合成的CHS基因为模板，用引物p1-EbCHS-F/R扩增得到CHS片段。
(3)用引物p-T1-tPEX20-F/p-T1-tlip2-F对质粒p1-KU80进行线性化处理得到线性化载体骨架。
(4)将线性化p1-KU80骨架片段，双向启动子片段，4CL基因片段，CHS基因片段通过Gibson assembly的方法组装获得整合载体P1-4CL-CHS，如图2所示。
(四)、P2-FSII载体构建
双向启动子片段，线性化p2-IntC-2骨架片段的获得方法同上述p1-KU80载体，FSII基因片段通过引物P2-EbFSII-5F/3R扩增获得，通过Gibson assembly的方法组装获得整合载体P2-FSII，如图3所示。
(五)、P3-CYP82D4-ATR2载体构建
双向启动子片段，线性化p3-IntC-3骨架片段的获得方法同上述p1-KU80载体，CYP82D4基因片段通过引物P3-SbarCYP82D4-F/R扩增获得，ATR2基因片段通过引物P3-ATR2-F/R扩增获得，通过Gibson assembly的方法组装获得整合载体P3-SbarCYP82D4-ATR2，如图4所示。
(六)、P4-F7GAT-UDPGDH载体构建
双向启动子片段，线性化p4-IntD-4骨架片段的获得方法同上述p1-KU80载体，F7GAT基因片段通过引物P4-EbF7GAT-F/R扩增获得，UDPGDH基因片段通过引物P4-EbUDPGDH-F/R扩增获得，通过Gibson assembly的方法组装获得整合载体P3-SbarCYP82D4-ATR2，如图5所示。
(七)、P6-PAL-C4H载体构建
双向启动子片段，线性化p6-IntE-3骨架片段的获得方法同上述p1-KU80载体，PAL基因片段通过引物P6-EbPAL-F/R扩增获得，C4H基因片段通过引物P6-EbC4H-F/R扩增获得，通过Gibson assembly的方法组装获得整合载体P6-EbPAL-EbC4H，如图6所示。
(八)、P5-4CL-FSII载体构建
双向启动子片段，线性化p5-IntE-1骨架片段的获得方法同上述p1-KU80载体，用引物p1-Eb4CL-F/R扩增得到4CL片段,FSII基因片段通过引物P2-EbFSII-5F/3R扩增获得，通过Gibson assembly的方法组装获得整合载体P5-4CL-FSII，如图7所示。
(九)、P8-CHS-FSII载体构建
双向启动子片段，线性化p8-ARO10骨架片段的获得方法同上述p1-KU80载体，用引物p1-EbCHS-F/R扩增得到CHS片段,FSII基因片段通过引物P2-EbFSII-5F/3R扩增获得，通过Gibson assembly的方法组装获得整合载体P8-CHS-FSII，如图8所示。
(十)、P10-CYP82D4-ATR2载体构建
双向启动子片段，线性化p10-D17骨架片段的获得方法同上述p1-KU80载体，CYP82D4基因片段通过引物P3-SbarCYP82D4-F/R扩增获得，ATR2基因片段通过引物P3-ATR2-F/R扩增获得，通过Gibson assembly的方法组装获得整合载体P10-SbarCYP82D4-ATR2，如图9所示。
实施例2.重组菌株构建
(一)、重组菌株1的构建
用引物YL-p1-F/R对整合载体P1-4CL-CHS进行线性化处理得到4CL和CHS基因表达盒，用引物YL-p2-F/R对整合载体P2-FSII进行线性化处理得到FSII基因表达盒，用引物YL-p3-F/R对整合载体P3-SbarCYP82D4-ATR2进行线性化处理得到CYP82D4基因和ATR2基因表达盒，用引物YL-p4-F/R对整合载体P4-EbF7GAT-EbUDPGDH进行线性化处理得到F7GAT基因和UDPGDH基因表达盒，用引物YL-p6-F/R对整合载体P6-EbPAL-EbC4H进行线性化处理得到PAL基因和C4H基因表达盒。
将4CL和CHS基因表达盒与敲除载体G1-KU80通过醋酸锂的方法整合到解脂耶氏酵母W29Δku70菌株中，再将FSII基因表达盒与敲除载体G2-IntC-2通过醋酸锂的方法整合到含有4CL和CHS基因表达盒的菌株中，将CYP82D4基因和ATR2基因表达盒与敲除载体G3-IntC-3通过醋酸锂的方法整合到含有4CL和CHS基因表达盒和FSII基因表达盒的菌株中，将F7GAT基因和UDPGDH基因表达盒与敲除载体G4-IntD-4通过醋酸锂的方法整合到含有4CL和CHS基因表达盒、FSII基因表达盒和CYP82D4基因和ATR2基因表达盒的菌株中，将PAL基因和C4H基因表达盒与敲除载体G6-IntE-3通过醋酸锂的方法整合到含有4CL和CHS基因表达盒、FSII基因表达盒、CYP82D4基因和ATR2基因表达盒和F7GAT基因和UDPGDH基因表达盒的菌株中获得重组菌株1。
(二)、重组菌株2的构建
用引物YL-p8-F/R对整合载体P8-CHS-FSII进行线性化处理得到CHS和FSII基因表达盒，将上述表达盒及敲除载体G8-ARO10通过醋酸锂的方法重组菌株1中获得重组菌株2。
(三)、重组菌株3的构建
用引物YL-p10-F/R对整合载体P10-CYP82D4-ATR2进行线性化处理得到CYP82D4和ATR2基因表达盒，将上述表达盒及敲除载体G10-D17通过醋酸锂的方法重组菌株2中获得重组菌株3。
(四)、重组菌株4的构建
用引物YL-p5-F/R对整合载体P5-4CL-FSII进行线性化处理得到4CL和FSII基因表达盒，将上述表达盒及其敲除载体G5-IntE-1通过醋酸锂的方法重组菌株3中获得重组菌株4。
实施例3.产灯盏乙素的解脂耶氏酵母基因工程菌的应用
(一)、工程菌的培养及产物提取
分别采用实施例2中重组菌1-4生产灯盏乙素。具体方法如下：活化重组菌，于YNB液体培养基中30℃、220rpm条件下培养48h，得到种子液。将种子液以1％的接种量接种于30ml YNB发酵培养基中，在30℃、220rpm震荡培养4天。发酵结束后，取500微升发酵液与500微升甲醇充分混匀，超声30分钟，12000rpm离心20分钟。取200微升进行产物检测。
(二)、HPLC、LC-MS检测条件
HPLC分析：仪器：岛津高效液相色谱仪1200；色谱柱：Kinetex H15-168747(4.6×250mm)，紫外检测器，检测波长290nm；流动相：A相为0.1％甲酸；B相为乙腈；C相为甲醇，起始浓度：A:73％、B:22％、C:5％，流速：1mL/min
柱温：30℃，检测器：PDA检测器。梯度洗脱程序：(浓度为B相百分比)
0-10min 22％，10-20min 30％，20-22min 90％，25-30min 22％。
LC-MS分析：质谱仪：Bruker-micrOTOF-II：ESI离子源，正离子模式；核质比(m/z)：50-1000；氮气流速：6.0升/分钟；温度：180℃；雾化器压力：1bar；探头电压：14.5KV。
(三)、结果
重组菌株1的HPLC检测结果如图10所示，4.536分钟的峰与灯盏乙素标品出峰时间一致，6.379分钟的峰与灯盏甲素标品出峰时间一致，LC-MS检测结果如图10所示，其中重组菌1、重组菌2、重组菌3、重组菌4灯盏乙素产量分别为37.48mg/L，40.20mg/L，62.66mg/L，94.79mg/L，灯盏甲素的产量分别为1.34mg/L，2.25mg/L，10.38mg/L，15.34mg/L，如图11所示。
实施例4.重组菌4补料分批发酵
将实施例2中所述的产灯盏乙素的重组菌株4在1.3L发酵罐中进行补料分批发酵实验，本实施例选用的培养基为补料分批发酵培养基，初始体积为400毫升。从甘油保种管中取出菌液在YPD固体平板上划线，培养48h，从平板中挑取一个单菌落到4mL矿物培养基中在230rpm，30℃的条件下培养48小时再转接到40mL的补料分批发酵培养基中，培养1天，将此种子液接种到1.3L的发酵罐中进行补料分批发酵，在整个发酵过程中，温度保持在30℃。通过自动添加10％的氨水将pH值维持在5.0，溶解氧(DO)被设定为40％，初始通气量被设定为0.5L/min。补料培养基中含有600g/L D-葡萄糖其余成分是初始培养基的5倍。每6小时取样检测发酵罐中葡萄糖浓度，同时对样品的灯盏乙素，菌体的生物量进行检测。图12显示发酵结果，在发酵118h时，菌体的生物量为66.8g/L，灯盏乙素的产量为346mg/L，副产物灯盏甲素的产量是75.14mg/L，灯盏乙素所占比例达到80％以上。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种产灯盏乙素的重组解脂耶氏酵母及其构建方法和用途
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2136
<212> DNA
<213> 灯盏花(Erigeron breviscapus)
<400> 1
atggagaatg gacatgccaa tggtgttgct tctgagctgt gcatcaacaa ggaccccttg 60
aactggggtg ttgcggctga agctcttact ggatcacatc tcgacgaggt gaagcgaatg 120
gtggctgagt tccgaaagcc tcttgtcaaa cttggaggag agaccctaac ggtgagccaa 180
gtggcaggca tcgcagctgc gggagactct agcgttgtta aggttgagct gagtgagtcg 240
gcccgtgctg gagtgaaagc ctcttcaaac tgggtcatgg aaagtatgaa caagggcaca 300
gactcctatg gggttacgac aggtttcggc gccacttctc ataggcgtac caagaacgga 360
ggagcgctgc aaaaggaact tatacgattt ctgaacgccg gtatttttgg aaacggtacc 420
gagtcctccc acactctgcc ccattctgca acccgagccg ccatgttggt gagaatcaac 480
acccttcttc agggatactc tggtatccgg ttcgagattc tggaagccat cacaaagttc 540
ctgaacacga acatcacccc ctgtctgcct ctgcgaggaa ccatcacggc tagtggcgat 600
ctggtcccac tgtcgtacat tgcaggtctg ctcactggta gaccgaactc caaggctgtg 660
ggtcctaacg gggaagttct caacgccgag aaagcattca agttggctgg agtcgagggt 720
ggcttcttcg aactacagcc caaagagggg ctagctctgg tcaatggcac cgctgtcggc 780
tcaggaatgg ctagcatggt cttgtttgag gcgaatgtcc tcgctctgct gagcgaggtc 840
ctgtctgcaa tttttgcgga ggtgatgcag ggaaaacccg agtttaccga ccaccttaca 900
cacaagctga agcaccaccc cggccagatt gaggccgccg ccatcatgga gtacatcctc 960
gacggaagcg actacgtcaa ggctgctcaa aaggtccacg agatggaccc ccttcagaag 1020
cccaagcagg accggtatgc cttacgaact tcgccccagt ggctgggccc tctgatcgaa 1080
gtcatcagat cctctaccaa gatgatcgag cgagaaatca actctgttaa tgacaacccc 1140
ctgattgatg tttcgcgaaa caaagccttg cacggcggca acttccaggg cactcctatt 1200
ggtgtatcca tggacaacac ccgactcgcc attgcagcaa ttggcaagct catgttcgcc 1260
cagttttcgg aactggtgaa cgatttctac aacaatggtc tcccatccaa cctgagtggc 1320
gggagaaacc caagcttgga ttacggattc aagggaggtg agatcgccat ggcctcgtac 1380
tgctccgagt tgcagttcct cgccaacccg gttaccaacc acgtccagtc tgccgaacag 1440
cacaaccagg atgtcaactc gctgggcctc atttccgctc gaaagaccgc cgaggctgtg 1500
gacattttaa agcttatgtc atctacatac ctcgtggccc tctgccagtc cgtggatcta 1560
cggcatctgg aagaaaacat gaagtctgtc gtaaaaaaca ctgtcagtca agtcgccaag 1620
aaggtgttga ccatgggcgt taatggagag ctccatccct ctcggttctg tgagaaggat 1680
cttctcagag tggttgatcg cgagtatgtg tttgcctaca ttgacgaccc ttgtctggcg 1740
acttacccac tgatgcagaa actccgacag gtgctggtcg accacgcact caacaacggg 1800
gagacagaaa agaatacgaa tacttcgatc tttcagaaga ttgccacctt tgaagaggag 1860
ctcaaggcta ttctacctaa ggaggtagaa tcagtacgcg ttgccttcga gaacgacact 1920
ctgtccattc ccaatcgaat caaggcgtgt cgatcctacc ccctctaccg gttcgtccgt 1980
gaggaactgg gaggttcgta tctgaccgga gagaaggtta cctccccggg cgaggagttt 2040
gaccgagtct tcaccgcaat gtgcaaaggt cagatcatcg accctcttct ggagtgtgtg 2100
gagggctgga acggcgctcc tctccccatt tgctga 2136
<210> 2
<211> 1518
<212> DNA
<213> 灯盏花(Erigeron breviscapus)
<400> 2
atggacctgc tgttgctcga gaagactctc attgcgctct ttgccaccat tatcatcacc 60
atcattattt ccaaactgcg aggaaagaag ttcaagctgc ctcccggacc cacggcggtc 120
ccgatctttg gaaactggct ccaggtgggt gatgatctca accatcgaaa tctgaccgac 180
ctggcaaaaa agtttggaca gattttcttg ttgcggatgg gccagcgaaa cctggtggtg 240
gtttcctctc cagatctggc taaggaggtg ctccatacac agggcgttga gtttggctcg 300
cggactagaa atgtggtttt cgacatcttc acgggcaagg gccaggacat ggtgtttact 360
gtttatggag agcactggag aaagatgcga cggatcatga ccgtcccctt cttcaccaac 420
aaggtcgtcc aacagtaccg aaagggatgg gaggatgagg ccgctgctgt tgtggaagat 480
gtcaagaaga accccaagtc tgcaactgag ggtgttgtca tccgaaagcg gcttcagctc 540
atgatgtaca ataacatgtt tcgaatcatg ttcgatcgac ggtttgattc tgaagacgac 600
cccctatttc tgaaactcaa ggccctgaat ggggagcgat ctcgactagc ccagtcattt 660
gagtacaact acggtgactt cattcccgtc cttcgccctt tcttgagagg atacctcaaa 720
ttgtgcaagg aggtcaagga caagcgactg caactcttca aagactactt tgtggatgag 780
aggaagaaga taggctctac aaaaaaactg gacaataacc agctgaagtg cgccatcgac 840
cacattctcg aggctaagga taagggtgag attaacgagg acaacgtgct gtacattgtc 900
gagaacatta acgttgctgc cattgagacc accctgtggt ccatcgagtg gggcattgcg 960
gaacttgtga accaccccga aatccaggcc aaactacgac acgagctcga taccaagctg 1020
ggtagtggcg tgcagattac cgagcccgac gtgcaaaacc ttccttatct gcaggctgtg 1080
gtcaaggaaa cgcttcgtct tcgtatggct atccctctcc ttgttcccca catgaacctg 1140
cacgacgcca agctcggggg cttcgacatc ccggccgagt ccaagattct ggtcaacgcc 1200
tggtggctgg ccaacaaccc tgaccagtgg aagaagccgg aggaattccg ccctgaacgg 1260
ttcctggaag aagaagcgaa ggtggaggca aacggcaacg actttagata ccttccgttt 1320
ggtgtaggac gacgttcatg tcccggtata atcctggcac ttcccattct tggaatcact 1380
ctgggaagac tagtacagaa cttcgagttg ttgccacctc ctggccaatc gaaaatcgac 1440
acaagcgaga agggtggtca gttctcgctg catatcctca agcatagcac aatcgtcgct 1500
aagccaaggt ccttctga 1518
<210> 3
<211> 1623
<212> DNA
<213> 灯盏花(Erigeron breviscapus)
<400> 3
atggattctc agaaggagat catcttccgt agtaaattgc cggacatcta catccctaag 60
cacctcccat tacatagcta ctgctttgag aacatctcga agtttctgga ccggccctgt 120
ctgataaatg gcgccacggg tgaggtgcac acgtacgccg acgtggaatt gacaagccgg 180
aaggttgcga gcgctcttca ccagcaaggt atttccaagg gagacgtcat tatgattctt 240
cttcccaatt cacccgagtt cgtctattca ttcatcggtg cgagttatct gggagccatc 300
tcaaccatgg ctaacccttt ctttacggcc gctgaaataa tcaagcaagt taaagcctct 360
aactcgaaaa tcatcattac ccagtctgct cacatcccca aagtcaagga ctacgcttct 420
gacaactcca tcaagctggt gtgcattgac tctgcacccc ttggatgtct tcatttcagc 480
gaattgactt ctgcagacga gaccaagctc ccacagattg aagtttcctc ggatgacgtt 540
gttgcgttgc cgtactcctc gggaaccact ggcctaccca agggagtgat gctgactcac 600
aagggtctgg taacatcggt ggcccagcag gtcgatggtg aaaaccccaa cctgtggatc 660
cactccgagg acgtgcttat gtgttctttg cccctcttcc acatttattc cctcaattcc 720
attctgcttt gcggtctgag agccggcgcg gccatactcc tgatgtcgaa gtttgacatc 780
gtgcccttcc tccaactcat cgagaagtac aaggtgacga ttggaccttt tgtgcctccc 840
atcgttttga ccattgccaa caacgaggag cttgtggaca agtacgacat gtcgtccatt 900
cgaaccgtca tgtctggagc tgcaccgctg ggcaaggacc tggaggatac agtgcgaatg 960
aagttcccca atgccaagct gggccaggga tacggcatga ccgaggctgg tccagtgctg 1020
gccatgtgcc tcgcctttgc taaggagccc tttgacatta agtccggcgc gtgtggtact 1080
gtcgttcgca acgccgagat gaagattgtc gatcctgact caggcgtctc tttgcctcga 1140
aaccagcgag gagagatctg tattaggggc gaccagatca tgaaaggtta cctcaacgac 1200
cctgaagcta ctaagagaac cattgatagc gagggctggc tgcatacagg ggacattggt 1260
cttattgacg acgatgatga gctcttcatt gtggaccgac tgaaggaact gattaaatac 1320
aagggcttcc aggttgctcc tgccgaactc gaggcactgc tgctcaccca tccagacatc 1380
tccgatgccg ctgtggtccc catgatcaac gaagcagctg gcgaggttcc agtcgccttc 1440
gtcgttaaga ccaacggaag ttccgtgact gaggacgata ttaagcagtt tgtgtccaaa 1500
caggtggtgt tctacaaacg aatcaaccga gtcttctttt gcgagactat ccctaagtct 1560
ccttccggaa agattctacg aaaggatctc cgtgccaagc tggctgctgg ggtaccgtcg 1620
tga 1623
<210> 4
<211> 1197
<212> DNA
<213> 灯盏花(Erigeron breviscapus)
<400> 4
atggcctcgt ctatagacat tgctgctatc agagaggctc agcgagccca gggtccggcc 60
accattctcg caattggcac cgccactccc tccaattgtg tctaccaagc cgactacccg 120
gattactact tccgaattac aaagagcgag cacatggtgg atctcaagga aaagttcaaa 180
cgaatgtgcg acaagtccat gattcgcaaa cgatacatgc acctcaccga ggagtatctg 240
aaagagaatc cttctctgtg cgaatacatg gctcccagct tggacgcgcg acaggacgtg 300
gtcgttgtgg aagtgccgaa actgggcaag gaggccgcca ccaaggccat caaggagtgg 360
ggccagccca agtctaagat cactcacctg atcttctgca ccacaagcgg tgttgacatg 420
cctggagctg attatcaatt gaccaagctg ctgggactac gtccttcagt caagcggttc 480
atgatgtacc agcagggatg ttttgctgga ggaactgttc tccggctggc caaggacttg 540
gctgagaaca acaagggcgc tagagttcta gtagtatgct cggaaatcac ggcagtcacc 600
ttccgggggc ccaacgatac ccatttggac tcgctggtcg gtcaggctct ctttggagac 660
ggtgccgcgg cggtcattgt ggggtccgat cccgatctga caactgagcg acctctgttt 720
gagatgatct ctgctgccca aaccatcctg cccgacagtg aaggagccat cgatggccat 780
ctgcgtgagg tgggactgac tttccacttg cttaaggatg tgcccggact catctccaag 840
aacattgaga aggcgcttac ccaggccttt tctccacttg gcatttcaga ctggaactcg 900
cttttctgga tcgcgcatcc aggaggccct gctattctgg accaggtgga gctcaagctc 960
ggtttgaaag aagagaagat gcgagcaact cgacatgtgc tctccgagta cggcaacatg 1020
tcctcagctt gtgtgctatt catcattgac gaaatgagaa agaagtctgc cgaggacggc 1080
gcagcaacga cgggcgaggg tctggattgg ggagtcctct ttggctttgg tcctggttta 1140
acggtcgaga ccgttgttct gcacagtctt cccacaacca ctgccattgc cacttga 1197
<210> 5
<211> 1560
<212> DNA
<213> 灯盏花(Erigeron breviscapus)
<400> 5
atgaacatgc tccaggtttt ccaatctgtc ccgcccgcaa tcatcgccac agcattgttt 60
agctcattaa tcttcttcta ctttttgctg aaaaaaaacc ccaacaaccg acttccgccc 120
tcgccgccta gtctgcctat cttcggccat cttcaccatc tggggcctct gatccaccag 180
tccttccaca acctgacaac caagtacggc ccactgattc atctgcgtct gggatctgta 240
ccctgcattg tggcgtctac tcccgacctc gcgtttgagt ttcttaaaac gaatgaattg 300
gccttctcct cccgaaagca ttcgctggct attgaccaca tcacctatgg agtcgctttt 360
gcctttgctc cctatgccac ctactggaag ttcatcaaaa agctttcaac ggtggaactg 420
ctgggtaacc agaacctcgg tcatttcctg cccatccgaa ccaacgagat caaggagctc 480
ttccagactc ttcttatcaa gtctgaaaga aaggagtctg ttaatctgtc agaggagctg 540
ctcaagctca ccaacaacgt gatctgccag atgatgatgt ccattcgatg ttctggcact 600
aatagcgagg ccgacgaggc taagaatttg gtccgcgagg ttaccaaaat ctttggtgag 660
ttcaacgtct ctgatttcat ttggttctgc aagaacattg atctgcaggg cttcaagaaa 720
cggtacgagg atattcacac tcgatacgac gctctcctcg aaaagatcat ttttgaacga 780
gagcagaaga gaaggagtga ccaaggaaac aaggaattcg gtgacaaggg caaggacttt 840
ctggacatgc tgttagatgt catggaggac aacaaagctg agatcaagat cacacgtaac 900
cacattaagg ccctcatcct cgacttcttc actgctgcca cagacactac ggccatctcc 960
atcgagtgga ccctcgttga gctggtgaat aatcctaagg tgctggagaa agccaagaag 1020
gagattgcgg aggtgattgg agatgagcgg ctggttcagg agtcggacat tgccaacctt 1080
ccctacattc aggccattgt caaggagtcg ctgcgaatcc atcctcccat tcccatgctt 1140
attcgcaagt cgattgagaa ggtcaccgtg caaggatacg aaatccctgc aggtaccatg 1200
ctgtttgtca acatatggtc cattggcaga aacccaaact actgggaaaa ccctctcgag 1260
tttaatccgg acagattttt caagggcgat tctctgaact cctcactcga tataaagggt 1320
cacagcttcc agctgctacc ttttggaacc ggccgacgag gttgtcccgg aatcaacttg 1380
gccatgcgag aactccccgt tgtcattgct ggtctcatcc agtgtttcga atggactgcc 1440
gatcacaagc acgtgtcctg catggacgag cgagctggac tgaccgcacc acgggctgtg 1500
gactatgtat ttgtgcctct aaagcgtaag aactgttccc agattttggg ctcgacatga 1560
<210> 6
<211> 1419
<212> DNA
<213> 灯盏花(Erigeron breviscapus)
<400> 6
atggagaaca ttgtcgtcat gttcccttcg ctgcagattg gacacctggt tagcatggtg 60
gagcttggca agctgattat tgctgctgac gactcttttg ccatcaccat tctgctgacc 120
ccccagcatt acgaaaacaa atccaccgtg gactacatca aaacaatcag tagcacgaca 180
ccaagcatca cattccacta cttgccgaca ttgtctcagc aaccggatcc ttccgcgcat 240
ttcttcgatc tagtcttcca gctcattact gcttataagc ccattcttcg tgacaccctg 300
ttgtctatca gccaaaagtc taatattaag ggagtcatta tcgatttcct ttcaaacgac 360
gcctttgacg tgtgtcgatc tctggacatt cccacgtact acttgttcac caacagcgct 420
tttggcttag gagtgatgct ctatctgcga accctgcaca agaatatcac ggagtccttc 480
aaggatatga aatcttacat tgaggtgccc ggtgttcctc caatattcag cctcgacatg 540
cctggaactc ttcaggaccg aaacaccttt tcatacaaga acattctcaa catctccaat 600
aacatggcga aatcgcaggg gatcatcaac aactcgtttg ctgccctcga gcagcgagtc 660
atgaagactc tggctgatgg tgaacatatt cccgacggtc ctactccacc catatactat 720
gtcggccccc ttatcaggaa tgccacgtcc gacaacgcca aggacaagtc tatccagtgg 780
ctggattcgc agcctcccaa gtcggtggtg gttttgatct ttggaaccat gggaaagttc 840
aagaaaaacc agctgattga gatggccaac ggcctggaga agtctggcca gcggtttctg 900
tgggtcgtcc gagaccctcc tcaggagtct gaaaagcgac atgactttgc aaagtcaatc 960
gagcccaacc tggaggatct gctcccggct gggttcctgg atcgcaacaa ggagaagggt 1020
cttgtgctca aaaactgggc ccctcaaggc gagattctaa gacacggctc tgtgggtggt 1080
ttcgtttgcc actgtggatg gaactctgtt ttggaagcgc tcaataccgg agttcccatg 1140
ctggcctggc ccctctacgc cgaacaaaag atgaaccgag tcagtcttgt cgagggtatc 1200
aaggtagcac taagactcga aatgtccgag gacggctttg tgactgcaga cgagctagct 1260
gccagactga aagaactcat ggaagaggag tcgggcatgc ggctcaagga gcacgtgtcg 1320
gccatttcca agtcggcaaa ggccgcgatg gctgagggag gcagttctcg tgtcgccgtg 1380
gccgagttga tcaagtccct caagtccgct cgggtttga 1419
<210> 7
<211> 1209
<212> DNA
<213> 灯盏花(Erigeron breviscapus)
<400> 7
atgaagattg ctgttgctgg ttctggctat gtcggtctgt cgcttggagt gcttctttct 60
ctgcagaacg aggtgacgat agtcgatatc ctcccttcca aggtggacaa gatcaacaac 120
gggctatcgc cgatccagga cgagtacatt gagtactact tgaagtcgaa acaacttagc 180
atcaaggcca cgctagattc taaggcagct tacaaggaag ctgagcttgt cattattgcc 240
actccaacca actacaattc ccgaatcaac tactttgaca cacaacatgt ggagactgtc 300
atcaaggagg ttttgtctgt taactcgcat gcgactctga ttattaaatc caccatcccc 360
attggattca tcaccgagat gcgacagaag ttccagaccg accggataat cttctctccc 420
gagttcctcc gcgagagtaa agcgctctac gacaacctgt acccttcccg gatcatcgtt 480
tcgtgcgaag agaacgattc tccaaaagtg aaggcagacg ccgagaagtt tgctcttctg 540
ctcaagtcag cggccaagaa gaacaacgtt cctgtcctca ttatgggtgc ctccgaggct 600
gaagcagtca agctgtttgc aaacacttat ctcgctctcc gagttgccta cttcaacgaa 660
ctcgacacct acgccgagtc gcgtaagctc aactctcaca tgattatcca aggaatcagc 720
tatgacgacc gaattggcat gcactacaac aacccgtcct ttggctatgg cggatactgt 780
ctgcccaagg ataccaagca gctgctggcc aattataata acattcccca gacactaatc 840
gaggccattg tgtctagcaa taatgttagg aagagttaca tcgccaaaca gatcattaac 900
gtgctggagg agcgagagtc tcctgtaaag gtggtgggcg tgtacagact gatcatgaag 960
tccaactccg acaattttcg agaatctgct attaaagatg tgattgacat cttgaagagc 1020
aaggacataa aaataattat ctacgagccc atgctgaaca agctggaatc cgaagaccag 1080
tcagtactgg tcaacgacct cgagaacttc aagaagcagg ccaacatcat tgtcacaaac 1140
cgttacgata atgagctcca ggatgtcaag aacaaggtct acagcagaga tattttcaac 1200
cgagactga 1209
<210> 8
<211> 1578
<212> DNA
<213> 黄芩(Scutellaria Baicalensis )
<400> 8
atggagctga ttacttccgt catgtatggt gtcattgctc tcctttcttt gttttactgc 60
tacctgttat acttctccaa acccaagtct agttcgcgtc gacctccacc ggaggctggc 120
ggtgcgcggt ttatcaccgg ccacctgcat ctcatggacg gacgttcgag cgataaattg 180
cctcacatca acttgggaag cgttgctgac cggtgtggtc ccatcttcac gataagactc 240
ggggtgcggc gtgcgcttgt ggttagttcc tgggaactca ctaaggaact gttcacaacc 300
aacgacatgg tcgtgatggg acgacccgaa ctcattgccg atgactacct ttcatacgac 360
agagcatcgt ttggcttcgc cccctatgga gcttactgga gagagattcg aaaactggtg 420
actacagagc tgctgtctgc tcgacgaatt gagctgcaac ggtccatccg agtcacggag 480
attgagcaac tcacccgaga actctacact ctgtgggagg gcgagcgaga cggatcgggc 540
cgagtgcttg tcaacatgaa acgatggatg ggtaacctca gtctcaatct ggtggccatg 600
atggttgtgg gaaagcgatt ctacggcggc gatgattcgg agaccaccaa gacctggcag 660
aaggtcatgc gagagttctt ccagctggtg ggccagttca tccctggaga tgccatgccc 720
tacttgaggt ggctcgatct cggcggtttc gagaaacgca tgaagtacgc tgcatctgag 780
ctggacaaga tgatcgcagg atggctggca gagctgcgag agaagggata ctcaggagac 840
gacggcaagg ccgccgccca gaacttcatg gaggtcatgg tttctctggt tcagtcgaac 900
cccaacctcc aggcctactt tgacgcggat accattatca agagcacctg ccaggttctt 960
atcacagctg cctctgatac ctccacggtt attcttatct gggtgctgtc acttttgcta 1020
aaccaccccc atgttctcaa gaaggcccag tctgaacttg accagcaggt gggtcgagaa 1080
cgacgtgtcg aggagtcgga cattagcaac ctgccgtatc tgcaggctgt cgtcaaggag 1140
actcttagac tgtaccctcc tgctccattt gccggtgcac gcatgtttat ggaagactgc 1200
accgttggtg gattcacggt gcaaaagggc accattctgc tcctcaatct ctggaagctg 1260
catagagacc ccagagtgtg gtctgacgac gtgctcgaat tcaagccaga gcgctttctg 1320
gatcgtcaca agaacgtgga gatcaaggta caggactttg agtacatgcc ttttggaggt 1380
gggcggcgta tgtgtcctgg ttctaatcta ggcattcgaa tggtgctctc cgtattggcc 1440
aacttactgc aagctttcga tctgtccact gtcgacgatc tttctgtgga catgaccgag 1500
tccgtcggtc tgacaaacat gaaggccact ccgctggaaa tcctcctcaa gccccgactg 1560
tcgcaccatc tgtattga 1578
<210> 9
<211> 2139
<212> DNA
<213> 黄芩(Scutellaria Baicalensis )
<400> 9
atgtcctcaa gctcgtcgag ttcaacatcg atgattgatc tcatggctgc catcatcaag 60
ggagagccag tcattgtgtc tgatcctgcc aatgcttctg catatgaatc cgtcgccgct 120
gagctgtcct ccatgcttat cgagaataga cagttcgcca tgattgttac aacctccatc 180
gccgtgctca ttggatgtat tgtgatgctg gtctggcgac gaagtggctc gggcaacagc 240
aagcgagttg aacctctaaa acctctggta atcaagcctc gtgaggaaga gattgacgac 300
ggacgcaaga aggtcaccat cttctttgga acccagaccg gaacggctga gggcttcgct 360
aaggccctgg gcgaggaggc caaagcgcga tacgaaaaga ctcggtttaa aatagtggat 420
ctggacgact acgctgcaga cgacgatgag tatgaggaga agctgaaaaa ggaggacgtc 480
gctttcttct tcctggccac ttacggcgat ggtgagccca ctgacaatgc ggcccggttt 540
tacaagtggt tcaccgaggg taacgaccga ggggagtggt tgaaaaatct aaagtacggt 600
gtatttggcc ttggaaaccg acagtacgag cacttcaaca aggtggccaa ggtggtagat 660
gatattctcg tggagcaggg agctcaacgt ctggtccagg ttggtctcgg agacgatgac 720
cagtgcattg aggatgactt tactgcatgg agagaagctc tgtggcccga actcgacacc 780
attctgcggg aggaaggtga cacagccgtt gccacccctt acacggctgc cgtcttggag 840
taccgggtca gcatccacga ctcggaagat gccaagttca acgatatcaa catggcgaac 900
ggcaatggat acaccgtgtt cgacgcccag cacccctaca aggccaacgt ggctgttaag 960
cgcgagttgc atacccccga gtccgatcgt tcctgcatcc acctcgagtt tgacatcgct 1020
ggatccggat tgacatacga aactggagac cacgtgggtg tcctctgcga caacctgtct 1080
gagacggtgg acgaggcact ccggcttctt gacatgtctc ccgacaccta cttctccctt 1140
catgccgaga aggaagacgg cactcctatc tcttctagcc tgcctccgcc gttccccccc 1200
tgcaacctca gaacggccct cacccgctat gcctgtctgc tgtcgtctcc aaagaaatcc 1260
gctctggtgg cactggcggc tcacgcgtcc gaccccactg aggctgagag gctgaagcat 1320
ctggcctcgc cagcgggcaa ggttgacgaa tactctaagt gggtcgttga aagccagcga 1380
tctctgctgg aggtgatggc cgagttccct tcagctaagc ccccgttggg agtcttcttt 1440
gctggagtgg cacctcgact gcagccccga ttctactcca tttcaagttc tcccaaaatt 1500
gcagagactc gcattcatgt tacctgtgct ctagtctacg aaaaaatgcc caccggccga 1560
atccataagg gtgtctgctc tacctggatg aagaacgctg tgccctatga gaagagtgag 1620
aactgctctt ccgcccctat ttttgtgcga caatccaact tcaagctccc ctcggattcc 1680
aaagttccca tcatcatgat tggcccagga actggcttgg caccgttccg aggctttcta 1740
caggaacggc tggctcttgt ggagtctggt gttgagctgg gccccagtgt gctctttttt 1800
ggctgtcgaa acagacgaat ggatttcatc tacgaagagg agcttcagcg ttttgtcgag 1860
tccggtgccc ttgcagagct ctctgtcgcc tttagcagag agggtcctac aaaggagtac 1920
gtccaacaca agatgatgga caaggcttct gacatctgga acatgatctc acagggcgcg 1980
tacctctacg tgtgtggaga tgcgaagggc atggctagag acgttcaccg ttcgttgcat 2040
acaattgccc aggagcaagg tagcatggat tctaccaagg cagaaggttt cgtcaagaac 2100
ctccagacgt ctgggagata tctccgagac gtgtggtga 2139

Claims (16)

1.一种产灯盏乙素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：向解脂耶氏酵母中导入密码子优化的灯盏花来源的苯丙氨酸解氨酶编码基因PAL、肉桂酸4-羟化酶编码基因C4H、对香豆酰辅酶A连接酶编码基因4CL、查尔酮合酶编码基因CHS、黄酮合酶II连接酶编码基因FSII、黄酮-7-O-葡萄糖醛酸转移酶编码基因F7GAT、UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因UDPGDH，黄芩来源的黄酮-6-羟化酶编码基因CYP82D4、拟南芥来源的细胞色素P450还原酶编码基因ATR2进行表达。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，
所述苯丙氨酸解氨酶编码基因PAL为如下a1)-a3)中任一种DNA分子：
a1)如SEQ ID NO：1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
a2)在严格条件下与a1)限定的DNA分子杂交且编码所述苯丙氨酸解氨酶PAL的cDNA分子或基因组DNA分子；
a3)与a1)或a2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述苯丙氨酸解氨酶PAL的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述肉桂酸4-羟化酶编码基因C4H为如下b1)-b3)中任一种DNA分子：
b1)如SEQ ID NO：2所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
b2)在严格条件下与b1)限定的DNA分子杂交且编码所述肉桂酸4-羟化酶C4H的cDNA分子或基因组DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述肉桂酸4-羟化酶C4H的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述对香豆酰辅酶A连接酶编码基因4CL为如下c1)-c3)中任一种DNA分子：
c1)如SEQ ID NO：3所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
c2)在严格条件下与c1)限定的DNA分子杂交且编码所述对香豆酰辅酶A连接酶4CL的cDNA分子或基因组DNA分子；
c3)与c1)或c2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述对香豆酰辅酶A连接酶4CL的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述查尔酮合酶编码基因CHS为如下d1)-d3)中任一种DNA分子：
d1)如SEQ ID NO：4所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
d2)在严格条件下与d1)限定的DNA分子杂交且编码所述查尔酮合酶CHS的cDNA分子或基因组DNA分子；
d3)与d1)或d2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述查尔酮合酶CHS的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述黄酮合酶II连接酶编码基因FSII为如下e1)-e3)中任一种DNA分子：
e1)如SEQ ID NO：5所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
e2)在严格条件下与e1)限定的DNA分子杂交且编码所述黄酮合酶II连接酶FSII的cDNA分子或基因组DNA分子；
e3)与e1)或e2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述黄酮合酶II连接酶FSII的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述黄酮-7-O-葡萄糖醛酸转移酶编码基因F7GAT为如下f1)-f3)中任一种DNA分子：
f1)如SEQ ID NO：6所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
f2)在严格条件下与e1)限定的DNA分子杂交且编码所述黄酮-7-O-葡萄糖醛酸转移酶F7GAT的cDNA分子或基因组DNA分子；
f3)与f1)或f2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述黄酮-7-O-葡萄糖醛酸转移酶F7GAT的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因UDPGDH为如下g1)-g3)中任一种DNA分子：
g1)如SEQ ID NO：7所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
g2)在严格条件下与g1)限定的DNA分子杂交且编码所述UDP-葡萄糖脱氢酶UDPGDH的cDNA分子或基因组DNA分子；
g3)与g1)或g2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述UDP-葡萄糖脱氢酶UDPGDH的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述黄酮-6-羟化酶编码基因CYP82D4为如下h1)-h3)中任一种DNA分子：
h1)如SEQ ID NO：8所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
h2)在严格条件下与h1)限定的DNA分子杂交且编码所述黄酮-6-羟化酶CYP82D4的cDNA分子或基因组DNA分子；
h3)与h1)或h2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述黄酮-6-羟化酶CYP82D4的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述细胞色素P450还原酶编码基因ATR2为如下g1)-g3)中任一种DNA分子：
g1)如SEQ ID NO：9所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
g2)在严格条件下与h1)限定的DNA分子杂交且编码所述细胞色素P450还原酶ATR2的cDNA分子或基因组DNA分子；
g3)与h1)或h2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述细胞色素P450还原酶ATR2的cDNA分子或基因组DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述优化的灯盏乙素通路基因表达盒利用CRISPR/Cas9系统通过基因敲入的方法整合到解脂耶氏酵母基因组中。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述解脂耶氏酵母出发菌株为Yarrowia lipolytica W29Δku70，其KU70位点整合Cas9蛋白。
5.权利要求1-4任一项所述的构建方法构建得到的解脂耶氏酵母基因工程菌。
6.一种产灯盏乙素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将查尔酮合酶编码基因CHS和黄酮合酶II连接酶编码基因FSII表达盒整合到权利要求5所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，所述密码子优化的查尔酮合酶编码基因CHS的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述密码子优化的黄酮合酶II连接酶编码基因FSII的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
7.权利要求6所述的构建方法构建得到的解脂耶氏酵母基因工程菌。
8.一种产灯盏乙素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将黄酮-6-羟化酶编码基因CYP82D4和细胞色素P450还原酶编码基因ATR2表达盒整合到权利要求7所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，所述密码子优化的黄酮-6-羟化酶编码基因CYP82D4的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述密码子优化的细胞色素P450还原酶编码基因ATR2的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
9.权利要求8所述的构建方法构建得到的解脂耶氏酵母基因工程菌。
10.一种产灯盏乙素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将对香豆酰辅酶A连接酶编码基因4CL和黄酮合酶II连接酶编码基因FSII表达盒整合到权利要求9所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，所述密码子优化的对香豆酰辅酶A连接酶编码基因4CL的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述密码子优化的黄酮合酶II连接酶编码基因FSII的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
11.权利要求10所述的构建方法构建得到的解脂耶氏酵母基因工程菌。
12.权利要求5、7、9、11任一项所述的解脂耶氏酵母基因工程菌在生产灯盏乙素中的应用。
13.权利要求5、7、9、11任一项所述的解脂耶氏酵母基因工程菌在以葡萄糖为底物生产灯盏乙素中的应用。
14.权利要求5、7、9、11任一项所述的解脂耶氏酵母基因工程菌在以葡萄糖为底物生产灯盏乙素中降低副产物的应用。
15.一种生产灯盏乙素的方法，其特征在于，包括如下步骤：以葡萄糖为底物，将权利要求5、7、9、11任一项所述的解脂耶氏酵母基因工程菌在发酵培养基中培养发酵，获得灯盏乙素，所述发酵培养基的配方为20g/L葡萄糖、1.7g/L YNB、5g/L硫酸铵，余量为水。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述生产灯盏乙素的方法，包括如下步骤：
1)从甘油保种管中取出按照上述构建方法构建得到的工程菌菌液，在YPD固体平板上划线，培养48h，从平板中挑取一个单菌落到4mL补料分批发酵培养基中，在230rpm，30℃的条件下培养48小时，再转接到40mL的补料分批发酵培养基中，培养1天，获得种子液；
2)将步骤1)的种子液接种到1.3L的发酵罐中进行补料分批发酵，在整个发酵过程中，温度保持在30℃；通过自动添加10％的氨水将pH值维持在5.0，溶解氧(DO)被设定为40％，初始通气量被设定为0.5L/min；每6小时取样检测发酵罐中葡萄糖浓度，同时对样品的灯盏乙素，菌体的生物量进行检测；得到发酵产物；
所述YPD培养基的成分为：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，溶剂为去离子水；
所述补料分批发酵培养基的成分为：初始培养基400mL含有5g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁、40g/L葡萄糖，2mL微量金属盐溶液、2mL维生素溶液；
所述补料培养基1L：600g/L葡萄糖、25g/L硫酸铵、15g/L磷酸二氢钾、2.5g/L硫酸镁、10mL维生素溶液、10mL微量金属盐溶液。
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